一株高效抑制霉菌生长的德氏乳杆菌乳亚种及其培养方法和应用与流程

1.本技术涉及微生物领域，更具体地说，它涉及一株高效抑制霉菌生长的德氏乳杆菌乳亚种及其培养方法和应用。


背景技术：

2.食品腐败微生物是引起食品发生化学或物理性质变化，从而使食品失去原有的营养价值、组织性状及色、香、味，成为不符合食品卫生要求的微生物。植物性和动物性食品原料在收获、运输、加工和贮藏过程中，也会受到微生物的污染。食品受到霉菌污染后，表现为食品表面长出菌丝体，气味异常，失去原有的色香味，导致食品软化和腐烂，失去食用价值，甚至会产生霉菌毒素，对人体健康危害极大。
3.乳酸杆菌及其代谢物能够对腐败菌、致病菌的繁殖起到抑制作用，因此食品经过合适的乳酸杆菌发酵后，可以提高食品的抑菌效果，进而延长食品的保质期。同时，乳酸杆菌还可以提高蛋白质、乳糖和钙等营养物质的消化吸收，产生多种维生素和有机酸，有利于提高食品的风味、营养和安全性等。
4.德氏乳杆菌乳亚种是卫生部《可用于食品的菌种名单》中记载的乳杆菌属细菌，可用于食品生产加工。但是，德氏乳杆菌在发酵食品中对霉菌的抑制效果仍有较大的提升空间，因此发明人针对如何提高德氏乳杆菌乳亚种抑制霉菌的活性进行研究。


技术实现要素：

5.为了提高德氏乳杆菌乳亚种抑制霉菌的活性，本技术提供一株高效抑制霉菌生长的德氏乳杆菌乳亚种及其培养方法和应用。
6.第一方面，本技术提供一株高效抑制霉菌生长的德氏乳杆菌乳亚种，采用如下的技术方案：一株高效抑制霉菌生长的德氏乳杆菌（lactobacillus delbrueckii）乳亚种ab0301，已于2022年6月13日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc 25069。
7.通过采用上述技术方案，德氏乳杆菌乳亚种ab0301对霉菌生长具有较佳的抑制作用。
8.优选的，所述德氏乳杆菌乳亚种ab0301的16s rdna全序列如 seq id no:1所示。
9.通过采用上述技术方案，能够确认菌株为德氏乳杆菌乳亚种。
10.第二方面，本技术提供一种高效抑制霉菌生长的德氏乳杆菌乳亚种ab0301的培养方法，采用如下的技术方案：一种高效抑制霉菌生长的德氏乳杆菌乳亚种ab0301的培养方法，包括如下培养步骤：s1分离：在发酵乳制品中进行筛选，得到德氏乳杆菌乳亚种；
s2纯化：将s1分离得到的德氏乳杆菌乳亚种接种于培养基平板上，得到菌种；s3活化：将s2纯化得到的菌种在36-45℃厌氧条件下培养20-28h，得到初步活化菌种；s4富集：在s3活化得到的初步活化菌种中挑取合适的2-4个单菌落并转移至增菌培养基中，在36-45℃厌氧条件下培养46-50h，得到活化的德氏乳杆菌乳亚种。
11.通过采用上述技术方案，能够分离筛选得到德氏乳杆菌乳亚种ab0301，并将德氏乳杆菌乳亚种ab0301纯化、活化与富集。
12.优选的，所述s1分离中的发酵乳制品为中国四川阿坝藏族自治州地区的传统牦牛奶发酵酸乳。
13.通过采用上述技术方案，菌种来源于传统发酵食品，具有较强的抗菌活性，并能够用于食品工业生产加工。
14.优选的，所述s2纯化中的培养基平板为mrs培养基平板。
15.通过采用上述技术方案，mrs培养基平板为乳酸菌培养基，使用mrs培养基平板对德氏乳杆菌乳亚种进行培养，便于对目标菌种筛选，排除无用杂菌造成干扰的可能性，并且有利于选取长势较佳的菌种。
16.优选的，所述s2纯化中的接种方法为平板划线法，划线次数为2-4次。
17.通过采用上述技术方案，多次划线对菌株进行纯化。
18.优选的，所述s4富集中的增菌培养基为mrs肉汤。
19.通过采用上述技术方案，mrs肉汤是用于食品乳酸菌选择性增菌培养的常见增菌培养基，有助于德氏乳杆菌乳亚种的富集与进一步活化。
20.第三方面，本技术提供一种高效抑制霉菌生长的德氏乳杆菌乳亚种ab0301的应用，采用如下的技术方案：一种高效抑制霉菌生长的德氏乳杆菌乳亚种ab0301的应用，所述德氏乳杆菌乳亚种应用于发酵食品中。
21.通过采用上述技术方案，由于添加了能够高效抑制霉菌生长的德氏乳杆菌乳亚种ab0301，因此提高了发酵食品的抑菌性，从而能够减少防腐剂添加量并延长食品的保质期。
22.综上所述，本技术具有以下有益效果：1、经分离、纯化、活化以及富集培养得到的德氏乳杆菌乳亚种ab0301，具有高效抑制霉菌生长的作用；2、德氏乳杆菌乳亚种ab0301应用于发酵食品中，能够增强对霉菌的抑制效果，进而减少防腐剂添加量并延长食品保质期；3、德氏乳杆菌乳亚种ab0301应用于微生物制剂中，能够提供一种具有高效抑菌效果的微生物制剂。
附图说明
23.图1是不同乳酸杆菌发酵液对黑曲霉的抑菌实验结果图。
24.图2是不同乳酸杆菌发酵液对黄曲霉的抑菌实验结果图。
25.图3是不同乳酸杆菌发酵液对米根霉的抑菌实验结果图。
26.图4是德氏乳杆菌乳亚种ab0301的双层平板抑菌实验结果图。
具体实施方式
27.以下结合附图和实施例对本技术作进一步详细说明。
28.实施例所述的德氏乳杆菌（lactobacillus delbrueckii）乳亚种ab0301，已经于2022年6月13日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc 25069。地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
29.本技术中，mrs培养基、mrs肉汤以及 pda培养基，均采购自北京路桥技术股份有限公司；黑曲霉（aspergillus niger）、黄曲霉（aspergillus flavus）、米根霉（rhizopus oryzae）、匍枝根霉（rhizopus stolonifer）以及扩展青霉（penicillium expansum）均购自中国普通微生物菌种保藏管理中心（cgmcc）。
实施例
30.实施例1 德氏乳杆菌乳亚种ab0301的筛选s1分离：在发酵乳制品中进行筛选，得到德氏乳杆菌乳亚种 ；s2纯化：将s1分离得到的德氏乳杆菌乳亚种平板划线3次接种于mrs培养基平板上，得到菌种；s3活化：将s2纯化得到的菌种在37℃厌氧条件下培养24h，得到初步活化菌种；s4富集：在s3活化得到的初步活化菌种中挑取合适的2-4个单菌落并转移至增菌培养基中，在37℃条件下培养48h，得到100ml活化的德氏乳杆菌乳亚种。
31.实施例2 德氏乳杆菌乳亚种ab0301的鉴定对得到的德氏乳杆菌乳亚种ab0301进行16s rdna基因序列测试，测试结果如下：tcctggctcaggacgaacgctggcggcgtgcctaatacatgcaagtcgagcgagctgaattcaaagattccttcggggtgatttgttggatgctagcggcggatgggtgagtaacacgtgggcaatctgccctaaagactgggataccacttggaaacaggtgctaataccggataacaacatgaatcgcatgattcaagtttgaaaggcggcgcaagctgtcactttaggatgagcccgcggcgcattagctagttggtggggtaaaggcctaccaaggcaatgatgcgtagccgagttgagagactgatcggccacattgggactgagacacggcccaaactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccacaatggacgcaagtctgatggagcaacgccgcgtgagtgaagaaggtcttcggatcgtaaagctctgttgttggtgaagaaggatagaggcagtaactggtctttatttgacggtaatcaaccagaaagtcacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggatttattgggcgtaaagcgagcgcaggcggaatgataagtctgatgtgaaagcccacggctcaaccgtggaactgcatcggaaactgtcattcttgagtgcagaagaggagagtggaactccatgtgtagcggtggaatgcgtagatatatggaagaacaccagtggcgaaggcggctctctggtctgcaactgacgctgaggctcgaaagcatgggtagcgaacaggattagataccctggtagtccatgccgtaaacgatgagcgctaggtgttggggactttccggtcctcagtgccgcagcaaacgcattaagcgctccgcctggggagtacgaccgcaaggttgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgac根据16s rdna的基因序列测试结果可以确定该菌株为德氏乳杆菌乳亚种。
32.实施例3 不同乳酸杆菌的24孔板抑菌实验霉菌孢子悬液制备：用接种针将黑曲霉、黄曲霉以及米根霉分别接种至pda平板上，在25℃条件下培养4天，用生理盐水将平板上的霉菌孢子洗下，用脱脂棉进行过滤得到三种霉菌孢子悬液，每种霉菌孢子悬液吸取200μl加入96孔板中，用酶标仪测定od600处的
吸光度，稀释至od值为0.15，置于冰箱备用。
33.发酵液制备：用无菌吸头吸取活化好的乳酸杆菌菌液，以1vol%的比例接种于mrs肉汤中，置于37℃恒温培养箱中培养48h制得发酵液。其中乳酸杆菌均筛选自中国四川阿坝藏族自治州地区收集的传统牦牛奶发酵酸乳。
34.24孔板抑菌实验：分别吸取1ml霉菌孢子悬液加入到含1ml乳酸菌发酵液及mrs液体的24孔板中，25℃培养48-72h，观察并记录抑菌圈大小，结果见图1-3以及表1。
35.表1 不同乳酸杆菌发酵液抑菌圈结果记录表从表1可以看出，德氏乳杆菌乳亚种对3种霉菌均具有较佳的抑制效果；嗜热链球菌以对黄曲霉与黑曲霉的抑制效果较佳，而对米根霉几乎没有抑制效果；德氏乳杆菌保加
利亚亚种对黑曲霉起较好的抑制作用，对黄曲霉起到一定的抑制作用，几乎不对米根霉起抑制作用。
36.实施例4 德氏乳杆菌乳亚种ab0301的96孔板抑菌实验霉菌孢子悬液制备：用接种针将黑曲霉、黄曲霉、米根霉、匍枝根霉以及扩展青霉五种霉菌分别接种至5个pda平板上，25℃培养4天，用生理盐水将平板上的霉菌孢子洗下，用脱脂棉进行过滤得到五种霉菌孢子悬液，每种孢子悬液吸取200μl加入96孔板中，用酶标仪测定od600处的吸光度，稀释至od值0.15，置于冰箱备用。
37.发酵液制备：用无菌吸头吸取活化好的德氏乳杆菌乳亚种ab0301，以1vol%的比例接种于mrs肉汤中，置于37℃恒温培养箱中培养48h制得发酵液。
38.上清液原液制备：发酵液在12000 rpm，4℃条件下，离心10min，用无菌注射器吸取上清液，以0.22μm滤膜过滤后获得待检测样品，用10ml干净无菌的小管分装样品，置于4℃冰箱保存。
39.ph6.5发酵上清液：取分装好的上清液原液，加入少量2mol/l naoh溶液，用ph计测量ph值，多次重复至ph为6.5-7.0，置于4℃冰箱保存。
40.96孔板抑菌实验：分别吸取100μl霉菌孢子悬液加入到含100μl上清液原液、ph6.5发酵上清液以及mrs液体的96孔板中，25℃培养48h，用酶标仪测定od600处的吸光度，含上清液原液与ph6.5发酵上清液的测定结果记为od
lab
，含mrs液体的测定结果记为od
control
。抑菌率%=100-(od
lab
×
100/od control
），计算结果见表2。
41.表2 德氏乳杆菌乳亚种ab0301发酵液抑菌率结果记录表从表2可以看出，德氏乳杆菌乳亚种的发酵上清液原液能够有效抑制米根霉、黑曲霉、黄曲霉、扩展青霉以及匍枝根霉5种霉菌，其中对米根霉、黑曲霉以及匍枝根霉的抑菌率高达90%以上；有机酸是德氏乳杆菌乳亚种的代谢产物之一，具有一定的广谱抑菌效果，但是在ph6.5时基本失去抑菌作用，而德氏乳杆菌乳亚种ph6.5发酵上清液仍然对5种霉菌具有一定的抑制效果，且对黑曲霉和匍枝根霉的抑菌率高达85%以上，表明德氏乳杆菌乳亚种ab0301的发酵液中存在非有机酸类的抑菌物质，因而具有高效抑制霉菌生长的效用。
42.实施例5德氏乳杆菌乳亚种ab0301的双层平板抑菌实验乳酸杆菌底层平板制备：用接种环在mrs平板上接种两条德氏乳杆菌乳亚种ab0301的菌液条带，晾干后，置于37℃培养箱培养48h；霉菌孢子悬液制备：用接种针将黑曲霉、黄曲霉、米根霉以及匍枝根霉四种霉菌分别接种至4个pda平板上，25℃培养4天；用生理盐水洗下霉菌平板上的霉菌孢子，用脱脂棉过滤得到4种霉菌孢子悬液；分别吸取200μl霉菌孢子悬液加入96孔板中，用酶标仪测定od600处的吸光度，并将od值稀释至0.15，置于冰箱备用。
43.霉菌孢子pda培养基制备：吸取上述备好的霉菌孢子悬液，以0.1vol%的比例加入到冷却至50℃以下尚未凝固的pda培养基中；双层平板抑菌实验：将含有霉菌孢子悬液的pda培养基倾倒在培养好的乳酸杆菌底层平板上层，凝固后，25℃培养48h，观察并拍照记录。结果见图4。
44.从图4可以看出，德氏乳杆菌乳亚种ab0301对四种霉菌均具有抑制效果，其中，对黑曲霉和黄曲霉的抑制效果最佳，对米根霉的抑制效果最差。
45.对比例1霉菌孢子悬液制备：用接种针将黑曲霉、黄曲霉以及米根霉分别接种至pda平板上，在25℃条件下培养4天，用生理盐水将平板上的霉菌孢子洗下，用脱脂棉进行过滤得到三种霉菌孢子悬液，每种霉菌孢子悬液吸取200μl加入96孔板中，用酶标仪测定od600处的吸光度，稀释至od值为0.15，置于冰箱备用。
46.发酵液制备：用无菌吸头吸取活化好的乳酸杆菌菌液，以1vol%的比例接种于mrs肉汤中，置于37℃恒温培养箱中培养48h制得发酵液。其中德氏乳杆菌乳亚种bio-03629购自中国微生物菌种查询网；德氏乳杆菌乳亚种ts379366以及德氏乳杆菌乳亚种ts301474购自宁波泰斯拓生物技术有限责任公司。
47.24孔板抑菌实验：分别吸取1ml霉菌孢子悬液加入到含1ml乳酸菌发酵液及mrs液体的24孔板中，25℃培养48-72h，观察并记录抑菌圈大小，结果见表3。
48.表3 不同德氏乳杆菌乳亚种发酵液抑菌圈结果记录表结合实施例3和对比例1，并结合表1与表3可以得到，不同德氏乳杆菌乳亚种对黑曲霉、黄曲霉以及米根霉三种霉菌均具有较好的抑制效果，综合德氏乳杆菌乳亚种对三种霉菌的抑制效果来看，德氏乳杆菌乳亚种ab0301的抑菌效果最佳。
49.应用例1
德氏乳杆菌乳亚种ab0301可应用于发酵食品中，得到的发酵食品能够对霉菌生长起到高效抑制作用。
50.应用例2德氏乳杆菌乳亚种ab0301可应用于微生物制剂中，得到的微生物制剂能够对霉菌生长起到高效抑制作用。
51.本具体实施例仅仅是对本技术的解释，其并不是对本技术的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本技术的权利要求范围内都受到专利法的保护。

技术特征：
1.一株高效抑制霉菌生长的德氏乳杆菌（lactobacillus delbrueckii）乳亚种ab0301，其特征在于，已于2022年6月13日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc 25069。2.根据权利要求1所述的一株高效抑制霉菌生长的德氏乳杆菌乳亚种ab0301，其特征在于：所述德氏乳杆菌乳亚种ab0301的16s rdna全序列如 seq id no:1所示。3.一种权利要求1或2任一所述的高效抑制霉菌生长的德氏乳杆菌乳亚种ab0301的培养方法，其特征在于，包括如下培养步骤：s1分离：在发酵乳制品中进行筛选，得到德氏乳杆菌乳亚种；s2纯化：将s1分离得到的德氏乳杆菌乳亚种接种于培养基平板上，得到菌种；s3活化：将s2纯化得到的菌种在36-45℃厌氧条件下培养20-28h，得到初步活化菌种；s4富集：在s3活化得到的初步活化菌种中挑取合适的2-4个单菌落并转移至增菌培养基中，在36-45℃厌氧条件下培养45-50h，得到活化的德氏乳杆菌乳亚种。4.根据权利要求3所述的一种高效抑制霉菌生长的德氏乳杆菌乳亚种ab0301的培养方法，其特征在于：所述s1分离中的发酵乳制品为中国四川阿坝藏族自治州地区的传统牦牛奶发酵酸乳。5.根据权利要求3所述的一种高效抑制霉菌生长的德氏乳杆菌乳亚种ab0301的培养方法，其特征在于：所述s2纯化中的培养基平板为mrs培养基平板。6.根据权利要求3所述的一种高效抑制霉菌生长的德氏乳杆菌乳亚种ab0301的培养方法，其特征在于：所述s2纯化中的接种方法为平板划线法，划线次数为2-4次。7.根据权利要求3所述的一种高效抑制霉菌生长的德氏乳杆菌乳亚种ab0301的培养方法，其特征在于：所述s4富集中的增菌培养基为mrs肉汤。8.一种权利要求1或2任一所述的高效抑制霉菌生长的德氏乳杆菌乳亚种ab0301的应用，其特征在于，所述德氏乳杆菌乳亚种应用于发酵食品中。9.一种权利要求1或2任一所述的高效抑制霉菌生长的德氏乳杆菌乳亚种ab0301的应用，其特征在于，所述德氏乳杆菌乳亚种应用于微生物制剂中。

技术总结
本申请涉及微生物领域，具体公开了一株高效抑制霉菌生长的德氏乳杆菌乳亚种及其培养方法和应用。一种高效抑制霉菌生长的德氏乳杆菌乳亚种AB0301，已于2022年6月13日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC 25069；其培养方法为：S1分离、S2纯化、S3活化以及S4富集。本申请的德氏乳杆菌乳亚种AB0301可用于发酵食品以及微生物制剂中，其具有高效抑制霉菌生长的优点。其具有高效抑制霉菌生长的优点。其具有高效抑制霉菌生长的优点。


技术研发人员：洪环 鄢明辉 杨欢东 陈波
受保护的技术使用者：浙江一鸣食品股份有限公司
技术研发日：2022.10.24
技术公布日：2023/8/24