一种深绿木霉菌及其应用

1.本发明涉及植物病害生防领域，具体涉及一种深绿木霉菌及其应用。


背景技术：

2.木霉菌trichoderma属半知菌、从梗孢科，是一种分布广泛的土壤习居菌，也是一种高效的拮抗促生菌。木霉是一类生长在土壤中而不引起任何症状的微生物，在长期进化过程中，木霉和植物彼此适应、相互作用。自从1932年weindling发现其具有拮抗病原微生物，目前已有多个木霉菌株分离出并应用到病害防治。
3.禾谷镰孢菌(fursarium graminearum)可引起多种主要农作物的病害：比如小麦赤霉病、玉米茎腐病等。禾谷镰刀菌会在小麦籽粒中代谢不同种类毒素，包括：雪腐镰孢菌烯醇(nivalenol,niv)、脱氧雪腐镰孢菌烯醇(deoxynivalenol,don)和玉米赤霉烯酮(zenralenol,zen)等。don毒素会造成呕吐、人畜流产等危害。
4.拟轮枝镰孢菌(fusarium verticillioides)是一种感染玉米植物并导致世界产量下降的病原体。拟轮枝镰孢菌产生的毒素以伏马毒素的形式存在，可以在籽粒中积累，危害人类和牲畜的健康。伏马毒素在体内的积累可以抑制鞘脂代谢和细胞周期调节，从而导致食道癌和儿童神经管缺陷风险等多种影响。基于此，有必要控制这种病害，来减少产量的损失。防治手段通常通过在植物上喷洒杀菌剂来控制茎腐病。
5.抗病品种和化学农药防治通常是植物病害综合防治中常用的方法。然而，化学药剂由于环境残留、危害非靶标生物等方面的原因也不是防治植物病害的最佳选择。生物防治以其绿色、安全的优势近几年逐渐受到广泛应用。分离和筛选对禾谷镰孢菌、拟轮枝镰孢菌具有拮抗作用的木霉菌，符合绿色生产的需要，有较好的应用前景。


技术实现要素：

6.有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种深绿木霉菌，该深绿木霉菌菌株发酵上清液可以抑制禾谷镰孢菌和拟轮枝镰孢菌的生长，其菌株对禾谷镰孢菌和拟轮枝镰孢菌有拮抗作用。
7.为达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：
8.本发明提供了一种深绿木霉菌株，所述深绿木霉菌株命名为深绿木霉(trichoderma atroviride)cjccsj-f-ky10039，保藏编号为cctcc no.m20221135，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市洪山区八一路珞珈山，保藏日期为2022年7月19日。
9.本发明提供的深绿木霉菌(trichoderma atroviride)cjccsj-f-ky10039分离自西双版纳的森林系统，适宜生长环境为pda培养基，于28℃光照培养箱培养，72小时长满培养皿，菌落颜色绿色，随着生长初期为白色后产绿色孢子，培养3天，分生孢子白色在中心呈聚集状，菌落表面形成放射状、培养5天绿色颗粒状产孢簇，边缘产孢簇多，呈垫状，背面白色。菌丝白色，分枝，光滑，具隔膜。在分生孢子梗上单生、对生或轮生产孢细胞。产孢细胞烧
瓶形，基部窄，中部宽，向上变细，无色。分生孢子单生，近球形至卵圆形，单胞，绿色，边缘光滑，多个孢子聚集呈头状。有芳香气味。厚垣孢子未见。
10.本发明为鉴定本菌株的系统发育地位，对所分离菌株的itsdna序列进行测序。从ncbi(genbank)数据库中获取20个参比菌株序列，运用软件bioedit和mega11对分离菌株和参比菌株的itsdna序列进行分析，构建分离菌株与参比菌株的系统发育树。从而确定深绿木霉菌株系为木霉(trichoderma atroviride)的菌株系(附图3)，并命名为cjccsj-f-ky10039。
11.本发明发现深绿木霉菌cjccsj-f-ky10039发酵上清液对禾谷镰孢菌菌丝的抑制率为50～75％，对拟轮枝镰孢菌菌丝抑制率为15～45％。通过平板对峙试验发现其对禾谷镰孢菌和拟轮枝镰孢菌有拮抗作用，抑制率分别为70～85％和30～65％。
12.上述深绿木霉菌cjccsj-f-ky10039发酵上清液的制备方法包括如下步骤：将深绿木霉菌株接种至pda培养基中，于28℃光照培养箱培养4d后，制备孢子悬浮液，在pd培养基中接种所述孢子悬浮液，接种量为10
5～8
个/ml，28℃，200rpm培养5天后，将孢子和菌丝过滤取上清液，使用0.22μm的水相微孔滤膜进行抽滤完全去除菌体后收集无菌发酵上清液备用。将所得无菌发酵上清液与pda混合，倒入90mm培养皿内备用。
13.进一步地，所述pda培养基包含：葡萄糖20g、马铃薯200g、琼脂20g、1l去离子水。
14.进一步地，所述pd培养基包含：土豆浸出粉6g、葡萄糖20g、1l去离子水。
15.进一步地，所述孢子悬浮液的浓度为1
×
10
5～8
个/ml。
16.进一步地，所述无菌发酵上清液与pda的体积比为1:2～2.5。
17.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
18.本发明提供的深绿木霉菌来自西双版纳的热带森林系统，与其它同类木霉相较，除温度要求较高外，培养条件极为简单，其发酵上清液对禾谷镰孢菌和拟轮枝镰孢菌有明显拮抗作用。其菌株及代谢液可抑制禾谷镰孢菌和拟轮枝镰孢菌菌丝生长，该菌株可应用于绿色生产中，对环境友好，安全、无害、无污染，尤其在玉米禾谷镰孢菌和拟轮枝镰孢菌生物防控方向具有很好的应用前景。
19.深绿木霉cjccsj-f-ky10039的生物保藏说明：
20.保藏机构：中国典型培养物保藏中心(cctcc)
21.保藏编号：cctcc no.m 20221135
22.保藏日期：2022年7月19日
23.保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号，武汉大学中国典型培养物保藏中心
24.分类学命名：深绿木霉(trichoderma atroviride.)
附图说明
25.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图：
26.图1是深绿木霉cjccsj-f-ky10039分生孢子形态；
27.图2是深绿木霉cjccsj-f-ky10039在pda培养基上的菌落形态；
28.图3是基于its rdna序列构建的系统发育树；
29.图4是深绿木霉菌株ctccsj-f-ky10039发酵上清液对禾谷镰孢菌菌丝生长的抑制效果图；
30.图5是空白对照30％pd的禾谷镰孢菌菌丝平板生长效果图；
31.图6是深绿木霉菌株ctccsj-f-ky10039发酵上清液对拟轮枝镰孢菌菌丝生长的抑制效果图；
32.图7是空白对照30％pd的拟轮枝镰孢菌菌丝平板生长效果图；
33.图8是深绿木霉cjccsj-f-ky10039对禾谷镰孢菌平板对峙试验效果图；
34.图9是禾谷镰孢菌平板对峙空白对照；
35.图10是深绿木霉cjccsj-f-ky10039对拟轮枝镰孢菌平板对峙试验效果图；
36.图11是拟轮枝镰孢菌平板对峙空白对照。
具体实施方式
37.下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。
38.实施例1深绿木霉(trichoderma atroviride.)的鉴定和保藏
39.分子生物学鉴定：深绿木霉(trichoderma atroviride)的dna的提取方法采用试剂盒提取真菌基因组(vazyme cat.dc104-01)，pcr扩增dna的its4和its5序列，得到扩增产物，将扩增产物经纯化后直接进行双向测序，扩增的its基因序列提交ncbi上的blast程序分析，鉴定为深绿木霉(trichoderma atroviride)，命名为深绿木霉(trichoderma atroviride)cjccsj-f-ky10039(试验编号为d1)，其dna序列如seq id no.1所示。相关图见图1、图2、图3。
40.pcr扩增引物序列为its4引物和its5引物，所述its4引物核苷酸序列(如seq id no.2所示)为5'-tcctccgcttattgatatgc-3'和its5引物核苷酸序列(如seq id no.3所示)为5'-ggaagtaaaagtcgtaacaagg-3'。
41.pcr扩增的反应体系为：2
×
pcr反应预混液10μl，浓度为10μmol/l的引物its4引物1μl、浓度为10μmol/l的its5引物1μl，dna模板2.5μl，以重蒸去离子水补充体积至25μl。
42.pcr扩增的反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性15s，50℃退火20s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸6min，4℃终止。
43.深绿木霉(trichoderma atroviride)ctccsj-f-ky10039的保藏：将深绿木霉(trichoderma atroviride)cjccsj-f-ky10039保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市洪山区八一路珞珈山，保藏日期为2022年7月19日。
44.实施例2深绿木霉菌株ctccsj-f-ky10039发酵上清液对禾谷镰孢菌菌丝和拟轮枝镰孢菌菌丝生长的抑制作用试验
45.所述发酵上清液的制备方法：
46.将深绿木霉菌株ctccsj-f-ky10039(d1)接种至9cm平板pda培养基的中间，于28℃光照培养箱培养4d后，制备孢子悬浮液。在pd中接种浓度为1
×
106个/ml木霉孢子悬浮液，于28℃200rpm培养5天后，将发酵液过滤取上清液，使用0.22μm的水相微孔滤膜进行抽滤完全去除孢子和菌丝后收集无菌发酵上清液备用。将所得无菌发酵上清液与pda按照1:2的体积比进行混合，倒入90mm培养皿内备用。
47.将打孔获得的禾谷镰孢菌和拟轮枝镰孢菌直径5mm菌饼分别接种到含有d1发酵上清液平板(处理)和30％pd的平板(空白对照)上，重复3次，于照培养箱培养4天后，测定禾谷镰孢菌和拟轮枝镰孢菌菌落面积。
48.抑菌率(％)＝(对照菌落面积-处理菌落面积)/对照菌落面积。
49.由上式计算出，含有d1的发酵上清液分别对禾谷镰孢菌的抑制率为53.2％，对拟轮枝镰孢菌的抑制率为17.89％。具体结果参见表2、表3和图4-7。
50.表1样品处理对照表
51.处理样品名称d1深绿木霉菌株ctccsj-f-ky10039发酵液ck30％pd
52.表2深绿木霉菌株ctccsj-f-ky10039发酵上清液对禾谷镰孢菌菌丝生长抑制效果
53.处理重复1抑菌率(％)重复2抑菌率(％)重复3抑菌率(％)平均抑菌率(％)d150.3257.0352.2553.20
±
0.0345ack0000
54.表3深绿木霉菌株ctccsj-f-ky10039发酵上清液对拟轮枝镰孢菌菌丝生长抑制效果
55.处理重复1抑菌率(％)重复2抑菌率(％)重复3抑菌率(％)平均抑菌率(％)d118.4517.7917.4417.89
±
0.0294ack0000
56.实施例3深绿木霉菌株ctccsj-f-ky10039对禾谷镰孢菌和拟轮枝镰孢菌的平板对峙试验
57.将深绿木霉菌株ctccsj-f-ky10039、禾谷镰孢菌、拟轮枝镰孢菌菌丝用打孔器打成直径为5mm的菌丝饼，分别将木霉与禾谷镰孢菌、木霉与拟轮枝镰孢菌菌饼接入9cm的平板pda培养基中心点两侧的等距处(如图8,10)，以相同位置只接种禾谷镰孢菌、拟轮枝镰孢菌菌饼而不接种木霉菌饼作为对照(如图9,11)。分别测量禾谷镰孢菌、拟轮枝镰孢菌向中心点的菌落半径计算抑菌率，深绿木霉菌株ctccsj-f-ky10039对禾谷镰孢菌的抑菌率为52.15％，对拟轮枝镰孢菌的抑菌率为39.47％。
58.抑菌率(％)＝(对照菌落半径-处理菌落半径)/对照菌落半径。
59.从上述实验结果我们发现，本发明深绿木霉菌株对于拟轮枝镰孢菌和禾谷镰孢菌的菌丝生长有一定的抑制作用。结果参见表4、表5和图8-11。
60.表4深绿木霉菌株ctccsj-f-ky10039对禾谷镰孢菌平板对峙效果
61.处理重复1抑菌率(％)重复2抑菌率(％)重复3抑菌率(％)平均抑菌率(％)d155.0050.2351.2152.15
±
2.519ack0000
62.表5深绿木霉菌株ctccsj-f-ky10039对拟轮枝镰孢菌平板对峙效果
63.处理重复1抑菌率(％)重复2抑菌率(％)重复3抑菌率(％)平均抑菌率(％)d147.3739.4731.5839.47
±
7.895ack0000
64.最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

技术特征：
1.一种深绿木霉菌，其特征在于，所述深绿木霉菌已于2022年7月19日保藏于中国典型培养物保藏中心cctcc，保藏编号为cctcc no.m20221135，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号。2.根据权利要求1所述的一种深绿木霉菌的发酵上清液，其特征在于，所述发酵上清液的制备方法包括如下步骤：1)将深绿木霉菌株接种至pda培养基中，于28℃光照培养箱培养4d后，制备孢子悬浮液；2)在pd培养基中接种所述孢子悬浮液，接种量为10
5～8
个/ml，28℃，200rpm培养5天后，将孢子和菌丝过滤取上清液，使用0.22μm的水相微孔滤膜进行抽滤完全去除菌体后收集无菌发酵上清液备用；3)将所得无菌发酵上清液与pda混合，倒入90mm培养皿内备用。3.根据权利要求2所述的发酵上清液，其特征在于，所述孢子悬浮液的浓度为1
×
10
5～8
个/ml。4.根据权利要求2所述的发酵上清液，其特征在于，所述无菌发酵上清液与pda的体积比为1:2～2.5。5.根据权利要求1所述的深绿木霉菌在拮抗禾谷镰孢菌生长中的应用。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述深绿木霉菌的发酵上清液可抑制禾谷镰孢菌菌丝生长，抑制率为50～75％。7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，通过平板对峙试验，所述深绿木霉菌对禾谷镰孢菌生长有抑制作用，抑制率为70～85％。8.根据权利要求1所述的深绿木霉菌在拮抗拟轮枝镰孢菌生长中的应用。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述深绿木霉菌的发酵上清液可抑制拟轮枝镰孢菌菌丝生长，抑制率为15～45％。10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，通过平板对峙试验，所述深绿木霉菌对拟轮枝镰孢菌生长有抑制作用，抑制率为30～65％。

技术总结
本发明公开了一种深绿木霉菌及其应用，属于植物病害生防领域。该深绿木霉菌于2022年7月19日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC No.M 20221135。该深绿木霉菌(Trichoderma atroviride)CJCCSJ-F-KY10039分离自西双版纳的森林系统，该深绿木霉菌株发酵上清液可以抑制禾谷镰孢菌和拟轮枝镰孢菌菌丝的生长。通过平板对峙试验，发现其菌株对拟轮枝镰孢菌和禾谷镰孢菌的生长有抑制作用。该菌株在玉米禾谷镰孢菌和拟轮枝镰孢菌生物防控方向具有很好的应用前景。镰孢菌生物防控方向具有很好的应用前景。镰孢菌生物防控方向具有很好的应用前景。


技术研发人员：王新华 王咏坤 韩奕 刘宏毅 窦恺 陈捷
受保护的技术使用者：上海交通大学
技术研发日：2022.10.12
技术公布日：2023/8/24