一种具有抗氧化作用的亚麻籽源环肽提取物及其制备方法与应用

1.本发明涉及天然产物提取技术领域，具体涉及一种具有抗氧化作用的亚麻籽源环肽提取物及其制备方法和应用。


背景技术：

2.食源性多肽是从可食用动植物的蛋白质中获取，通常通过酶解或发酵等方式获得的一类功能性肽类化合物，一般由2-20个氨基酸残基组成。食源性多肽除了可以提供人体必需氨基酸外，还具有抗氧化、免疫调节、降血压、降血糖、抗血栓、抗菌、抗病毒等多种生物活性，根据不同的功能可分为免疫活性肽、抗氧化肽、降血压肽、抗菌肽、抗癌肽等。作为天然的功能因子，生物活性肽因其来源丰富、安全性高、易于吸收等优点，在功能性食品和药物的应用方面十分具有前景。其中食源性抗氧化肽可以通过清除自由基、螯合促氧化金属离子、脂质抗氧化、细胞保护等达到抗氧化效果，现已广泛用作膳食补充剂或用于功能性食品。从天然植物中挖掘具有抗氧化活性的肽是研究学者和产业界的重点关注。
3.现有报道食源性活性肽多为线性肽，虽然许多线性肽在体外具有良好的生物活性，但线性肽进入体内经由机体胃肠道消化后很快发生降解，活性无法保证。而环状肽具有特殊的环状结构，特点是由n-和c-相连接，因此环状肽中不存在游离的氨端和羧端，这使得环状肽对一些酶的敏感性大大降低，提高了环状肽的稳定性和生物利用度。
4.亚麻籽(linum usitatissimum l.)又称胡麻籽，在其中存在着一类天然的疏水环状肽，亚麻籽环肽(linusorbs，los)，是由8～9个氨基酸环化而成的环肽，分子量大约为960～1100da，是亚麻籽所特有的脂质伴随物，且目前并未在其他高等植物中发现。亚麻籽环肽结构较为独特，其共价封闭结构可抵抗蛋白酶消化。从结构上看，亚麻籽环肽的环状结构及疏水性质，使其在细胞膜之间的运输、组织和器官之间的分散起到重要的作用。亚麻籽环肽除了免疫调节、抗炎抗癌、抗骨质疏松外，还具有广谱、高效的抗菌活性，抗氧化等作用。
5.不同于其他种类的多肽往往需要经水解才能得到，化学组成难以保证，亚麻籽源环肽可以直接提取获得。与亚麻籽源环肽相关的提取研究中，有人通过丙酮提取磨碎的亚麻籽，然后混合物溶于甲醇，用10％的氢氧化钾水解，最后用乙酸乙酯萃取含有肽的部分，得到了两种新的环肽clf和clg。有人将亚麻籽冷榨获得亚麻籽油，然后将其溶于庚烷，用甲醇/水(6/4；v/v)提取，通过感官鉴定将亚麻籽油中呈苦味的部分分离出来，然后用硅胶进行分离，接着用制备型hplc纯化了馏分中更强烈的苦味物质，经鉴定为环肽cle，也将其称为苦味肽。有人将含老化亚麻籽油的二氧化硅与正己烷混合后用不同级分的洗脱剂洗脱，得到了环肽clj和clk，但是纯度不明。
6.在以上研究中，对亚麻籽源环肽的提取方法都较为复杂，而且主要成分尚待明确，且其抗氧化能力尚不清楚。


技术实现要素：

7.为了克服现有技术中提取方法复杂、主要成分需明确、抗氧化能力不明确的缺陷，本发明提供了一种具有抗氧化作用的亚麻籽源环肽提取物及其制备方法与应用。
8.本发明通过以下技术方案实现：第一方面，本发明首先提供了一种具有抗氧化作用的亚麻籽源环肽提取物，其所包含有氨基酸序列如seq id no.1～10所示的肽段。
9.本发明通过一系列实验步骤提取到1kda左右的亚麻籽源环肽提取物，通过鉴定分析得出了里面的10条肽段，其相对分子质量依次为：1040.6532、1058.6095、961.5572、1066.5245、1074.605、1052.5081、977.5518、1048.569、1083.519、1082.5177，相对百分含量依次为：35.441％、32.273％、7.595％、5.964％、2.559％、1.91％、1.874％、1.532％、0.815％、0.636％。通过分析测定亚麻籽源环肽能够显著清除abts自由基和螯合亚铁离子，且呈剂量依赖关系，表明本发明制备的亚麻籽源环肽具有良好的抗氧化作用。
10.第二方面，本发明其次提供了一种具有抗氧化作用的亚麻籽源环肽提取物的制备方法，包括以下步骤：s1：制取亚麻籽粉，将其通过非极性溶剂进行浸提，得到亚麻籽油；s2：将制得的亚麻籽油加入极性溶剂进行提取，离心分离上下层液体，收集极性溶剂层；s3：将收集到的极性溶剂层过滤，浓缩至干，干燥，得到亚麻籽环肽。
11.在步骤s1中，具体实验操作和条件可优化为：亚麻籽粉碎后过60-90目筛，置于45℃干燥箱干燥36h，得到干燥亚麻籽粉。取亚麻籽粉加入正己烷按照料液比1:8-14(g/ml)混匀，在30℃下浸提，搅拌2h，离心收集上清液(4000r/min，15min)。将上清液40℃真空浓缩至干，回收正己烷，残渣重复提取，得到亚麻籽油。
11.作为优选，所述料液比选择1：14(g/ml)。
12.加入非极性溶剂的目的在于提取亚麻籽油，其加入量的选择是为了充分溶出亚麻籽油同时有利于后续浓缩，并且非极性溶剂不与甲醇水溶液互溶，更有利于去除杂质。
13.在步骤s2中，具体实验操作和条件可优化为：取亚麻籽油，加入40％～60％甲醇水溶液按照料液比1:2(g/ml)进行提取，磁力搅拌20min，离心收集上清液(4000r/min，10min)，下层液体重复提取三次，将上清液合并。
14.作为优选，所述提取亚麻籽源环肽步骤中，所述甲醇水溶液为60％。
15.环肽易溶解于极性溶剂，使用极性溶剂提取亚麻籽油中富集的亚麻籽环肽，使用乙醇进行提取会提取到油脂，且杂志较多，而选择适当浓度的甲醇水溶液以及适当的搅拌时间，既可以使亚麻籽环肽得到充分提取，同时少溶出杂质，具有更好的提取效果。
16.在步骤s3中，具体实验操作和条件可优化为：取富集的上清液，采用中速定性滤纸过滤后，45℃真空浓缩，干燥得到亚麻籽源环肽。
17.作为优选，所述步骤s3中的干燥过程采用冷冻干燥。
18.采用冷冻干燥的方式，不会破坏所提取到的亚麻籽源环肽的活性，可以很好的保留亚麻籽源环肽的活性及其结构的完整性。
19.第三方面，本发明还提供了一种具有抗氧化作用的亚麻籽源环肽提取物在螯合亚铁离子中的应用。
20.第四方面，本发明还提供了一种具有抗氧化作用的亚麻籽源环肽提取物应用于体外清除abts自由基中的应用。
21.通过分析测定亚麻籽源环肽对abts自由基、亚铁离子螯合能力的影响，发现亚麻籽源环肽能显著清除abts自由基和螯合亚铁离子，说明所提取到的亚麻籽源环肽具有抗氧化作用，能够起到阻碍机体氧化的作用。
22.本发明具有以下有益效果：(1)采用溶剂提取法制备亚麻籽源环肽，制备工艺简单，所得环肽纯度较高，主要成分明确，较好的保持了亚麻籽源环肽的抗氧化性；(2)制备过程未涉及大型仪器设备，操作简便；(3)分析测定提取得到的亚麻籽源环肽，发现所提取到的亚麻籽源环肽能够显著螯合亚铁离子，清除abts自由基，说明所提取到的亚麻籽源环肽具有抗氧化作用，能作为天然抗氧化功能因子应用于膳食添加剂和功能性食品当中，具有广泛的应用前景。
附图说明
23.图1是亚麻籽源环肽lc-ms鉴定图。
24.图2是不同浓度的亚麻籽源环肽对abts自由基清除率的影响图。
25.图3是不同浓度的亚麻籽源环肽对亚铁离子螯合能力的影响图。
具体实施方式
26.下面结合说明书附图以及具体实施例对本发明做进一步描述。本领域普通技术人员在基于这些说明的情况下将能够实现本发明。此外，下述说明中涉及到的本发明的实施例通常仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。因此，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
27.实施例1：一种具有抗氧化作用的亚麻籽源环肽提取物的制备。
28.一种具有抗氧化作用的亚麻籽源环肽提取物，通过以下方法制备得到：(1)提取亚麻籽油：亚麻籽粉碎后过60-90目筛，置于45℃干燥箱干燥36h，得到干燥亚麻籽粉。取亚麻籽粉加入正己烷按照料液比1:14(g/ml)混匀，在30℃下浸提，电动搅拌2h，离心收集上清液(4000r/min，15min)。将上清液40℃真空浓缩至干，回收正己烷，残渣重复提取，得到亚麻籽油；(2)提取亚麻籽源环肽：取亚麻籽油，加入60％甲醇水溶液按照料液比1:2(g/ml)进行提取，磁力搅拌20min，离心收集上清液(4000r/min，10min)，下层液体重复提取三次，将上清液合并；(3)浓缩：取富集的上清液，采用中速定性滤纸过滤后，45℃真空浓缩，冷冻干燥得到亚麻籽源环肽。
29.采用高效液相色谱测定亚麻籽源环肽的纯度为90.72％。
30.实施例2：一种具有抗氧化作用的亚麻籽源环肽提取物的制备。
31.一种具有抗氧化作用的亚麻籽源环肽提取物，通过以下方法制备得到：(1)提取亚麻籽油：亚麻籽粉碎后过60-90目筛，置于45℃干燥箱干燥36h，得到干
燥亚麻籽粉。取亚麻籽粉加入正己烷按照料液比1:10(g/ml)混匀，在30℃下浸提，电动搅拌2h，离心收集上清液(4000r/min，15min)。将上清液40℃真空浓缩至干，回收正己烷，残渣重复提取，得到亚麻籽油；(2)提取亚麻籽源环肽：取亚麻籽油，加入50％甲醇水溶液按照料液比1:2(g/ml)进行提取，磁力搅拌20min，离心收集上清液(4000r/min，10min)，下层液体重复提取三次，将上清液合并；(3)浓缩：取富集的上清液，采用中速定性滤纸过滤后，45℃真空浓缩，冷冻干燥得到亚麻籽源环肽。
32.采用高效液相色谱测定亚麻籽源环肽的纯度为86.94％。
33.实施例3：一种具有抗氧化作用的亚麻籽源环肽提取物的制备。
34.一种具有抗氧化作用的亚麻籽源环肽提取物，通过以下方法制备得到：(1)提取亚麻籽油：亚麻籽粉碎后过60-90目筛，置于45℃干燥箱干燥36h，得到干燥亚麻籽粉。取亚麻籽粉加入正己烷按照料液比1:10(g/ml)混匀，在30℃下浸提，电动搅拌2h，离心收集上清液(4000r/min，15min)。将上清液40℃真空浓缩至干，回收正己烷，残渣重复提取，得到亚麻籽油；(2)提取亚麻籽源环肽：取亚麻籽油，加入95％乙醇水溶液按照料液比1:2(g/ml)进行提取，磁力搅拌20min，离心收集上清液(4000r/min，10min)，下层液体重复提取三次，将上清液合并；(3)浓缩：取富集的上清液，采用中速定性滤纸过滤后，45℃真空浓缩，冷冻干燥得到亚麻籽源环肽。
35.采用高效液相色谱测定亚麻籽源环肽的纯度为80.16％。
36.实施例4：一种具有抗氧化作用的亚麻籽源环肽提取物的制备。
37.一种具有抗氧化作用的亚麻籽源环肽提取物，通过以下方法制备得到：(1)提取亚麻籽油：亚麻籽粉碎后过60-90目筛，置于45℃干燥箱干燥36h，得到干燥亚麻籽粉。取亚麻籽粉加入正己烷按照料液比1:8(g/ml)混匀，在30℃下浸提，电动搅拌2h，离心收集上清液(4000r/min，15min)。将上清液40℃真空浓缩至干，回收正己烷，残渣重复提取，得到亚麻籽油；(2)提取亚麻籽源环肽：取亚麻籽油，加入40％甲醇水溶液按照料液比1:1(g/ml)进行提取，磁力搅拌20min，离心收集上清液(4000r/min，10min)，下层液体重复提取三次，将上清液合并；(3)浓缩：取富集的上清液，采用中速定性滤纸过滤后，45℃真空浓缩，冷冻干燥得到亚麻籽源环肽。
38.采用高效液相色谱测定亚麻籽源环肽的纯度为80.24％。
39.实施例5：一种具有抗氧化作用的亚麻籽源环肽提取物的制备。
40.一种具有抗氧化作用的亚麻籽源环肽提取物，通过以下方法制备得到：(1)提取亚麻籽油：亚麻籽粉碎后过60-90目筛，置于45℃干燥箱干燥36h，得到干燥亚麻籽粉。取亚麻籽粉加入正庚烷按照料液比1:8(g/ml)混匀，在30℃下浸提，电动搅拌2h，离心收集上清液(4000r/min，15min)。将上清液40℃真空浓缩至干，回收正己烷，残渣重复提取，得到亚麻籽油；
(2)提取亚麻籽源环肽：取亚麻籽油，加入40％甲醇水溶液按照料液比1:1(g/ml)进行提取，磁力搅拌20min，离心收集上清液(4000r/min，10min)，下层液体重复提取三次，将上清液合并；(3)浓缩：取富集的上清液，采用中速定性滤纸过滤后，45℃真空浓缩，冷冻干燥得到亚麻籽源环肽。
41.采用高效液相色谱测定亚麻籽源环肽的纯度为78.35％。
42.实施例6：一种具有抗氧化作用的亚麻籽源环肽提取物的制备。
43.一种具有抗氧化作用的亚麻籽源环肽提取物，通过以下方法制备得到：(1)提取亚麻籽油：亚麻籽粉碎后过60-90目筛，置于45℃干燥箱干燥36h，得到干燥亚麻籽粉。取亚麻籽粉加入石油醚按照料液比1:8(g/ml)混匀，在30℃下浸提，电动搅拌2h，离心收集上清液(4000r/min，15min)。将上清液40℃真空浓缩至干，回收正己烷，残渣重复提取，得到亚麻籽油；(2)提取亚麻籽源环肽：取亚麻籽油，加入40％甲醇水溶液按照料液比1:1(g/ml)进行提取，磁力搅拌20min，离心收集上清液(4000r/min，10min)，下层液体重复提取三次，将上清液合并；(3)浓缩：取富集的上清液，采用中速定性滤纸过滤后，45℃真空浓缩，冷冻干燥得到亚麻籽源环肽。
44.采用高效液相色谱测定亚麻籽源环肽的纯度为77.37％。
45.实施例7：亚麻籽源环肽的肽段组成及结构的鉴定。
46.采用lc-ms/ms技术，鉴定亚麻籽源环肽的肽段组成及结构。将质谱信息与文献进行对比，得到肽段的序列和分子量，如下表所示。
47.亚麻籽源环肽组成分析：
48.实施例8：亚麻籽源环肽对abts自由基的清除能力。
49.其过程为：称取38.41mg的abts，用水定容至10ml，配制成7mmol/l的abts母液；称取6.63mg的过硫酸钾，用水定容至10ml，配制成2.45mmol/l过硫酸钾溶液。将以上两种溶液以1∶1混合，室温放置16h后，用甲醇稀释溶液至吸光度为0.7
±
0.02，即为abts测定溶液。向96孔板中加入abts测定溶液，分别与浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/ml的亚麻籽源环肽溶液样品等体积混合，以样品溶剂甲醇替换样品作为空白组，室温下避光反应10min，于734nm波长下测定吸光度。
50.具体试剂添加量如下： a1a0abts测定溶液100μl100μl亚麻籽源环肽-甲醇溶液100μl 甲醇 100μl结果计算如下公式所示：式中，a0为abts测定溶液+甲醇溶液(空白对照吸光度)，a1为abts测定溶液+环肽样品溶液(样品吸光度)。
51.检测结果如图2所示：亚麻籽源环肽对abts自由基具有显著清除作用，呈剂量依赖关系，当样品浓度为1mg/ml时，abts自由基清除率为60.39％。
52.实施例9：亚麻籽源环肽对亚铁离子的螯合能力。
53.其过程为：取2.54mg的fecl2，用水定容至10ml，配制成2mmol/l的fecl2溶液；取12.31mg的ferrozine，用水定容至5ml，配制成5mmol/l的ferrozine溶液。取500μl的亚麻籽源环肽样品溶液，与25μl的fecl2溶液混合，室温下静置30min，再加入25μl的ferrozine溶液，将上述混合液剧烈震荡均匀，室温下静置10min，以样品溶剂甲醇替换样品作为空白组，于562nm波长下测定吸光度。
54.具体试剂添加量如下：
结果计算如下公式所示：式中，a1为加入亚麻籽源环肽溶液的吸光度(样品吸光度)，a0为加入甲醇的吸光度(空白吸光度)。
55.检测结果如图3所示：亚麻籽源环肽对亚铁离子具有显著螯合作用，呈剂量依赖关系，当样品浓度为1mg/ml时，亚铁离子螯合率为68.83％。
56.综上所述：通过溶剂提取法制备得到亚麻籽源环肽，提取率和纯度高，可显著清除abts自由基和螯合亚铁离子，具有良好的抗氧化能力，可为亚麻籽源环肽提取物在脂质的抗氧化中提供应用。

技术特征：
1.一种具有抗氧化作用的亚麻籽源环肽提取物，其特征在于：所述环肽提取物中包含有氨基酸序列如seq id no.1~10所示的肽段。2.根据权利要求1所述的一种具有抗氧化作用的亚麻籽源环肽提取物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：s1：制取亚麻籽粉，将其通过非极性溶剂进行浸提，得到亚麻籽油；s2：将制得的亚麻籽油加入极性溶剂进行提取，离心分离上下层液体，收集极性溶剂层；s3：将收集到的极性溶剂层过滤，浓缩，干燥，得到亚麻籽环肽。3.根据权利要求2所述的一种具有抗氧化作用的亚麻籽源环肽提取物的制备方法，其特征在于，步骤s1中所述的浸提过程中，取亚麻籽粉与非极性溶剂按照料液比1: 8~14（g/ml）混合。4.根据权利要求2所述的一种具有抗氧化作用的亚麻籽源环肽提取物的制备方法，其特征在于，步骤s1中所述的浸提过程中，非极性溶剂选择正己烷、正庚烷、石油醚中的至少一种。5.根据权利要求2所述的一种具有抗氧化作用的亚麻籽源环肽提取物的制备方法，其特征在于：步骤s2中，进行提取的极性溶剂选择甲醇、乙醇中的至少一种。6.根据权利要求5所述的一种具有抗氧化作用的亚麻籽源环肽提取物的制备方法，其特征在于：使用40%~60%甲醇水溶液进行提取。7.根据权利要求2所述的一种具有抗氧化作用的亚麻籽源环肽提取物的制备方法，其特征在于：步骤s2中，对每次提取得到的亚麻籽油层进行二次提取，重复三次，将得到的极性溶剂层合并。8.根据权利要求2所述的一种具有抗氧化作用的亚麻籽源环肽提取物的制备方法，其特征在于：步骤s3中所述的干燥过程采用冷冻干燥。9.根据权利要求2所述的一种具有抗氧化作用的亚麻籽源环肽提取物的制备方法，其特征在于：步骤s3中，制得的亚麻籽环肽的分子量为960da~1100da。10.根据权利要求1所述的一种具有抗氧化作用的亚麻籽源环肽提取物在体外清除abts自由基、螯合亚铁离子中的应用。

技术总结
一种具有抗氧化作用的亚麻籽源环肽提取物及其制备方法和应用。该亚麻籽环肽提取物中包含有氨基酸序列如SEQ ID NO.1~10所示的肽段，采用溶剂提取法制得，分子量大小为1 kDa左右。通过对亚麻籽源环肽抗氧化能力的测定，发现亚麻籽源环肽能够显著清除ABTS自由基和螯合亚铁离子，具有较好的抗氧化能力。本发明制得的亚麻籽源环肽提取物纯度高，制备工艺简单，主要成分明确，抗氧化效果好，作为天然抗氧化功能因子可广泛用作膳食添加剂和应用于功能性食品中。能性食品中。能性食品中。


技术研发人员：邹仙果 关晓倩 能静 曹宇钦 杨开 郑淼 蔡铭
受保护的技术使用者：浙江工业大学
技术研发日：2022.12.29
技术公布日：2023/8/24