一种使用酶催化合成（S）-烟碱的方法与流程

一种使用酶催化合成(s)-烟碱的方法
技术领域
1.本发明属于合成领域，具体涉及一种使用生物酶催化合成(s)-烟碱的方法。
技术背景
2.烟碱又名尼古丁，是传统烟草的中的主要药理活性成分，最新的研究发现尼古丁可以通过血脑屏障并作用于尼古丁乙酰胆碱受体，通过结合显示药理作用在中枢神经系统中实现调节功能，这意味着它在治疗中枢神经系统相关的疾病有着极大的潜力，尤其是对于阿兹海默症、帕金森、精神分裂症以及抑郁症等这些普遍疾病。
3.此外一些相关报道显示，尼古丁还有其他的许多药理作用，一些疾病的治疗和功能调节，如：增强人类相关的听觉处理，认知功能和刺激交感神经的肾上腺素能系统，并具有治疗结节病的潜力，可以抑制多种炎症引起的炎症外源性刺激，发挥抗氧化和抗炎的特性。由此可见(s)-烟碱有很好的制药市场前景，因此也很具有研究价值。
4.传统的获得(s)-烟碱的方法一般直接从烟草、西红柿、茄子、枸杞茄科植物提取，但是西红柿、茄子、枸杞这类的植物作为日常食用品更有意义，而烟草获得依赖巨大的种植面积且直接提取的左旋烟碱纯度只在93％左右，其余相关的生物碱杂质因结构的相似而难以分离，简单通过提纯手段难以达到高纯度的要求。
5.作为潜在的治疗疾病的制剂成分需要遵循制药领域严格的化学纯度要求：参考据美国药典所述，标准纯度至少99％且任何一种杂质的含量都不超过0.5％，为了清除这些难分离的杂质，人工合成法应运而生。
6.人工合成使用纯化学合成手段，一般会选择性不高，纯度不够或者环境污染性大的问题。在现有的技术手段中，酶作为生物催化剂是促进合成的重要手段,在选择性、可持续性和可进化性等方面的优势明显，本发明公开一种以酶催化合成(s)-烟碱的方法。


技术实现要素：

7.针对现有技术的缺点，本发明公开一种使用酶催化合成(s)-烟碱的方法，具有目标生成物光学纯度高，底物转化率高，酶再生循环使用的优势。
8.本发明的合成路线如下：
[0009][0010]
酶在合成式ⅱ化合物的过程中的作用如下所示：
[0011][0012]
合成步骤:
[0013]
1)还原：将式ⅰ化合物4-氨基-1-(3-吡啶基)-丁基酮在酶的催化下生成含中间体式ⅱ化合物3-(吡咯烷-2-基)吡啶；
[0014]
2)甲基化：在步骤1)的基础上，将式ⅱ化合物3-(吡咯烷-2-基)吡啶纯品投入磺酸酯类、卤代物或醛等有机物质存在的体系中，在还原剂的存在下，将式ⅱ化合物3-(吡咯烷-2-基)吡啶再甲基化生成式ⅲ化合物(s)-烟碱。
[0015]
作为本发明的进一步优选方案，所属步骤1)中使用的酶为还原酶、辅酶nadph、辅酶nadp以及脱氢酶；所述还原酶是一类烟酸和烟酰胺合成代谢先关的酶，所述辅酶nadph为还原型辅酶，在酶促反应中起递氢体的作用；所述辅酶nadp为氧化型辅酶，所述脱氢酶为葡萄糖脱氢酶、甲酸脱氢酶、醇脱氢酶的一种或多种，优选葡萄糖脱氢酶，葡糖糖脱氢酶相对的为日常生活中普遍存在的酶，廉价易得。
[0016]
采取上述技术方案，可以实现辅酶的再循环，降低消耗以及减少排放。
[0017]
更进一步的，所述一类烟酸和烟酰胺合成代谢先关的酶，这类酶可以分离自或衍生自以下来源:混浊红球菌属(rhodococcus opacus)、诺卡氏菌属(nocardioides sp.)、节杆菌属(arthrobacter sp.)或其同源物，所述同源物是指包含的氨基酸序列与本文所公开的任何一种酶具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，所述氨基酸序列为seq i.d.no:1、seq i.d.no:2、seq i.d.no:3、seq i.d.no:4或seq i.d.no:5，优选氨基酸序列为seq i.d.no:5所示的生物酶或其同源物，该人工序列的氨基酸序列经过特定位点饱和突变，在催化选择性上具有凸出优势，且对低浓度底物响应敏捷。
[0018]
采取上述技术方案，能够更高效地催化底物反应，生成的中间体式ⅱ化合物具有更容易达到光学纯度95％的目标。
[0019]
更进一步的，所述步骤2)的反应体系，优选醛类物质，包括但不限于甲醛、甲醛的聚合体或甲醛的缩醛；所述步骤2)中还原剂包括但不限于氰基硼氢化钠、硼氢化钠、硼氢化锂、甲酸、甲醇、硫酸二甲酯、硫酸二甲酯、氢化铝锂，优选甲酸；步骤1)的还原反应完成时，中间体式ⅱ化合物的光学纯度在95％及以上才可直接进行步骤2)甲基化反应。
[0020]
采取上述技术方案，甲基化还原式ⅱ化合物的正向反应更彻底，能够获得高收率、高纯度的(s)-烟碱；从整个合成的进程来讲，减少了纯化学法相应的上保护、脱保护等步骤，试剂消耗量小、可循环，有利精益生产。
[0021]
本发明的有益效果：生物酶的专一性强，具有高效的底物选择性，包括立体选择
性、区域选择性及化学选择性；酶法催化合成反应条件温和，反应能耗低，较化学方法可控度高；酶法对于环境友好，减少了相应的上保护、脱保护等步骤，可降低成本，减少污染物排放。
[0022]
下面通过具体的实施例进一步描述本发明，但并非是限制本发明的范围。
具体实施方式
[0023]
本发明中涉及到的还原酶如下所示：
[0024]
seqi.d.no.1：来自混浊红球菌属(rhodococcus opacus b4)
[0025]
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[0026]
seqi.d.no.2：来自混浊红球菌属(rhodococcus opacus pd630)
[0027]
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[0028]
seqi.d.no.3：诺卡氏菌属(nocardioides sp.js614)
[0029]
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[0030]
seqi.d.no.4：来自节杆菌属(arthrobacter sp.zxy-2)
[0031]
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[0032]
seqi.d.no.5来自人工序列(artificial sequence)：
[0033]
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[0034]
实施例1：
[0035]
分别取含有氨基酸序列如seqi.d.no.1、seqi.d.no.2、seqi.d.no.3、seqi.d.no.4、seqi.d.no.5的还原酶冻干物各0.5g，将上述五种还原酶分别投入编号序列1-5的四口烧瓶中，同时准备5份同样摩尔配比的式ⅰ化合物4-氨基-1-(3-吡啶基)-丁基酮、无水葡萄糖、葡萄糖脱氢酶以及辅酶nadph依次分别投入编号1-5的四口烧瓶、在缓冲溶液tris-edta的存在下，将反应体系的ph维持在7-9之间，编号1-5的四口烧瓶中的反应物同时进行生物转化。在搅拌的作用下编号1-5的反应瓶进行生物催化转化反应，每30min时间段同时取对比样1-5分析一次，直至hplc分析显示编号1-5的反应瓶中，hplc测定反应液中式ⅱ化合物的含量在99％以上，停止反应。
[0036]
由hplc测定的对映异构体纯度：使用chiracel od-h柱，用比例为95:5正己烷和1-丁醇并含有0.1％的二乙胺洗脱。(r)-对映异构体在6.1分钟时被洗脱，(s)-对映异构体在5.6分钟时被洗脱。对映异构体过量是由根据式[(s)-(r)]/((s)+(r)]确定的峰面积来确定的。
[0037]
对比编号1-5的反应结果如表1所示：
[0038]
[0039][0040]
根据表1的结果分析显示，编号5的实验结果优于编号1-4的实验结果，因此选取氨基酸序列为seqi.d.no.5的还原酶做反应物浓度相关的对比实验，表1中所写“略”为反应过程中1h至3.5h的五批次取样结果，数据冗长且趋势明显，不做具体显示。
[0041]
实施例2：
[0042]
在室温条件下，准备一个1l的四口瓶，先加入200ml缓冲溶液tris-edta，将反应体系的ph保持在7-9，加入式ⅰ化合物4-氨基-1-(3-吡啶基)-丁基酮100mm，16.42g、葡萄糖250mm,49.54g、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸钠盐nadp+为5mm,3.93g、葡萄糖脱氢酶50u/ml，16mg、还原酶选自氨基酸序列为seqi.d.no.5的冻干物0.5g,1mg/ml；加热升温，搅拌均匀，进行生物催化反应，在反应过程中，每30min取样分析，使用hplc分析反应体系中的式ⅱ化合物的含量，在此摩尔配比下，该反应在2小时后，式ⅱ化合物的含量达到76％，继续进行到4小时之后，式ⅱ化合物的含量达到95％以上，停止该步骤。
[0043]
将生物催化的反应混合物用浓硫酸酸化至ph 1-2，然后加热至90℃，持续搅拌20min以上，使所有蛋白质沉淀，用硅藻土从混合物中滤出蛋白质。将过滤后所得的澄清溶液用40％naoh溶液碱化至中性，并用500ml乙基叔丁基醚萃取三次，再合并有机相，并投入无水硫酸镁进行初步干燥，干燥完成后进一步加热分离溶剂，蒸馏之后，从体系剩余的混合物里分离出棕黄色液体状的式ⅱ化合物纯品，进行称量为12.32g，收率在75.0％，并取样分析测得光学纯度在99.2％。可直接进行甲基化反应。
[0044]
向生物催化后的中间产物式ⅱ化合物纯品中依次加入甲醛(2g)和甲酸(13.12g)，边加热边搅拌，当温度达到85℃，保持每10min取样分析一次，根据图谱中式ⅲ化合物(s)-烟碱的含量显示达到99.5％以上并具有对映异构体过量99％以上，反应结束。由hplc测定的化学纯度：使用x-bridge c18色谱柱，洗脱液包含(i)20mm碳酸氢铵水溶液(ph＝8.7)和(ii)乙腈的混合物，梯度程序为：0-10分钟，比例为95:5；10-13分钟，比例为70:30；13-16分钟，比例为10:90；然后是95:5。温度为35℃。检测器的条件为在260nm波长下的uv吸收。一般在9.925分钟处为(s)-烟碱，其他为杂质。
[0045]
实施例3：
[0046]
此操作过程与实施例2相似，区别在于反应物配比不同，以式ⅰ化合物4-氨基-1-(3-吡啶基)-丁基酮的起始量为当量1，则原料配比如下式ⅰ化合物4-氨基-1-(3-吡啶基)-丁基酮100mm，16.42g、葡萄糖150mm,29.72g、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸钠盐nadp+为
10mm,7.86g、葡萄糖脱氢酶50u/ml，0.016g、还原酶选自氨基酸序列seqi.d.no.5的冻干物0.5g,1mg/ml；在生物催化生成式ⅱ化合物的反应中，根据取样分析的结果显示，在2小时的节点上，中间物的含量在81％，继续进行至4小时的节点，含量达到97％，并取样分析测得光学纯度在99.38％，可直接进行甲基化反应。生物催化后的反应液进行纯化得到式ⅱ化合物纯品，进行称量为14.14g，收率在86.12％，并取样分析测得光学纯度在99.4％，可见改善投料比例对于提高收率有效。按实施例1的甲酸和甲醛比例进行投料，根据图谱中式ⅲ化合物(s)-烟碱的含量显示达到99.5％以上并具有对映异构体过量99％以上，反应结束。
[0047]
实施例4：
[0048]
此实施例操作过程与实施例3一致，不同的在于，不单独对生物催化生成式ⅱ化合物进行纯化，直接在含有粗品的混合物中加入甲酸和甲醛进行甲基化处理。将从式ⅰ化合物4-氨基-1-(3-吡啶基)-丁基酮16.42g的酶还原物中分离出的式ⅱ化合物加入800ml水中，再加入甲醛和甲酸搅拌升温，将混合物温度保持在80-85℃的温度区间2h，取样分析hplc图谱表明反应完成，然后冷却至室温。再加入50％氢氧化钠溶液调节ph至13左右。加入500ml乙基叔丁基醚4次萃取，并用硫酸镁干燥，减压蒸馏获得(s)-烟碱，称量得11.16g，收率在68％，通过手性hplc测得光学纯度》99.6％。本实施例显示此反应需要先进行中间物的纯化处理，再进行甲基化反应以获得高纯度、高转化率的(s)-烟碱。
[0049]
实施例1-4的实验结果显示，催化合成的过程中，氨基酸序列为seqi.d.no.5的还原酶具有明显的底物选择的优势，且在甲基化之前采取先进行中间体精制处理、测量得到符合光学纯度≥95％的标准的式ⅱ化合物纯品再进行反应的步骤，具有酶可回收再循环，目标生成物转化率高，收率高，纯度高的明显优势。

技术特征：
1.一种使用酶催化合成(s)-烟碱的方法，其特征在于，包括以下合成路线:合成步骤如下：1)还原：将式ⅰ化合物4-氨基-1-(3-吡啶基)-丁基酮在酶的催化下生成含中间体式ⅱ化合物3-(吡咯烷-2-基)吡啶；2)甲基化：在步骤1)的基础上，将式ⅱ化合物3-(吡咯烷-2-基)吡啶纯品投入磺酸酯类、卤代物或醛类物质存在的反应体系中，再加入还原剂，生成式ⅲ化合物(s)-烟碱。2.根据权利要求1所述的一种使用酶催化合成(s)-烟碱的方法，其特征在于，所述酶在步骤1)催化合成的过程中，发挥作用如下：3.根据权利要求2所述的一种使用酶催化合成(s)-烟碱的方法，其特征在于，所述步骤1)中所述酶为还原酶和辅酶nadph和辅酶nadp以及脱氢酶。4.根据权利要求3所述的一种使用酶催化合成(s)-烟碱的方法，其特征在于，所述步骤1)中所述还原酶为一类烟酸和烟酰胺合成代谢相关的酶，所述辅酶nadph为还原型辅酶；所述辅酶nadp为氧化型辅酶，所述脱氢酶为葡萄糖脱氢酶、甲酸脱氢酶、醇脱氢酶的一种或多种。5.根据权利要求4所述的一种使用酶催化合成(s)-烟碱的方法，其特征在于，所述一类烟酸和烟酰胺合成代谢相关的酶，这类酶可以分离自或衍生自以下来源:混浊红球菌属(rhodococcus opacus)、诺卡氏菌属(nocardioides sp.)、节杆菌属(arthrobacter sp.)或其同源物。6.根据权利要求5所述的一种使用酶催化合成(s)-烟碱的方法，其特征在于，所述同源物是指包含的氨基酸序列与本文所公开的任何一种酶具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，所述氨基酸序列为seq i.d.no.1、seq i.d.no.2、seq i.d.no.3、seq i.d.no.4或seq i.d.no.5。7.根据权利要求1所述的一种使用酶催化合成(s)-烟碱的方法，其特征在于，所述步骤2)中的反应体系，优选醛类物质，包括但不限于甲醛、甲醛的聚合体或甲醛的缩醛。8.根据权利要求1所述的一种使用酶催化合成(s)-烟碱的方法，其特征在于，所述步骤
2)中还原剂包括但不限于氰基硼氢化钠、硼氢化钠、硼氢化锂、甲酸、甲醇、硫酸二甲酯、硫酸二甲酯、氢化铝锂。9.根据权利要求1所述的一种使用酶催化合成(s)-烟碱的方法，其特征在于，所述步骤1)：还原反应完成时，中间体式ⅱ化合物的光学纯度在95％及以上才可直接进行步骤2)反应。

技术总结
本发明公开一种使用酶催化合成(S)-烟碱的方法，所述方法包括以下步骤：1)将式Ⅰ化合物在生物酶催化下合成式Ⅱ化合物；2)在步骤1)的基础上将式Ⅱ化合物再甲基化得到高纯度、高转化率的式Ⅲ化合物(S)-烟碱。此方法步骤简单，操作性强，生物酶的加入使得反应体系的反应速率更快，大大减少了反应时间；解决了纯化学合成选择性不高，纯度不够或者环境污染性大的问题。在现有的技术手段中，酶作为生物催化剂在促进合成时选择性、可持续性和可进化性等方面的优势明显。的优势明显。


技术研发人员：殷海兴 吴寅嵩 谭莹莹 曹健强 许鹏威
受保护的技术使用者：修实生物医药（南通）有限公司
技术研发日：2022.10.19
技术公布日：2023/8/24