用于诊断金黄色葡萄球菌对抗生素的敏感性的组合物及其用途的制作方法

1.本公开涉及用于诊断金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)对抗生素的敏感性的组合物及其用途。


背景技术：

2.金黄色葡萄球菌是在约30％的人口中检出的致病菌，并且已知为引起医院中感染的问题致病菌。金黄葡萄球菌是世界上最多的问题致病菌，因为它会造成皮肤和软组织的感染，从而发展出脓皮病，并且也会造成严重的危及生命的全身性感染，如骨髓炎、心内膜炎、败血症和菌血症。
3.防止被致病菌感染和治疗感染疾病的最常用方法是使用抗生素，如青霉素和甲氧西林，但由于过度使用抗生素，发展出对抗生素显示出抗性的致病菌。自1961年英国首次报告对抗生素甲氧西林显示出抗性的金黄色葡萄球菌以来，全球范围内发现的对各种抗生素显示出抗性的致病菌有所增加。
4.作为自卫的手段，致病菌通过突变或获得抗生素抗性的基因来获得对抗生素的抗性，随着抗生素误用和滥用的增加，这种耐药细菌产生的频率正在上升。此外，抗生素抗性的致病菌的增加不仅因为医院的感染，也与运输的发展和抗生素的滥用有关。感染抗生素抗性致病菌的患者人数在全球范围内逐渐增加。因此，为了有效控制和治疗致病菌感染，在准确快速诊断致病菌抗生素抗性的基础上选择治疗剂至关重要。
5.本发明人旨在确定金黄色葡萄球菌(代表性致病菌)的细胞分化调节蛋白sosa对抗生素具有特异性表达模式，并提供新的诊断组合物和使用该组合物能够确定对抗生素的敏感性/抗性的诊断方法。
6.[现有技术文献]
[0007]
[专利文献]
[0008]
韩国专利第10-2124614号


技术实现要素：

技术目标
[0009]
本公开涉及用于诊断金黄色葡萄球菌对抗生素的敏感性的组合物及其用途，并且具体地，作为诊断金黄色葡萄球菌对抗生素的敏感性的手段，本公开的目的是提供包含用于测量sosa基因的mrna表达水平的制剂或用于测量sosa蛋白的表达水平的制剂的组合物，通过鉴别sosa是对金黄色葡萄球菌而言特异性的标志物，确定sosa的表达水平与抗生素敏感性/抗性密切相关，从而被用作诊断金黄色葡萄球菌对抗生素的敏感性/抗性的手段，以及开发特异性结合至sosa蛋白以诊断样品中存在的金黄色葡萄球菌的抗生素敏感性/抗性的抗体。技术方案
[0010]
本公开提供了用于诊断金黄色葡萄球菌对抗生素的敏感性的组合物，所述组合物包含用于测量sosa基因的mrna表达水平的制剂或用于测量sosa蛋白的表达水平的制剂。
[0011]
此外，本公开提供了用于诊断金黄色葡萄球菌对抗生素的敏感性的试剂盒，所述试剂盒包含该组合物。
[0012]
此外，本公开提供了用于诊断金黄色葡萄球菌的敏感性的抗体，所述抗体与具有seq id no:7示出的氨基酸序列的抗原结合。
[0013]
此外，本公开提供了诊断金黄色葡萄球菌对抗生素的敏感性的方法，所述方法包括用抗生素和特异性结合至sosa蛋白的抗体处理从感染金黄色葡萄球菌的患者分离的生物样本，以检测具有在其表面上表达的sosa蛋白的金黄色葡萄球菌；以及确定具有在其表面上表达的sosa蛋白的金黄色葡萄球菌对抗生素具有敏感性。
[0014]
此外，本公开提供了筛选针对金黄色葡萄球菌的抗生素的方法，所述方法包括用候选材料处理金黄色葡萄球菌以测量sosa基因的mrna表达水平或sosa蛋白的表达水平；以及当金黄色葡萄球菌的sosa基因的mrna表达水平或sosa蛋白的表达水平增加时，确定候选材料是针对金黄色葡萄球菌显示出抗菌活性的抗生素。
[0015]
此外，本公开提供了如下的方法，所述方法提供了用于预测金黄色葡萄球菌感染的抗生素治疗的预后的信息，所述方法包括向受试者施用抗生素、以及测量从受试者分离的生物样本中的sosa基因的mrna表达水平或sosa蛋白的表达水平。
[0016]
此外，本公开提供了用于诊断金黄色葡萄球菌对抗生素的敏感性的抗体，其中，所述抗体特异性结合至sosa蛋白。有益效果
[0017]
根据本公开，通过鉴别sosa是对金黄色葡萄球菌而言特异性的标志物，确定sosa表达水平与抗生素的敏感性/抗性密切相关，以被用作诊断金黄色葡萄球菌对抗生素的敏感性/抗性的手段，并使用特异性结合至sosa蛋白的抗体诊断样品中存在的金黄色葡萄球菌对抗生素的敏感性/抗性，可提供包含用于测量sosa基因的mrna表达水平的制剂和用于测量sosa蛋白的表达水平的制剂的组合物作为用于诊断金黄色葡萄球菌对抗生素的敏感性的手段，以及能够快速且准确地预测抗生素在感染金黄色葡萄球菌的患者的抗生素治疗中的效果的方法。
附图说明
[0018]
图1显示了在各种微生物中检测16s rrna和sosa基因以检测金黄色葡萄球菌的结果。
[0019]
图2显示了对甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌(mssa)进行抗生素处理时分析sosa的rna表达的结果。
[0020]
图3显示了对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa)进行抗生素处理时分析sosa的rna表达的结果。
[0021]
图4是显示出实验方法的图，该方法能够在动物模型中使用sosa生物标志物准确且快速地预测为了治疗目的而施用的抗生素的效果。
[0022]
图5显示了在动物模型中分析抗生素施用后的金黄色葡萄球菌的sosa表达水平的结果。
[0023]
图6显示了在动物模型中分析抗生素施用后的动物模型的存活率的结果。
[0024]
图7显示了使用整个sosa蛋白序列、用于sosa特异性抗体开发的蛋白序列和开发出的抗体通过sosa的mrna表达来检测sosa蛋白的结果。
[0025]
图8是显示使用sosa抗体来诊断抗生素敏感/抗药的致病菌的方法的图。
[0026]
图9显示了使用sosa抗体在样本中检测表达sosa的致病菌而无细菌裂解过程的结果。
[0027]
图10显示了使用sosa抗体识别根据环丙沙星的浓度的金黄色葡萄球菌的sosa表达的结果。
[0028]
图11显示了使用蛋白质印迹验证七种类型的sosa抗体的抗原抗体应答的结果。
具体实施方式
[0029]
考虑到本文中功能，本文中使用的术语已尽可能地从当前广泛使用的通用术语中选择，但这些术语可根据本领域技术人员的意图或先例、新技术的出现等而变化。此外，在特定情况下，存在由申请人任意选择的术语，并且在这种情况下，该公开的说明书中将详细描述其含义。因此，本文中使用的术语不应被定义为术语的简单名称，而是应基于术语的含义和本公开的整体内容。
[0030]
除非另有定义，否则本文中使用的所有术语(包括技术术语或科学术语)具有与本公开所属领域的技术人员通常理解的含义相同的含义。术语(例如在常用词典中定义的那些术语)应被解释为具有与相关领域的背景下的含义相一致的含义，并且除非在本技术中明确定义，否则不应被解释为理想化的或过于正式的含义。
[0031]
数值范围包括为上述范围内定义的数值。本文给出的所有最大数值限值包括所有较低的数值限值，如对较低的数值限值所清楚说明的。本文给出的所有最小数值限值包括所有较高的数值限值，如对较高的数值限值所清楚说明的。本文给出的所有数值限值将包括处于较宽数值范围内的所有更好的数值，如对更窄的数值限值所清楚说明的。
[0032]
除非另有说明，否则核酸序列的方向分别从左向右读取，即从5’至3’，而氨基酸序列的方向从左向右读取，即从氨基到羧基。
[0033]
在下文中，将更详细地描述本公开。
[0034]
本公开提供了用于诊断金黄色葡萄球菌对抗生素的敏感性的组合物，所述组合物包含用于测量sosa基因的mrna表达水平的制剂或用于测量sosa蛋白的表达水平的制剂。
[0035]
sosa蛋白是在金黄色葡萄球菌的表面上表达的细胞分化调节蛋白。具体地，sosa蛋白具有seq id no:1示出的氨基酸序列并且以sosa基因编码，其中，所述sosa基因具有seq id no:2示出的核苷酸序列。
[0036]
抗生素可以是环丙沙星、万古霉素、甲氧西林、四环素、阿米卡星、卡那霉素、庆大霉素、链霉素、多西环素、替加环素、红霉素、阿奇霉素、克拉霉素、克林霉素、利奈唑胺、利福平、左氧氟沙星或莫西沙星，但不限于此。
[0037]
用于测量sosa基因的mrna表达水平的制剂是特异性结合至sosa的mrna的反义寡核苷酸、引物对或探针，并且用于测量sosa蛋白的表达水平的制剂是特异性结合至sosa蛋白的适体、寡肽、单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、配体、或肽核酸(pna)。
[0038]
此外，本公开提供了用于诊断金黄色葡萄球菌对抗生素的敏感性的试剂盒，所述
试剂盒包含该组合物。
[0039]
试剂盒可以是rt-pcr试剂盒、竞争性rt-pcr试剂盒或实时rt-pcr试剂盒、数字pcr试剂盒、dna芯片试剂盒或蛋白质芯片试剂盒。
[0040]
此外，本公开提供了用于诊断金黄色葡萄球菌的敏感性的抗体。该抗体特异性结合至具有seq id no:7示出的氨基酸序列的抗原。
[0041]
此外，本公开提供了诊断金黄色葡萄球菌对抗生素的敏感性的方法，所述方法包括通过用抗生素和特异性结合至sosa蛋白的抗体处理从感染金黄色葡萄球菌的患者分离的生物样本，检测具有在其表面上表达的sosa蛋白的金黄色葡萄球菌；以及确定具有在其表面上表达的sosa蛋白的金黄色葡萄球菌对抗生素具有敏感性。
[0042]
特异性结合至sosa蛋白的抗体结合至具有seq id no:7示出的氨基酸序列的抗原。
[0043]
检测具有在其表面上表达的sosa蛋白的金黄色葡萄球菌包括进一步用缀合有荧光材料的二抗进行处理，所述二抗特异性结合至与sosa蛋白特异性结合的抗体。荧光材料可以是绿色荧光蛋白(gfp)、黄色荧光蛋白(yfp)、蓝色荧光蛋白(bfp)或红色荧光蛋白(rfp)。
[0044]
此外，本公开提供了筛选针对金黄色葡萄球菌的抗生素的方法，所述方法包括用测试材料处理金黄色葡萄球菌以测量sosa基因的mrna表达水平或sosa蛋白的表达水平；以及当金黄色葡萄球菌的sosa基因的mrna表达水平或sosa蛋白的表达水平增加时，确定测试材料是针对金黄色葡萄球菌表现出抗菌活性的抗生素。
[0045]
sosa基因的mrna表达水平可以使用逆转录聚合酶反应(rt-pcr)、竞争性rt-pcr、实时定量rt-pcr、rna酶保护方法、northern印迹或dna芯片技术来测定，并且sosa蛋白的表达水平可以使用蛋白质印迹、酶联免疫吸附测定(elisa)、放射免疫测定(ria)、放射免疫扩散、双向免疫扩散、火箭免疫电泳、免疫组织化学染色、免疫沉淀测定法、补体结合试验、免疫荧光、免疫层析、荧光激活细胞分选仪(facs)分析或蛋白质芯片技术来测定，但不限于此。
[0046]
测试材料是指在筛选中用于测试其是否影响基因的表达量或影响蛋白质的表达或活性的未知候选材料。样本包括化学物质、核苷酸、反义rna、小干扰rna(sirna)和天然产物提取物，但不限于此。
[0047]
此外，本公开提供了如下的方法，所述方法提供了用于预测金黄色葡萄球菌感染的抗生素治疗的预后的信息，所述方法包括向受试者施用抗生素、以及测量从受试者分离的生物样本中的sosa基因的mrna表达水平或sosa蛋白的表达水平。
[0048]
受试者可以是感染金黄色葡萄球菌的患者、伴侣动物或家畜，并且生物样本可以是从受试者分离的血液、体液、唾液和尿液。
[0049][0050]
此外，本公开提供了用于诊断金黄色葡萄球菌对抗生素的敏感性的抗体，其中，所述抗体特异性结合至sosa蛋白。
[0051]
抗体可包含具有seq id no:8示出的氨基酸序列的重链和具有seq ino:9示出的氨基序列的轻链，抗体可包含具有seq id no:10示出的氨基酸序列的重链和具有seq id no:11示出的氨基酸序列的轻链，抗体可包含具有seq id no:12示出的氨基酸序列的重链
和具有seq id no:13示出的氨基酸序列的轻链，抗体可包含具有seq id no:14示出的氨基酸序列的重链和具有seq id no:15示出的氨基酸序列的轻链，抗体可包含具有seq id no:16示出的氨基酸序列的重链和具有seq id no:17示出的氨基酸序列的轻链，抗体可包含具有seq id no:18示出的氨基酸序列的重链和具有seq id no:19示出的氨基酸序列的轻链，并且抗体可包含具有seq id no:20示出的氨基酸序列的重链和具有seq id no:21示出的氨基酸序列的轻链。实施例
[0052]
在下文中，将详细描述实验实施例和示例性实施方式，以帮助理解本公开。然而，以下的实验实施例和示例性实施方式仅为对本公开的内容的说明，并且本公开的范围不限于以下的实验实施例和示例性实施方式。提供本公开的实验实施例和示例性实施方式以向本领域普通技术人员更完整地解释本公开。
[0053][0054]
《实验实施例》实验材料与方法
[0055]
以下的实验实施例旨在提供通常应用于根据本公开的每个示例性实施方式的实验实施例。
[0056][0057]
1.微生物实验中使用的菌株为鲍曼不动杆菌(acinetobacter baumannii，a.baumannii)、大肠杆菌k12(escherichia coli k12，e.coli k12)、铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa，p.aeruginosa)、肺炎链球菌(streptococcus pneumoniae，s.pneumoniae)和金黄色葡萄球菌(s.aureus)。
[0059]
将实验中使用的微生物接种在新鲜的mueller hinton培养基中，并在有氧环境下于37℃培养。
[0060][0061]
2.rna的提取
[0062]
将各离心后的菌株用350μl的细菌rna保护试剂洗涤。将团粒以13000rpm离心2min，并悬浮在220μl的edta缓冲液(混合了200μl的50mm edta、10μl的10mg/ml溶菌酶和10μl的5mg/ml溶葡球菌酶的溶液)中。在37℃下培养30min，然后超声处理10次，每次30秒。对各样品进行酶解和机械裂解，然后根据制造商的说明使用rneasy mini试剂盒(qiagen)提取rna。总rna用不含rna酶的ddh2o洗脱。将rna稀释至50ng/μl的浓度，并使用dna酶i(sigma aldrich)去除剩余的基因组dna。将反应体积设定为10μl，包括1μl缓冲溶液、1μl dna酶i储备溶液和5μl的50ng/μl rna。将混合物在室温下培养15min，并通过加入40μl不含rna酶的纯水来停止反应。
[0063][0064]
3.实时定量pcr
[0065]
使用下表1中的引物组，研究从各菌株提取的rna的sosa基因的表达。
[0066][0067]
[表1]
[0068]
对于pcr反应，将pcr混合物的体积设置为总共25μl，包括5μl的5ng/μl rna、1μl各引物、0.25μl的rt酶和12.5μl的sybr green i pcr master mix(qiagne)。在使用applied biosystems viia 7在50℃逆转录10min后，95℃引发5min，95℃变性10s，并在58℃退火10s和72℃延伸20s，进行40个循环。延伸结束后，在72℃下进行荧光采集。通过确定超过荧光阈值极限的点来计算阈值周期(ct)值。为了查明引物二聚体和非特异性键是否在pcr终止时形成，将熔解曲线的升温速率设置为0.1℃/秒。为了分析基因表达水平，从sosa的平均ct中减去参考基因trna的平均ct(δct)。然后使用δδct来确定表达变化的倍数。
[0069][0070]
4.蛋白质印迹收集微生物后，将团粒悬浮在300μl裂解缓冲液(50mm tris/hcl，ph 7.5；145mm nacl，4mm edta，ph 8.0，100μg/ml溶葡球菌酶和1x蛋白酶抑制剂)中，在37℃下培养1h，并超声20次，每次30秒。使用bradford比色法测定总蛋白的浓度，并基于bsa设定。将相同量的蛋白质加样到15％聚丙烯酰胺-sds凝胶中，并转移到聚偏二氟乙烯(pvdf)膜。将blot用处于dpbs中的5％的脱脂奶粉封闭，并将sosa特异性抗体以1:3000稀释，以在4℃下处理过夜。将经处理的膜在室温下用tbs-t(20mm tris，137mm nacl，0.1％吐温20)洗涤三次，持续1h。此后，在5％的脱脂奶粉中以1:6000将过氧化物酶结合的山羊抗小鼠二抗(abcam)处理1h，然后以与上述相同的方式洗涤三次。免疫应答条带用ecl检测试剂盒(pierce)使用luminographii仪器进行检测。
[0072][0073]
5.荧光测量
[0074]
将微生物团粒用1ml的含有sosa特异性抗体的dpbs悬浮，从而以1:2000稀释，并在37℃、180rpm下培养过夜。之后在13000rpm下离心1min，对以1:500稀释的二抗(抗小鼠fitc，abcam)进行处理，并在37℃、180rpm下进行培养3h。将100μl样本转移到含有18mm盖玻片的12孔板，并在1100rpm下离心1min，并使细菌附着到盖玻片。用dpbs洗涤该板三次，并在1100rpm下离心1min。将盖玻片盖到载玻片，然后使用zeiss lsm 5活体共焦显微镜进行成像。使用plan apochromat 63x 1.4na物镜获取图像，并通过将激发波长设置为488nm和将发射波长设置为513
±
12nm进行分析以检测gfp荧光。
[0075]
此外，将各样本转移到96孔板，并使用ensight(perkinelmer)进行吸光度测量和荧光分析。在绿色荧光的情况下，激发波长在488nm处，且发射波长在528nm处，而在红色荧光的情况下，激发波长在558nm处，且发射波长在615nm处。将样品稀释两倍而无关固定来使用信号强度的标准曲线。
[0076][0077]
实施例1.利用生物标志物检测金黄色葡萄球菌
[0078]
为确定sosa是否适合作为诊断金黄色葡萄球菌的抗生素敏感性的标志物，评估了sosa是否为金黄色葡萄球菌的特异性标志物。从包括如下的各种致病菌提取总基因组，然
后分析是否存在sosa基因：鲍曼不动杆菌、大肠杆菌k12、铜绿假单胞菌、肺炎链球菌和金黄色葡萄球菌。
[0079]
如图1所示，可证明各致病菌存在的16s rrna在所有细菌中检出，但sosa基因仅在金黄色葡萄球菌样本或包含其的混合样本中检出。该结果表明，sosa是金黄色葡萄球菌的特异性标志物。
[0080][0081]
实施例2.根据抗生素敏感性/抗性评价sosa的表达
[0082]
为了评估在金黄色葡萄球菌中以各种抗生素处理时，敏感性/抗性是否与sosa的表达有关，分析了对先前已知有抗生素敏感性/抗性的金黄色葡萄球菌以抗生素处理时的sosa的表达水平。
[0083]
首先，对具有已知的抗生素敏感性/抗性的甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌(mssa)用如下表2所示的环丙沙星、万古霉素、甲氧西林、或四环素进行处理，并分析了sosa的表达水平。
[0084][0085]
[表2][表2]
[0086]
如图2所示，当衍生出对抗生素的敏感性时，甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌(mssa)的sosa表达水平增加，而当衍生出对抗生素的抗性时，sosa表达水平受到抑制，其中，sosa表达水平和先前所知的抗生素敏感性/抗性的相似。
[0087]
此外，如下表3所示，对具有已知的抗生素敏感性/抗性的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa)用环丙沙星、万古霉素、甲氧西林、或四环素进行处理，以分析sosa的表达水平。
[0089][0090]
[表3][表3]
[0091]
如表3所示，当衍生出对抗生素的敏感性时，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa)的sosa表达水平增加，而当衍生出对抗生素的抗性时，sosa表达水平受到抑制，其中，sosa表达水平和先前已知的抗生素敏感性/抗性的相似。
[0092]
作为比较各种抗生素在金黄色葡萄球菌中的敏感性/抗性诊断率的结果，使用20种甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌(mssa)和30种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa)的sosa表达水平的分析结果与现有的敏感性/抗性进行比较，如下表4所示，对环丙沙星的敏感性/抗性诊断率为98％、对万古霉素的敏感性/抗性诊断率为100％、对甲氧西林的敏感性/抗性诊断率为96％、并且对四环素的敏感性/抗性诊断率为98％。
[0093]
[表4]抗生素种类诊断可靠性(％)
环丙沙星98万古霉素100甲氧西林96四环素98
[0094][0095]
结果表明，sosa表达水平可用作诊断金黄色葡萄球菌对各种抗生素的敏感性/抗性的手段。
[0096][0097]
实施例3.根据sosa表达预测治疗预后
[0098]
使用感染金黄色葡萄球菌的动物模型，针对抗生素治疗后经感染的动物血液中的金黄色葡萄球菌的sosa表达水平进行分析，并在同时监测治疗后动物的预后，以评估sosa表达能够快速预测治疗的预后。
[0099]
首先，在用金黄色葡萄球菌感染动物模型2h后，以0mg/kg、5mg/kg和50mg/kg施用环丙沙星作为治疗剂，然后在另外的2小时后，测量动物血液中的金黄色葡萄球菌表达的sosa(图5)。此后，在24h、48h和72h后测量动物模型的存活率(图6)。
[0100]
如图5和图6所示，发现随着sosa表达的增加，动物的临床预后得到改善，从而证明sosa表达可能是预后诊断的标志物。
[0101][0102]
实施例4.使用sosa抗体评估抗生素敏感性/抗性
[0103]
基于实施例2中的结果，表现出对抗生素的敏感性的金黄色葡萄球菌在抗生素存在的情况下显示出增加的sosa表达水平，但表现出对抗生素的抗性的金黄色葡球菌不表达sosa。由金黄色葡萄球菌中的sosa基因编码的sosa蛋白在细菌表面上表达。基于这些事实，开发了特异性结合至sosa蛋白的抗体(图7)，并通过使用该抗体从生物样本中检测表达sosa蛋白的金黄色葡萄球菌来进行评估，以检测对抗生素的敏感性/抗性。
[0104]
首先，开发出特异性结合至sosa蛋白的抗体。具体地，抗体特异性结合至seq id no:7示出的抗原，并且制备抗体的方法如下。抗原通过合成处于肽形式的sosa蛋白的一些序列来制备。将钥孔血蓝蛋白(klh)与所述肽序列缀合，以增加针对抗原的抗体形成的产率，并为此，将半胱氨酸(c)添加到合成的抗原肽的氨基以促进与klh的结合。将与最终获得的klh结合的肽抗原注射到小鼠体内7～8次，持续两个月。从具有抗原诱导的免疫应答的小鼠中收集抗血清，以检查是否形成抗体，并在同时将小鼠的脾脏取出，分离成单细胞，然后与骨髓瘤细胞结合，以制备杂交瘤细胞并获得单克隆抗体。
[0105]
收集了形成sosa特异性抗体的总共七种杂交瘤细胞，并且从中获得的各抗体被命名为20b5b10、20g2h3、22e5c11、27d9b11、31h3e10、39a6c1和40b4b11。通过基于从杂交瘤提取的mrna修饰为cdna获得的基因序列而转换的氨基酸序列来确定各抗体的序列。
[0106]
使用所述抗体发现，由此测量的sosa蛋白水平与通过rt-pcr检测的sosa基因的表达水平相似(图7)。在不进行预处理过程(例如金黄色葡萄球菌的裂解)的情况下以sosa抗体进行处理，其中，sosa被表达以鉴别是否通过荧光分析检测到sosa蛋白。
[0107]
如图9所示，作为在光学显微镜和荧光分析sosa抗体下鉴别抗生素敏感的金黄色葡萄球菌的存在的结果，荧光出现在与抗生素敏感的黄金黄色葡萄球菌相同的位点。
[0108]
此外，如图10所示，可以使用所述抗体检测sosa的表达，其表达随着环丙沙星的施用浓度增加而增加。此外，如图11所示，作为通过对七种类型的检测到的抗体中的每一种的sosa的抗原-抗体反应进行蛋白质印迹的结果，证明使用各抗体都可观察到sosa的表达。
[0109][0110]
上述结果表明，在使用特异性结合至sosa蛋白的抗体而不对细菌进行预处理的情况下，可以快速评估样本中存在的金黄色葡萄球菌的抗生素敏感性/抗性。
[0111][0112]
如上所述，详细描述了本公开的内容的具体部分，对于本领域普通技术人员来说清楚的是，具体描述仅是优选的实施方式，而本公开的范围不限于此。换言之，本公开的实质范围可以由所附权利要求及其等同物来定义。

技术特征：
1.用于诊断金黄色葡萄球菌对抗生素的敏感性的组合物，所述组合物包含用于测量sosa基因的mrna表达水平的制剂或用于测量sosa蛋白的表达水平的制剂。2.如权利要求1所述的组合物，其中，所述抗生素为环丙沙星、万古霉素、甲氧西林、四环素、阿米卡星、卡那霉素、庆大霉素、链霉素、多西环素、替加环素、红霉素、阿奇霉素、克拉霉素、克林霉素、利奈唑胺、利福平、左氧氟沙星或莫西沙星。3.如权利要求1所述的组合物，其中，所述用于测量sosa基因的mrna表达水平的制剂是特异性结合至sosa的mrna的反义寡核苷酸、引物对或探针。4.如权利要求1所述的组合物，其中，所述用于测量sosa蛋白的表达水平的制剂是特异性结合至sosa蛋白的适体、寡肽、单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、配体、或肽核酸(pna)。5.用于诊断金黄色葡萄球菌对抗生素的敏感性或预后的试剂盒，所述试剂盒包含权利要求1-4中任一项所述的组合物。6.如权利要求5所述的试剂盒，其中，所述试剂盒为rt-pcr试剂盒、竞争性rt-pcr试剂盒、实时rt-pcr试剂盒、数字pcr试剂盒、dna芯片试剂盒或蛋白质芯片试剂盒。7.用于诊断金黄色葡萄球菌的敏感性的抗体，所述抗体特异性结合至具有seq id no:7示出的氨基酸序列的抗原。8.诊断金黄色葡萄球菌对抗生素的敏感性的方法，所述方法包括：通过用抗生素和特异性结合至sosa蛋白的抗体处理从感染金黄色葡萄球菌的患者分离的生物样本，检测具有在其表面上表达的sosa蛋白的金黄色葡萄球菌；以及确定具有在其表面上表达的sosa蛋白的金黄色葡萄球菌对抗生素具有敏感性。9.如权利要求8所述的方法，其中，所述抗生素为环丙沙星、万古霉素、甲氧西林、四环素、阿米卡星、卡那霉素、庆大霉素、链霉素、多西环素、替加环素、红霉素、阿奇霉素、克拉霉素、克林霉素、利奈唑胺、利福平、左氧氟沙星或莫西沙星。10.如权利要求8所述的方法，其中，所述特异性结合至sosa蛋白的抗体结合至具有seq id no:7示出的氨基酸序列的抗原。11.如权利要求8所述的方法，其中，所述检测具有在其表面上表达的sosa蛋白的金黄色葡萄球菌包括：开发出特异性结合至sosa蛋白的抗体，并进一步用特异性结合至所述抗体的缀合有荧光材料的二抗进行处理。12.如权利要求8所述的方法，其中，所述荧光材料是绿色荧光蛋白(gfp)、黄色荧光蛋白(yfp)、蓝色荧光蛋白(bfp)或红色荧光蛋白(rfp)以及任何其他生物学上可用的荧光材料。13.筛选针对金黄色葡萄球菌的抗生素的方法，所述方法包括：用测试材料处理金黄色葡萄球菌以测量sosa基因的mrna表达水平或sosa蛋白的表达水平；以及当金黄色葡萄球菌的sosa基因的mrna表达水平或sosa蛋白的表达水平增加时，确定所述测试材料是针对金黄色葡萄球菌表现出抗菌活性的抗生素。14.如权利要求13所述的方法，其中，使用逆转录聚合酶反应(rt-pcr)、竞争性rt-pcr、实时定量rt-pcr、rna酶保护方法、northern印迹或dna芯片技术来测量所述sosa基因的mrna表达水平。
15.如权利要求13所述的方法，其中，使用蛋白质印迹、酶联免疫吸附测定(elisa)、放射免疫测定(ria)、放射免疫扩散、双向免疫扩散、火箭免疫电泳、免疫组织化学染色、免疫沉淀测定法、补体结合试验、免疫荧光、免疫层析、荧光激活细胞分选仪(facs)分析或蛋白质芯片技术来测量所述sosa蛋白的表达水平。16.一种提供用于预测金黄色葡萄球菌感染的抗生素治疗的预后的信息的方法，所述方法包括：向受试者施用抗生素、以及测量从所述受试者分离的生物样本中的sosa基因的mrna表达水平或sosa蛋白的表达水平。17.根据权利要求16所述的方法，其中，所述抗生素为环丙沙星、万古霉素、甲氧西林、四环素、阿米卡星、卡那霉素、庆大霉素、链霉素、多西环素、替加环素、红霉素、阿奇霉素、克拉霉素、克林霉素、利奈唑胺、利福平、左氧氟沙星或莫西沙星。18.用于诊断金黄色葡萄球菌对抗生素的敏感性的抗体，其中，所述抗体特异性结合至sosa蛋白。19.如权利要求18所述的抗体，其中，所述抗体包含具有seq id no:8示出的氨基酸序列的重链和具有seq id no:9示出的氨基序列的轻链。20.如权利要求18所述的抗体，其中，所述抗体包含具有seq id no:10示出的氨基酸序列的重链和具有seq id no:11示出的氨基酸序列的轻链。21.如权利要求18所述的抗体，其中，所述抗体包含具有seq idno:12示出的氨基酸序列的重链和具有seq id no:13示出的氨基酸序列的轻链。22.如权利要求18所述的抗体，其中，所述抗体包含具有seq id no:14示出的氨基酸序列的重链和具有seq id no:15示出的氨基酸序列的轻链。23.如权利要求18所述的抗体，其中，所述抗体包含具有seq id no:16示出的氨基酸序列的重链和具有seq id no:17示出的氨基酸序列的轻链。24.如权利要求18所述的抗体，其中，所述抗体包含具有seq id no:18示出的氨基酸序列的重链和具有seq id no:19示出的氨基酸序列的轻链。25.如权利要求18所述的抗体，其中，所述抗体包含具有seq id no:20示出的氨基酸序列的重链和具有seq id no:21示出的氨基酸序列的轻链。

技术总结
本发明涉及用于诊断金黄色葡萄球菌对抗生素的敏感性的组合物及其用途。具体地，已经确定sosA是对金黄色葡萄球菌而言特异性的标志物，并且sosA的表达水平表现出类似于抗生素敏感性/抗性的性质，从而可用作诊断金黄色葡萄球菌对抗生素的敏感性/抗性的手段，并且本发明通过使用特异性结合至SosA蛋白的抗体来诊断样本中存在的金黄色葡萄球菌对抗生素的敏感性/抗性，并因此作为诊断金黄色葡萄球菌对抗生素的敏感性的手段，提供了含有用于测量sosA基因的mRNA表达水平的试剂或用于测量SosA蛋白的表达水平的药剂的组合物。SosA蛋白的表达水平的药剂的组合物。SosA蛋白的表达水平的药剂的组合物。


技术研发人员：张秀珍 李润美
受保护的技术使用者：韩国巴斯德硏究所
技术研发日：2021.10.15
技术公布日：2023/8/24