一种甘蓝型油菜低温雄性不育位点的分子标记及其引物对和应用

1.本发明涉及植物育种领域，具体涉及一种甘蓝型油菜低温雄性不育位点的分子标记及其引物对和应用


背景技术：

2.油菜是主要油料作物之一，杂种优势利用对油菜产业的发展具有重要的推动作用。很好的利用作物的杂种优势可以明显提高作物的产量，改善作物品质，有效提升育种效率，缓解作物品质、产量、抗性间的矛盾。杂交油菜应用的大范围推广，对于促进油菜产业未来良好发展具有重要作用。
3.生态型雄性不育是油菜杂种优势利用的重要授粉控制系统之一。生态型雄性不育系以此独特的优势受到植物育种者的亲睐与重视。其中，温敏型雄性不育系指生态型雄性不育系材料的育性以受温度影响为主而光照长度对其影响不大，可分为高温不育类型和低温不育类型。生态型雄性不育系一般表现为低温可育高温不育，也有一些低温不育、高温可育的雄性不育系，即反型温敏不育型。如雄性不育系533s在日均温低于23℃时表现不育，日均温26℃时表现可育，为低温不育、高温可育类型。huiyou50s低温不育、高温可育，其育性转换的临近温度为昼22℃/夜12℃。
4.为了更好的利用杂种优势，有必要对植物低温雄性不育系不育基因进行基因定位、基因克隆及功能研究，明确其败育机理。油菜低温雄性不育系材料甚少，对于调控油菜低温雄性不育性状的分子基础还鲜有报道。需要继续开发控制油菜低温雄性不育性状的新位点及其分子标记，为油菜杂种优势利用提供基础。开发油菜低温雄性不育新位点的紧密连锁分子标记，可以在油菜苗期筛选低温雄性不育基因型，提高选择效率，还可以在分离世代提高选择的准确性。因此，油菜低温雄性不育位点的紧密连锁的分子标记开发和应用是油菜杂种优势利用的关键技术。


技术实现要素：

5.发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明一种甘蓝型油菜低温雄性不育位点的分子标记，其可以有效快速，在油菜苗期筛选出低温雄性不育材料，区分可育材料，提高选择效率，还可以在分离世代提高选择的准确性。另外，可以减少在开花期剔除可育、不育制种的工作量；丰富现有技术中油菜低温雄性不育系的种质资源，提供与油菜低温雄性不育性状共分离的分子标记。
6.本发明还提供位于甘蓝型油菜a07染色体上控制油菜低温雄性不育性状的新位点。
7.本发明的另一目的是提供甘蓝型油菜低温雄性不育性状新基因位点的分子标记bnindel12、bnindel18、bnindel20和bnindel23引物对。
8.本发明的又一个目的是提供甘蓝型油菜低温雄性不育位点的分子标记
bnindel12、bnindel18、bnindel20和bnindel23或其引物对在检测所述的低温雄性不育油菜及选育油菜低温雄性不育系中的应用。
9.技术方案：为了实现上述目的，本发明所述一种甘蓝型油菜低温雄性不育位点的分子标记，所述分子标记包括bnindel12、bnindel18、bnindel20和bnindel23中的任意一种或者多种，其序列分别如seq id no.1-4所示。
10.其中，所述的分子标记分别是与油菜低温雄性不育位点bnlts1共分离的bnindel12、bnindel18、bnindel20和bnindel23。所述分子标记bnindel12、bnindel18、bnindel20和bnindel23位于甘蓝型油菜a07染色体上，紧密连锁标记bnindel12位于甘蓝型油菜a07染色体上27623091bp-27623316bp，其序列如seq id no.1所示；紧密连锁标记bnindel18位于甘蓝型油菜a07染色体上27959625bp-27959830bp，其序列如seq id no.2所示；紧密连锁标记bnindel20位于甘蓝型油菜a07染色体上28045463bp-28045664bp，其序列如seq id no.3所示；紧密连锁标记bnindel23位于甘蓝型油菜a07染色体上28128007bp-28128207bp，其序列如seq id no.4所示。
11.本发明用于扩增和检测所述的甘蓝型油菜低温雄性不育位点的分子标记的引物对，所述引物对包括seq indel12-f和seq indel12-r、seq indel18-f和seq indel18-r、seq indel20-f和seq indel20-r、seq indel23-f和seq indel23-r中任意一对或者多对，其中：
12.seq indel12-f的序列如seq id no.5所示；
13.seq indel12-r的序列如seq id no.6所示；
14.seq indel18-f的序列如seq id no.7所示；
15.seq indel18-r的序列如seq id no.8所示；
16.seq indel20-f的序列如seq id no.9所示；
17.seq indel20-r的序列如seq id no.10所示；
18.seq indel23-f的序列如seq id no.11所示；
19.seq indel23-r的序列如seq id no.12所示。
20.其序列为：
21.seq indel12-f：cgataaacgattttgccatt(5
’‑3’
)
22.seq indel12-r：aaacagaggagccgaagg(5
’‑3’
)
23.seq indel18-f：aagaagtgaaggagtttt(5
’‑3’
)
24.seq indel18-r：aatctagggtttaagcag(5
’‑3’
)
25.seq indel20-f：ctcttttcctaattccat(5
’‑3’
)
26.seq indel20-r：aggataaacgtgtattct(5
’‑3’
)
27.seq indel23-f：taaagaatcgagtaaaagag(5
’‑3’
)
28.seq indel23-r：accattgatgatccaagt(5
’‑3’
)。
29.本发明所述控制甘蓝型油菜低温雄性不育位点为bnlst1，位于甘蓝型油菜a07染色体上bnaa07:27452837bp-28262531bp。由分子标记bnindel12、bnindel18、bnindel20和bnindel23与油菜低温雄性不育位点紧密连锁的分子标记bnindel06和bnindel24，将所述控制甘蓝型油菜低温雄性不育位点bnlst1，定位于甘蓝型油菜a07染色体上bna a07_27452837bp-28262531bp，位于分子标记bnindel06和bnindel24之间的809.41kb区间内；所
述分子标记bnindel06和bnindel24的序列分别如seq id no.13和16所示。本发明所述的甘蓝型油菜低温雄性不育位点的分子标记的筛选方法，包括如下步骤：
30.(1)甘蓝型油菜低温雄性不育位点的获得：利用低温雄性不育材料7613s与其姊妹系进行杂交，得到杂种f1，f1与低温雄性不育材料7613s进行回交，得到bc1群体，选择bc1群体中的30株低温雄性不育单株和30株低温可育单株，进行bsa测序分析。低温雄性不育位点被定位在a07：27432829bp-29445255bp区间内，共包含8496个snps和2459个indels；
31.(2)甘蓝型油菜矮杆位点紧密分子标记的获得：
32.利用bsa混合分组分析法将低温雄性不育位点定位在油菜a07染色体上的a07：27432829bp-29445255bp区间内，下载油菜参考基因组序列，在indel位点的上下游各增加150bp设计引物，采用primer premier 5.0软件在bnaa07：27432829bp-29445255bp区域内设计多个分子标记；
33.采用ctab法提取bc1群体油菜材料叶片的基因组dna，pcr反应体系(10ul)，其中含有0.5uldna模板、上、下游引物(1mmol/l)各0.25ul、5ulmix，和4ulddh2o。pcr反应程序：95℃变性5min；随后进行35个循环的95℃变性30s，tm值退火30s，72℃延伸30s；再经72℃延伸10min；最后4℃保存。pcr扩增产物用40％聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染显色，胶片在bio-rad visadoc3.0(bio-rad，usa)成像系统中扫描分析；
34.在设计的多个分子标记中，bnindel12、bnindel18、bnindel20和bnindel23分子标记与低温雄性不育性状共分离，利用上述的4个共分离分子标记和与油菜低温雄性不育位点紧密连锁的分子标记bnindel06和bnindel24，将所述控制甘蓝型油菜低温雄性不育位点命名为bnlst1，定位于甘蓝型油菜a07染色体上bna a07_27452837bp-28262531bp，位于分子标记bnindel06和bnindel24之间的809.41kb区间内。
35.本发明所述的甘蓝型油菜低温雄性不育位点的分子标记的应用，所述应用包括如下任意一种或者多种：
36.(1)在检测油菜低温雄性不育位点bnlts1中的应用；
37.(2)筛选或检测具有油菜低温雄性不育表型油菜中的应用；
38.(3)在鉴定油菜低温雄性不育性状中的应用；
39.(4)在低温雄性不育油菜制种中的应用。
40.进一步地，所述分子标记在含所述的甘蓝型油菜矮杆性状位点的品种和种质检测中的应用或者在选育低温雄性不育油菜品种和种质中的应用。
41.本发明所述的引物对的应用，所述应用包括如下任意一种或者多种：
42.(1)在检测油菜低温雄性不育位点bnlts1中的应用；
43.(2)筛选或检测具有油菜低温雄性不育表型油菜中的应用；
44.(3)在鉴定油菜低温雄性不育性状中的应用；
45.(4)在低温雄性不育油菜制种中的应用。
46.进一步地，所述引物组在含所述的甘蓝型油菜低温雄性不育性状位点的品系和种质检测中的应用或者在选育油菜低温雄性不育系中的应用。
47.本发明所述检测低温雄性不育油菜及选育油菜低温雄性不育系的试剂盒，所述试剂盒包括所述的引物对。
48.本发明所述检测低温雄性不育油菜及选育油菜低温雄性不育系方法，包括如下步
骤：
49.(1)提取待检测材料的dna；
50.(2)采用权利要求2所述的引物对对或权利要求9所述的试剂盒进行pcr扩增；
51.(3)当使用bnindel12标记引物进行扩增时，扩增出226bp的条带，说明被检测材料不具有低温雄性不育表型；未扩增出226bp的条带，说明被检测材料具有低温雄性不育表型；
52.当使用bnindel18标记引物进行扩增时，扩增出196bp的条带，说明被检测材料具有低温雄性不育表型；未扩增出196bp的条带，说明被检测材料不具有低温雄性不育表型；
53.当使用bnindel20标记引物进行扩增时，扩增出210bp的条带，说明被检测材料具有低温雄性不育表型；未扩增出210bp的条带，而扩增出202bp的条带，说明被检测材料不具有低温雄性不育表型；
54.当使用bnindel23标记引物进行扩增时，扩增出201bp的条带，说明被检测材料不具有低温雄性不育表型；bnindel23标记引物未扩增出201bp的条带，说明被检测材料具有低温雄性不育表型。
55.作为优选，利用所述的引物对扩增油菜基因组dna，扩增产物在40％聚丙烯酰胺凝胶电泳后，检测是否获得低温雄性不育材料7613s的扩增片段。
56.作为优选，采用所述的引物对扩增油菜基因组dna，扩增产物在40％聚丙烯酰胺凝胶电泳后，检测是否低温雄性不育材料7613s的扩增片段。
57.本发明筛选得到一个控制油菜低温雄性不育位点bnlts1，本发明通过图位克隆的方法，将bnlts1位点定位于甘蓝型油菜a07染色体上的bnindel06和bnindel24之间809.41kb区间内，并且本发明还发现该位点与分子标记bnindel12、bnindel18、bnindel20和bnindel23共分离。
58.本发明提供了一个分离的核苷酸片段，所述片段在油菜a07染色体上，其为位于分子标记bnindel06和bnindel24之间的809.41kb区间所对应的核苷酸片段。所述分离的核苷酸片段含有一个油菜低温雄性不育调控基因bnlst1。
59.本发明定位到一种油菜低温雄性不育基因bnlst1，该基因对应野生型基因bnlts1定位在油菜a07染色体上，位于分子标记bnindel06和bnindel24之间的809.41kb区间内。
60.本发明提供了一个全新的低温雄性不育位点及其分子标记。本发明提供了与所述分离的核苷酸片段或油菜低温雄性不育基因bnlts1共分离的分子标记，其为bnindel12、bnindel18、bnindel20和bnindel23。上述分子标记bnindel12、bnindel18、bnindel20和bnindel23与所述油菜低温雄性不育基因bnlts1共分离，以及分子标记bnindel12、bnindel18、bnindel20和bnindel23与油菜低温雄性不育性状共分离。
61.进一步地，所述共分离标记bnindel12由正向引物seq indel12-f和反向引物seq indel12-r扩增得到。使用共分离标记bnindel12的引物，在以低温可育材料基因组dna为模板时，能扩增出一条226bp的条带，在以低温雄性不育系基因组dna为模板时，未能扩增出一条226bp的条带。所述共分离标记bnindel18可由正向引物seq indel18-f和反向引物seq indel18-r共同扩增得到。使用共分离标记bnindel18的引物，在以低温雄性不育系基因组dna为模板时，能扩增出一条196bp的条带，在以低温可育材料基因组dna为模板时，未能扩增出一条196bp的条带。所述共分离标记bnindel20可由正向引物seq indel20-f和反向引
物seq indel20-r共同扩增得到。使用共分离标记bnindel20的引物，在以低温雄性不育系基因组dna为模板时，能扩增出一条210bp的条带，在以低温可育材料基因组dna为模板时，能扩增出一条202bp的条带。所述共分离标记bnindel23可由正向引物seq indel23-f和反向引物seq indel23-r共同扩增得到。使用共分离标记bnindel23的引物，在以低温雄性不育系基因组dna为模板时，未能扩增出一条201bp的条带，在以低温可育材料基因组dna为模板时，能扩增出一条201bp的条带。
62.基于本发明的发现，本发明提供了用于检测所述油菜低温雄性不育基因bnlts1的分子标记，其为以下任一分子标记：bnindel12、bnindel18、bnindel20和bnindel23。本发明提供了与油菜低温雄性不育性状相关的分子标记组合，含有分子标记：bnindel12、bnindel18、bnindel20和bnindel23。本发明提供了上述分子标记bnindel12、bnindel18、bnindel20和bnindel23在检测具有低温雄性不育表型油菜中的应用。进一步提供上述分子标记bnindel12、bnindel18、bnindel20和bnindel23在制备转基因植物、或作物改良育种、制种中的应用。
63.本发明还提供了所述分子标记在筛选油菜低温不育系中的应用。在低温雄性不育系与其它油菜品种或材料的杂交、回交或自交后代中，当使用bnindel12标记引物进行扩增时，如果未出现226bp的条带，说明被检测材料具有低温雄性不育表型；当使用bnindel18标记引物进行扩增时，如果出现196bp的条带，说明被检测材料具有低温雄性不育表型；当使用bnindel20标记引物进行扩增时，如果出现210bp的条带，说明被检测材料具有低温雄性不育表型；当使用bnindel23标记引物进行扩增时，如果bnindel23标记引物未扩增出201bp的条带，说明被检测材料具有低温雄性不育表型。
64.本发明将一个新的油菜低温核雄性不育基因bnlts1定位在一个809.41kb的染色体片段内，并与分子标记bnindel12、bnindel18、bnindel20和bnindel23共分离。bnindel12、bnindel18、bnindel20和bnindel23标记的开发可以高效准确的对低温雄性不育表型的油菜进行筛选，从而提高低温雄性不育系的选育效率。
65.本发明利用所述分子标记或引物对检测油菜低温雄性不育性状，利用本发明所述的引物对扩增油菜基因组dna，扩增产物聚丙烯酰胺凝胶电泳后，检测是否获得相应大小的扩增片段，根据扩增片段的大小准确的对低温雄性不育表型的油菜进行筛选。
66.本发明在国际上鉴定了一个位于甘蓝型油菜a07染色体上27452837bp-28262531bp区域内控制甘蓝型油菜低温雄性不育表型，同时发现与低温雄性不育位点共分离的分子标记bnindel12、bnindel18、bnindel20和bnindel23，这些分子标记在bc1群体的表现使其在甘蓝型油菜低温雄性不育表型育种中具有非常重要的价值。本发明发现与低温雄性不育位点共分离的分子标记bnindel12、bnindel18、bnindel20和bnindel23与甘蓝型油菜低温雄性不育表型呈极显著相关，上述四种分子标记的基因型与表型完全一致，无重组株，因此这四个分子标记在今后的油菜辅助选择育种中具有巨大的应用前景；本发明能够在甘蓝型油菜中找到低温雄性不育表型，对株型育种有很大帮助。有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：
67.为了更好的利用杂种优势，有必要对植物低温雄性不育系不育基因进行基因定位、基因克隆及功能研究，明确其败育机理。油菜低温雄性不育系材料甚少，对于调控油菜低温雄性不育性状的分子基础还鲜有报道。需要继续开发控制油菜低温雄性不育性状的新
位点及其分子标记，为油菜杂种优势利用提供基础。本发明开发油菜低温雄性不育新位点及其紧密连锁分子标记，可以在油菜苗期，有效快速的筛选低温雄性不育基因型，区分可育与不育材料，提高选择效率，还可以在分离世代提高选择的准确性。同时，在油菜开花期，还可以减少制种的人工选择成本(减少不育材料制种中剔除可育单株，可育材料制种中剔除不育材料的成本)。因此，本发明提供的油菜低温雄性不育位点及其紧密连锁的分子标记开发和应用是油菜杂种优势利用的关键技术。
附图说明
68.图1为bsa测序中δ(snp-index)值在各染色体上的分布。横向灰色线为阈值(对应p值为0.001)。
69.图2为分子标记bnindel12对bc1部分单株基因分型；其中1为低温雄性不育系扩增带型，2为低温雄性可育材料扩增带型，3、5、8、11和13为低温雄性不育系扩增带型，4、6、7、9、10、12和14为低温雄性可育材料扩增带型。
70.图3为分子标记bnindel18对bc1部分单株基因分型；其中2为低温雄性不育系扩增带型，1为低温雄性可育材料扩增带型，6、10、11、1和315为低温雄性不育系扩增带型，3-5、7-9、12和14为低温雄性可育材料扩增带型。
71.图4为分子标记bnindel20对bc1部分单株基因分型；其中2为低温雄性不育系扩增带型，1为低温雄性可育材料扩增带型，6、8、12和13为低温雄性不育系扩增带型3-5、7、9-11和14为低温雄性可育材料扩增带型。
72.图5为分子标记bnindel23对bc1部分单株基因分型；其中1为低温雄性不育系扩增带型，2为低温雄性可育材料扩增带型，6、8、10和13为低温雄性不育系扩增带型，3-5、7、9、11-12和14为低温雄性可育材料扩增带型。
73.图6为分子标记bnindel06对bc1部分单株基因分型；其中“#”号单株为重组株，m为marker。
74.图7为分子标记bnindel24对bc1部分单株基因分型；其中“#”号单株为重组株，m为marker。
75.图8为低温雄性不育位点bnlts1的图位克隆，a为低温雄性不育位点bnlts1的物理定位图谱，b为低温雄性不育位点bnlts1的遗传定位图谱。
具体实施方式
76.以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
77.下述实施例便于更好的理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。实施例中所用到的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到。
78.甘蓝型油菜低温雄性不育材料7613s及其姊妹系等材料均由南京农业大学提供。
79.实施例1
80.甘蓝型油菜低温雄性不育位点的获得
81.利用甘蓝型油菜低温雄性不育材料7613s与其姊妹系进行杂交，得到杂种f1，f1与低温雄性不育材料7613s进行回交，得到bc1群体。对bc1单株进行表型观察以及农艺性状调
查。选择bc1群体中的30株低温雄性不育单株和30株低温可育单株，提取叶片dna，将dna等量混匀在一起用于bsa的数据获取，构建低温可育池和低温不育池。样品检测合格无污染后(凝胶电泳和测od值，观察条带的完整性和蛋白和rna有无污染)，用超声破碎的方法将dna随机打断成350bp的片段，dna片段经末端修复、3'端加a、加测序接头、纯化、pcr扩增完成测序文库的构建。文库经质检合格后通过illumina hiseq进行测序，测序参数设为双端测序。从illunima hiseq测序平台得到原始图像数据文件，经过碱基识别分析转化为原始测序序列，即raw reads，结果以fastq文件格式存储。根据clean reads在参考基因组的定位结果，使用picard进行去重复、gatk进行局部重比对、碱基质量值校正等预处理，再使用gatk进行snp、small indel检测，过滤，并得到最终的snp、small indel位点集。使用qtlseqr(r package)软件计算了每个变异位点的δ(snp-index)值，并以2mb的滑动窗口考察了其在基因组上的分布情况。筛选得到一个低温雄性不育位点，根据bsa测序中全基因组δ(snp-index)值的分布情况(图1)，该低温雄性不育位点被定位在a07：27432829bp-29445255bp区间内，共包含8496个snps和2459个indels。
82.实施例2
83.甘蓝型油菜矮杆位点紧密分子标记的获得
84.(1)分子标记开发
85.利用bsa混合分组分析法将低温雄性不育位点定位在油菜a07染色体上的a07：27432829bp-29445255bp区间内。下载油菜参考基因组序列，在indel位点的上下游各增加150bp设计引物，采用primer premier 5.0软件在bnaa07：27432829bp-29445255bp区域内设计多个分子标记。
86.(2)分子标记鉴定
87.采用ctab法提取bc1群体油菜材料叶片的基因组dna，pcr反应体系(10ul)，其中含有0.5uldna模板、上、下游引物(1mmol/l)各0.25ul、5ulmix，和4ulddh2o。pcr反应程序：95℃变性5min；随后进行35个循环的95℃变性30s，tm值退火30s，72℃延伸30s；再经72℃延伸10min；最后4℃保存。pcr扩增产物用40％聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染显色。胶片在bio-rad visadoc3.0(bio-rad，usa)成像系统中扫描分析。
88.(3)结果与分析
89.其中通过以下四种引物
90.其中：seq indel12-f的序列如seq id no.5所示；
91.seq indel12-r的序列如seq id no.6所示；
92.seq indel18-f的序列如seq id no.7所示；
93.seq indel18-r的序列如seq id no.8所示；
94.seq indel20-f的序列如seq id no.9所示；
95.seq indel20-r的序列如seq id no.10所示；
96.seq indel23-f的序列如seq id no.11所示；
97.seq indel23-r的序列如seq id no.12所示；
98.seq indel06-f的序列如seq id no.14所示；
99.seq indel06-r的序列如seq id no.15所示；
100.seq indel24-f的序列如seq id no.17所示；
101.seq indel24-r的序列如seq id no.18所示；
102.获得六种分子标记：bnindel12、bnindel18、bnindel20、bnindel23、bnindel06、bnindel24。
103.在设计的多个分子标记中，发现上述四种分子标记bnindel12、bnindel18、bnindel20和bnindel23与低温雄性不育性状共分离。上述四种分子标记的基因型与表型完全一致，无重组株，检测效率达到100％。
104.在bc1群体中这四个共分离分子标记的带型分别是：使用bnindel12标记引物进行扩增时，拥有226bp的带型的单株是不具有低温雄性不育表型，不拥有226bp的带型的单株是具有低温雄性不育表型(图2)；使用bnindel18标记引物进行扩增时，如果扩增出196bp的条带，说明被检测材料具有低温雄性不育表型；如果未扩增出196bp的条带，说明被检测材料不具有低温雄性不育表型(图3)；使用bnindel20标记引物进行扩增时，如果扩增出210bp的条带，说明被检测材料具有低温雄性不育表型；如果未扩增出210bp的条带，而扩增出202bp的条带，说明被检测材料不具有低温雄性不育表型(图4)；使用bnindel23标记引物进行扩增时，如果出现201bp的条带，说明被检测材料不具有低温雄性不育表型；如果bnindel23标记引物未扩增出201bp的条带，说明被检测材料具有低温雄性不育表型(图5)。
105.上述4个共分离标记与群体表型完全一致，说明控制低温雄性不育的位点在此位置，而两个紧密连锁的标记有重组断点，这两个重组断点可以将控制低温雄性不育的位点定在一个区段。利用以上所述的4个共分离分子标记和与油菜低温雄性不育位点紧密连锁的分子标记bnindel06(图6，拥有216bp条带的为不育单株，拥有204bp条带的为可育单株)和bnindel24(图7，拥有222bp条带的为不育单株，拥有207bp的条带为可育单株)，得到控制甘蓝型油菜低温雄性不育位点，命名为bnlst1，定位于甘蓝型油菜a07染色体上bna a07_27452837bp-28262531bp，位于分子标记bnindel06和bnindel24之间的809.41kb区间内(图8)。下表1为六种分子标记：bnindel12、bnindel18、bnindel20、bnindel23、bnindel06、bnindel24的标记位置、突变类型以及引物，其序列分别如seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3、seq id no.4、seq id no.13、seq id no.16所示。
106.表1
107.标记名称标记位置突变类型f'引物r'引物产物长度indel0627452837
‑‑
27453070c—caacttctgatagaaataaacttagtcgattagaaaccattcctcactcagcccttt234indel1227623091
‑‑
27623316gcacaaaaa—gcgataaacgattttgccattaaacagaggagccgaagg226indel1827959625
‑‑
27959830gttaatcagat—gaagaagtgaaggagttttaatctagggtttaagcag206indel2028045463
‑‑
28045664a—ataaaacggctcttttcctaattccataggataaacgtgtattct202indel2328128007
‑‑
28128207agtcatcat—ataaagaatcgagtaaaagagaccattgatgatccaagt201indel2428262325
‑‑
28262531t—ttcaccttacataagtctgtctttaccgaattattatagag207
108.实施例3
109.分子标记在低温雄性不育油菜选择上的应用
110.(1)双亲本基因组扩增检测
111.用于验证低油菜温雄性不育系“7613s”(bnindel12等位条带为不拥有226bp的带型；bnindel18等位条带为拥有196bp的带型；bnindel20等位条带为拥有210bp的带型；bnindel23等位条带为不拥有201bp的带型)低温雄性可育材料(bnindel12等位条带为拥有226bp的带型；bnindel18等位条带为不拥有196bp的带型；bnindel20等位条带为不拥有
202bp的带型；bnindel23等位条带为拥有201bp的带型)如图2-5所示。
112.(2)群体扩增检测及标记分析
113.用低温雄性不育系与其姊妹系(低温雄性可育)进行杂交，得到bc1代种子，将bc1代种子进行种植，得到一个包含分离性状的bc1群体，bc1群体单株进行表型测定。采用ctab法分别提取bc1单株叶片的基因组dna。pcr反应体系(10ul)，其中含有0.5uldna模板、上、下游引物(1mmol/l)各0.25ul、5ulmix，和4ulddh2o。pcr反应程序：95℃变性5min；随后进行35个循环的95℃变性30s，tm值退火30s，72℃延伸30s；再经72℃延伸10min；最后4℃保存。pcr扩增产物用40％聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染显色。胶片在bio-rad visadoc3.0(bio-rad，usa)成像系统中扫描分析。分析bnindel12、bnindel18、bnindel20和bnindel23在低温雄性不育系和低温可育材料中的条带类型。bnindel12、bnindel18、bnindel20和bnindel23与低温雄性不育位点共分离，结果表明用bnindel12、bnindel18、bnindel20和bnindel23分子标记检测油菜低温雄性不育性状有较好的检测效果。通过图2-5可以看出条带清晰、基因型与表型一致，说明检测效果较好。

技术特征：
1.一种甘蓝型油菜低温雄性不育位点的分子标记，其特征在于，所述分子标记包括bnindel12、bnindel18、bnindel20和bnindel23中的任意一种或者多种，其序列分别如seq id no.1-4所示。2.一种用于扩增和检测权利要求1所述的甘蓝型油菜低温雄性不育位点的分子标记的引物对，其特征在于，所述引物对优选包括seq indel12-f和seq indel12-r、seq indel18-f和seq indel18-r、seq indel20-f和seq indel20-r、seq indel23-f和seq indel23-r中任意一对或者多对，其中：seq indel12-f的序列如seq id no.5所示；seq indel12-r的序列如seq id no.6所示；seq indel18-f的序列如seq id no.7所示；seq indel18-r的序列如seq id no.8所示；seq indel20-f的序列如seq id no.9所示；seq indel20-r的序列如seq id no.10所示；seq indel23-f的序列如seq id no.11所示；seq indel23-r的序列如seq id no.12所示。3.一种控制甘蓝型油菜低温雄性不育位点，其特征在于，所述控制甘蓝型油菜低温雄性不育位点为bnlst1，由权利要求1所述的述分子标记bnindel12、bnindel18、bnindel20和bnindel23与油菜低温雄性不育位点紧密连锁的分子标记bnindel06和bnindel24，将所述控制甘蓝型油菜低温雄性不育位点bnlst1，定位于甘蓝型油菜a07染色体上bna a07_27452837bp-28262531bp，位于分子标记bnindel06和bnindel24之间的809.41kb区间内；所述分子标记bnindel06和bnindel24的序列分别如seq id no.13和16所示。4.一种权利要求1所述的甘蓝型油菜低温雄性不育位点的分子标记的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)甘蓝型油菜低温雄性不育位点的获得：利用低温雄性不育材料7613s与其姊妹系进行杂交，得到杂种f1，f1与低温雄性不育材料7613s进行回交，得到bc1群体，选择bc1群体中的若干株低温雄性不育单株和若干株低温可育单株，进行bsa测序分析，低温雄性不育位点被定位在a07：27432829bp-29445255bp区间内，共包含8496个snps和2459个indels；(2)甘蓝型油菜矮杆位点紧密分子标记的获得：利用bsa混合分组分析法将低温雄性不育位点定位在油菜a07染色体上的a07：27432829bp-29445255bp区间内，下载油菜参考基因组序列，在indel位点的上下游各增加150bp设计引物，采用primer premier 5.0软件在bnaa07：27432829bp-29445255bp区域内设计多个分子标记；提取bc1群体油菜材料叶片的基因组dna，pcr扩增反应，在设计的多个分子标记中，bnindel12、bnindel18、bnindel20和bnindel23分子标记与低温雄性不育性状共分离，利用上述的4个共分离分子标记与油菜低温雄性不育位点紧密连锁的分子标记bnindel06和bnindel24，将所述控制甘蓝型油菜低温雄性不育位点命名为bnlst1，定位于甘蓝型油菜a07染色体上bna a07_27452837bp-28262531bp，位于分子标记bnindel06和bnindel24之间的809.41kb区间内。5.一种权利要求1所述的甘蓝型油菜低温雄性不育位点的分子标记的应用，其特征在
于，所述应用包括如下任意一种或者多种：(1)在检测油菜低温雄性不育位点bnlts1中的应用；(2)筛选或检测具有油菜低温雄性不育表型油菜中的应用；(3)在鉴定油菜低温雄性不育性状中的应用；(4)在低温雄性不育油菜制种中的应用。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述分子标记在含所述的甘蓝型油菜矮杆性状位点的品种和种质检测中的应用或者在选育低温雄性不育油菜品种和种质中的应用。7.一种权利要求2所述的引物对的应用，其特征在于，所述应用包括如下任意一种或者多种：(1)在检测油菜低温雄性不育位点bnlts1中的应用；(2)筛选或检测具有油菜低温雄性不育表型油菜中的应用；(3)在鉴定油菜低温雄性不育性状中的应用；(4)在低温雄性不育油菜制种中的应用。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述引物组在含所述的甘蓝型油菜低温雄性不育性状位点的品系和种质检测中的应用或者在选育油菜低温雄性不育系中的应用。9.一种检测低温雄性不育油菜及选育油菜低温雄性不育系的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求2所述的引物对。10.一种检测低温雄性不育油菜及选育油菜低温雄性不育系方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)提取待检测材料的dna；(2)采用权利要求2所述的引物对对或权利要求9所述的试剂盒进行pcr扩增；(3)当使用bnindel12标记引物进行扩增时，扩增出226bp的条带，说明被检测材料不具有低温雄性不育表型；未扩增出226bp的条带，说明被检测材料具有低温雄性不育表型；当使用bnindel18标记引物进行扩增时，扩增出196bp的条带，说明被检测材料具有低温雄性不育表型；未扩增出196bp的条带，说明被检测材料不具有低温雄性不育表型；当使用bnindel20标记引物进行扩增时，扩增出210bp的条带，说明被检测材料具有低温雄性不育表型；未扩增出210bp的条带，而扩增出202bp的条带，说明被检测材料不具有低温雄性不育表型；当使用bnindel23标记引物进行扩增时，扩增出201bp的条带，说明被检测材料不具有低温雄性不育表型；bnindel23标记引物未扩增出201bp的条带，说明被检测材料具有低温雄性不育表型。

技术总结
本发明公开了一种甘蓝型油菜低温雄性不育位点的分子标记及其引物对和应用。本发明通过图位克隆测方法将油菜低温雄性不育位点Bnlst1定位在A07染色体上，位于BnInDel06和BnInDel24之间，该位点与BnInDel12、BnInDel18、BnInDel20和BnInDel23共分离。甘蓝型油菜低温雄性不育性状与这四个分子标记呈共分离，单株基因型和表型一致，因此这四个分子标记在油菜低温雄性不育系辅助选择育种中具有巨大的应用前景，其可以有效快速，在油菜苗期筛选出低温雄性不育材料，区分可育材料，提高选择效率，还可以在分离世代提高选择的准确性，另外可以减少在开花期剔除可育、不育制种的工作量。种的工作量。种的工作量。


技术研发人员：管荣展 杨茂 曹丽芳 陈俊 江小美
受保护的技术使用者：南京农业大学
技术研发日：2022.10.21
技术公布日：2023/8/24