一种用于微生物扩增子高通量定量测序及分析方法与流程

1.本发明属于微生物技术领域，特别涉及一种用于微生物扩增子高通量定量测序及分析方法。


背景技术：

2.随着高通量测序技术的不断发展，测序技术已成为环境微生物群落比较和差异分析的主流研究手段之一。微生物扩增子测序主要通过直接扩增环境总dna的特定区域，解释某一特定样本环境微生物分布、丰度变化和群落组成情况。微生物扩增子测序主要包括16s rdna测序、18s rdna测序、its测序及其他目标区域扩增子测序等。采用第二代高通量测序平台测定的16s/18s/its某个高变区域的序列，来反应环境样品在细菌、真菌、古菌分类方面物种之间的差异，对研究海洋、土壤、肠道粪便等环境中的微生物构成有重要的指导作用，同时也是系统发育和分类学研究中一种广泛使用的方法。
3.目前的16s rdna可变区文库构建方法，一般是使用靶向扩增引物对某个或某几个可变区进行pcr扩增构建测序文库。构建文库过程通常包括两轮pcr扩增，第一轮pcr针对目标片段进行扩增，然后通过第二轮pcr扩增加上测序所需的通用接头。由于pcr扩增存在偏好性、不均一性，文库中的所有片段并非等量的被扩增。当涉及不同样本之间进行对比分析时，由于不同样本dna纯度不一致，对pcr扩增的抑制效果不一样，导致pcr扩增效率也有很大差别，无法精确对不同样本的微生物量进行对比分析。
4.对样本的16s序列进行测序，得到成千上万条reads，在16s分析中引入otu，首先对相似性(阈值一般为97％)序列进行聚类，分成数量较少的分类单元，基于分类单元进行物种注释。常规16s扩增子测序技术虽然其具有高通量，低花费，可客观还原菌群结构及相对丰度比例的巨大优势，但是其是通过某一otu分类单元的序列数所占总序列数的比值来获得某个细菌的相对丰度比例信息，然而相对丰度信息不能反映样本中物种真实的绝对丰度情况。
5.在微生物的研究中，通常可以观察到不同时刻菌群比例发生的变化，但却无法确定这种变化是由于菌群中所有菌株等量增殖，还是其中某一优势菌株优势增殖导致其他菌株抑制或是引入了同种外来细菌导致的，对菌株的鉴定则有助于研究菌群的变化机制、筛选突变菌株、研究相关疾病或感染的发病机制，进而研制出针对某一菌株的靶向药物，这些都必须依赖更加准确的测序数据。
6.人体肠道内存在大量微生物，这些微生物通过多种途径影响着人体健康，在人体的健康促进和疾病发生、发展中起着重要作用。肠道微生态平衡正成为人体健康的重要标志，维持肠道微生态的动态平衡，有助于人体抵御各种疾病的干扰，保持健康状态，维持肠道微生态的平衡主要是维持肠道菌群的数量保持在稳定健康数值范围内。然而，目前并无合适的微生物扩增子定量测序及分析方法，给微生物的定量测序及分析带来很多困扰。


技术实现要素：

7.为了获得更加准确的数据、实现对细菌的定量检测，本发明的目的是提供一种微生物扩增子高通量定量测序及分析方法，旨在提高微生物扩增子测序准确定量分析微生物丰度。
8.本发明的另一个目的是提供一种用于微生物扩增子高通量定量测序及分析方法，该方法能够有效检测肠道菌群的数量进而评估人体肠道健康状况，有助于肠道健康管理。
9.为达到此目的，本发明采用如下技术方案：
10.一种用于微生物扩增子高通量定量测序及分析方法，包括；
11.步骤1、spike-dna的构建；
12.其中，spike-dna设计了遵循三个原则：
13.1)与16s rrna基因中用于鉴定原核微生物的引物有共同结合位点；
14.2)与16s rrna基因检测区域长度相同，gc含量相近；
15.3)spike-dna仅在样品中发现，不影响样品的原始微生物种组成。
16.原核16s rrna v4区引物515f和806r是肠道菌群研究中常用的引物，基于16s rrna v4区515f引物添加一段12bp特殊标签构造重组正向引物515fs(5
’‑
gtgccagcagccgcggtaagtcagctactga-3’)；
17.利用重组正向引物515fs和806r(5
’‑
ggactacnvgggtwtctaat-3’)从微生物阳性样品进行扩增、纯化和回收，得到纯的spike-dna。
18.进一步，对spike-dna进行浓度检测，根据公式：
[0019][0020]
计算spike-dna单位拷贝数，并进行梯度稀释备用。
[0021]
步骤2、样品加入spike-dna进行高通量测序文库构建；
[0022]
待测样品基因组dna提取并质检合格后，稀释至1ng/μl，待测样品基因组dna中添加特定拷贝数的spike-dna，用正向引物(illumina adapter sequence 1+barcode+gtgccagcmgccgcggtaa)和反向引物(illumina adapter sequence 2+barcode+ggactacnvgggtwtctaat)扩增待测样品微生物16s rrna基因v4高变量区(515f/806r)。
[0023]
pcr反应体系为20μl，反应体系如下：
[0024]
试剂名称体积pcr扩增反应液10μl正向引物(终浓度0.25mm)0.5μl反向引物(终浓度0.25mm)0.5μl无菌去离子水6μlspike-dna1μl待测样品基因组dna2μl
[0025]
体系配制完成后，按照以下反应条件，在pcr仪上进行反应：
[0026][0027]
上述反应产物用1.5％(w/v)琼脂糖凝胶进行检测，针对目的条带采用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行纯化回收。每个待测样品进行浓度检测、均一化后，混合组成一个混合文库，在illumina miniseq平台上使用pe150模式进行测序。
[0028]
步骤3、高通量测序数据分析及校正；
[0029]
样品中加入了spike-dna，测序数据经过拆分和去除低质量数据后，使用flash软件对原始的双端reads进行组装，然后对spike-dna的测序数据进行统计和去除，使用usearch软件按照默认参数对clean tags进行嵌合体检查，以97％的相似度进行otu聚类；在得到otu表后，根据绝对定量的方法将其转化为绝对丰度表。
[0030]
由于每个样品加入的spike-dna的量一样，最后经过测序得到的spike-dna的reads数是一致的，经过大样本测试，spike-dna的reads数会在一个均值(即常数k)附近。采用以下公式计算微生物群的绝对丰度：
[0031][0032]
其中，xi是每个样本的物种绝对数量，ni为每个样本的原始物种数量，k为所添加固定量的spike-dna的测序后得到的reads数的均值，ri是每个样本当次测得的spike-dna的reads数。
[0033]
基于绝对定量的otu矩阵，使用相应的r包装进行α多样性分析及各组间β多样性差异统计分析。
[0034]
本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：
[0035]
本发明通过定量添加spike-dna的方法，矫正检测样品文库构建及测序引起的偏差，获得细菌的绝对丰度，提高了肠道微生物检测分析的准确性。
附图说明
[0036]
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0037]
图1为本发明实施重组正向引物515fs和806r设计示意图。
[0038]
图2为临床样本测序数据中spike-dna的reads统计和物种组测分布图。
[0039]
图3为使用相对定量和绝对定量分析的ibd患者在菌群移植前(w0)和移植后4周(w4)属水平的物种组成丰度图。
[0040]
图4为ibd患者在菌群移植前(w0)和移植后4周(w4)差异物种丰度和差异物种数量示意图。
具体实施方式
[0041]
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
[0042]
实施案例。
[0043]
炎症性肠病(inflammatory bowel disease,ibd)，是由肠道菌群失调引起的一种特发性疾病，临床主要表现为腹痛、腹泻、粘液血便，部分患者还同时存在消瘦和贫血。包括溃疡性结肠炎(u lcerative colitis,uc)和克罗恩病(crohn’sdisease,cd)两个独立的疾病，ibd的病理并不十分清楚。人类基因组中关于ibd的驱动风险就包括200多种，其中许多与宿主和微生物的相互作用有关。研究发现，ibd患者肠道中硝化应激及氧化应激增强，导致专性厌氧菌拟杆菌门和厚壁菌门和需氧菌放线菌门丰度降低，兼性厌氧菌变性菌门丰度增加，微生物的多样性降低，导致肠黏膜损害，引发肠道炎症。为了更精确研究ibd患者肠道菌群移植前后肠道菌群发生的变化，本案例采用绝对定量测序进行研究分析。
[0044]
一、实验方法。
[0045]
1、扩增spike-dna的引物设计
[0046]
原核16s rrna v4区是肠道菌群研究中常用区域，针对16s rrna v4区上游引物515f，添加一段12bp特殊标签构造重组正向引物515fs(5
’‑
gtgycagcagccgcggtaagtcagctactga-3’),与16s rrna v4区下游引物806r(5
’‑
ggactacnvgggtwtctaat-3’)，组成扩增spike-dna的引物。对515fs和806r进行引物分析，12bp特殊标签的加入，不会使得引物对之间产生严重的引物二聚体。
[0047]
2、微生物阳性样品选择及spike-dna的构建；
[0048]
芽孢杆菌属白翎芽孢杆菌700cs(bacillus baekryungensis 700cs)作为一种海水中的独特细菌，在生理条件下，它不存在于肠道微生物组中，并且通过16srrna基因测序可以与肠道中的细菌很好地区分。采用515fs和806r引物对其基因组dna进行扩增，pcr反应体系为20μl，反应体系如下：
[0049][0050]
扩增后的pcr产物在1.5％琼脂糖凝胶电泳上进行检测，并将目的片段条带进行割胶、纯化和回收。
[0051]
3、spike-dna浓度检测及稀释；
[0052]
将获得的spike-dna进行浓度检测，根据公式：
[0053][0054]
计算spike-dna单位拷贝数，并进行梯度稀释，分别得到如下浓度的spike-dna：
[0055]
序号1*10^7copies11*10^6copies25*10^5copies31*10^5copies41*10^4copies51*10^3copies
[0056]
4、ibd临床样品收集及基因组dna提取；
[0057]
挑选ibd患者肠道菌群移植前(w0)和肠道菌群移植后4周(w4)的的临床粪便样本，采用qiaamp fast dna stool mini kit进行粪便基因组dna提取，质检合格后，将样品基因组dna稀释至1ng/μl。
[0058]
5、临床样品dna进行高通量测序文库构建；
[0059]
临床样品基因组dna分成两组进行高通量测序文库构建，其中一组不添加spike-dna，另外一组添加上述第3步中稀释成不同拷贝数的spike-dna。两组dna都用正向引物(illumina adapter sequence 1+barcode+gtgccagcmgccgcggtaa)和反向引物(illumina adapter sequence 2+barcode+ggactacnvgggtwtctaat)扩增待测样品微生物16s rrna基因v4高变量区(515f/806r)并进行文库构建。pcr反应体系为20μl，反应体系如下：
[0060]
[0061][0062]
体系配制完成后，按照以下反应条件，在pcr仪上进行反应：
[0063][0064]
上述反应产物用1.5％(w/v)琼脂糖凝胶进行检测，针对目的片段采用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行纯化回收。每个待测样品文库进行浓度检测，取等物质的量的样品文库进行混合，组成一个混合文库。在illumina miniseq平台上使用pe150模式进行测序。
[0065]
6、临床样品测序数据质控和分析；
[0066]
测序数据经过拆分和去除低质量数据后，使用flash软件对原始的双端reads进行组装，然后对spike-dna的测序数据进行统计和去除，使用usearch软件按照默认参数对clean tags进行嵌合体检查，以97％的相似度进行otu聚类，将otu代表序列与silva_132_97_16s.fna数据库比对，获得otu物种注释信息。通过分析临床样本dna添加spike-dna和不添spike-dna的物种组成及相对丰度，对比添加spike-dna和不添spike-dna两组数据评估spike-dna加入对数据分析产生的影响，同时评估添加不同拷贝数spike-dna，是否对数据分析产生的影响。在确定添加spike-dna对数据分析不会产生显著影响的同时，确定较合适的spike-dna添加的拷贝数。
[0067]
7、通过绝对定量的方法对测序数据进行校正及分析；
[0068]
临床样品测序数据在在聚类和注释后得到otu表，采样绝对定量的方法将其转化为绝对丰度表。采用以下公式计算微生物群的绝对丰度：
[0069]
[0070]
其中，xi是每个样本的物种绝对数量，ni为每个样本的原始物种数量，k为所添加固定量的spike-dna的测序后得到的reads数的均值，ri是每个样本当次测得的spike-dna的reads数。
[0071]
基于绝对定量的otu矩阵，使用r包装进行分析，得到α多样性，包括richness、shannon和eveniness。使用非参数kruskal-wallis秩和检验和配对wilcox检验检验了样本间测量的α-多样性的显著性差异。基于绝对定量otu表，使用bray-curis距离测量样品的β-多样性。β多样性可以估计样本间群落结构的差异。使用r包中的adonis分析(permanova分析)进行999种排列置换，测定各组间β多样性指标的统计差异。
[0072]
二、实验结果。
[0073]
通过对添加spike-dna和不添加spike-dna两组测序数据进行分析，发现适量拷贝数的spike-dna添加不影响临床样品的菌群物种组成，并确定5*10^5copies的spike-dna添加量对临床样品的分析不产生显著影响，如图2所示，图中，不添加spike-dna(blank1-3)和添加不同拷贝数spike-dna后，临床样本测序数据中spike-dna的reads统计如图中a部分所示，物种组测分布如b部分所示。
[0074]
使用相对定量和绝对定量的方法分别分析ibd患者在菌群移植前后样本属水平的物种组成。如图3所示，相较于相对丰度(图3a部分)，绝对丰度(图3b部分)发现菌群移植后4周(w4)物种总丰度与移植前(w0)有差异，且呈现移植后菌群总丰度增加。
[0075]
对使用绝对定量方法矫正过的临床样本数据进行分析，分析ibd患者在菌群移植前后不同时期物种差异。其中，芽孢杆菌和放线菌分别在移植后4周(w4)显著增加和减少。ruminococcaceae_ucg-002、coprococcus_3、christensenellaceae_r-7_group和holdemanella在w4时显著增加；un_f_enterobacteraceae在w4时显著增加；志贺杆菌和嗜血杆菌在w4时均显著减少。使用维恩图来显示绝对量化方法和相对量化方法之间的共同或唯一的差异物种。与传统的相对定量方法相比，绝对定量方法可以识别更多的差异物种，如图4所示。图中，ibd患者在菌群移植前(w0)和移植后4周(w4)差异物种丰度如a部分所示，差异物种数量如b部分所示。
[0076]
综上所述，本发明通过定量添加spike-dna的方法，矫正检测样品文库构建及测序引起的偏差，获得细菌的绝对丰度，提高了肠道微生物检测分析的准确性。
[0077]
以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种用于微生物扩增子高通量定量测序及分析方法，其特征在于该方法包括如下步骤；步骤1、spike-dna的构建；基于16s rrna v4区515f引物添加一段12bp特殊标签构造重组正向引物515fs(5
’‑
gtgccagcagccgcggtaagtcagctactga-3’)；利用重组正向引物515fs和806r(5
’‑
ggactacnvgggtwtctaat-3’)从微生物阳性样品进行扩增、纯化和回收，得到纯的spike-dna；步骤2、样品加入spike-dna进行高通量测序文库构建；待测样品基因组dna提取并质检合格后，待测样品基因组dna中添加特定拷贝数的spike-dna，用正向引物(illumina adapter sequence 1+barcode+gtgccagcmgccgcggtaa)和反向引物(illumina adapter sequence 2+barcode+ggactacnvgggtwtctaat)扩增待测样品微生物16s rrna基因v4高变量区(515f/806r)；步骤3、高通量测序数据分析及校正；样品中加入了spike-dna，测序数据经过拆分和去除低质量数据后，使用flash软件对原始的双端reads进行组装，然后对spike-dna的测序数据进行统计和去除，使用usearch软件按照默认参数对clean tags进行嵌合体检查，以97％的相似度进行otu聚类；在得到otu表后，根据绝对定量的方法将其转化为绝对丰度表。2.根据权利要求1所述的用于微生物扩增子高通量定量测序及分析方法，其特征在于其中，spike-dna设计了遵循三个原则：1)与16s rrna基因中用于鉴定原核微生物的引物有共同结合位点；2)与16s rrna基因检测区域长度相同，gc含量相近；3)spike-dna仅在样品中发现，不影响样品的原始微生物种组成。3.根据权利要求1所述的用于微生物扩增子高通量定量测序及分析方法，其特征在于步骤1中，对spike-dna进行浓度检测，根据公式：计算spike-dna单位拷贝数，并进行梯度稀释备用。4.根据权利要求3所述的用于微生物扩增子高通量定量测序及分析方法，其特征在于步骤2中，pcr反应体系为20μl，反应体系如下：试剂名称体积pcr扩增反应液10μl正向引物(终浓度0.25mm)0.5μl反向引物(终浓度0.25mm)0.5μl无菌去离子水6μlspike-dna1μl待测样品基因组dna2μl体系配制完成后，按照以下反应条件，在pcr仪上进行反应：
5.根据权利要求4所述的用于微生物扩增子高通量定量测序及分析方法，其特征在于上述反应产物用1.5％(w/v)琼脂糖凝胶进行检测，针对目的条带采用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行纯化回收；每个待测样品进行浓度检测、均一化后，混合组成一个混合文库，在illumina miniseq平台上使用pe150模式进行测序。6.根据权利要求1所述的用于微生物扩增子高通量定量测序及分析方法，其特征在于步骤3中，采用以下公式计算微生物群的绝对丰度：其中，xi是每个样本的物种绝对数量，ni为每个样本的原始物种数量，k为所添加固定量的spike-dna的测序后得到的reads数的均值，ri是每个样本当次测得的spike-dna的reads数。

技术总结
本发明是用于微生物扩增子高通量定量测序及分析方法，该方法包括如下步骤；步骤1、Spike-DNA的构建；基于16S rRNA V4区515F引物添加一段12bp特殊标签构造重组正向引物515FS；利用重组正向引物515FS和806R从微生物阳性样品进行扩增、纯化和回收，得到纯的Spike-DNA；步骤2、样品加入Spike-DNA进行高通量测序文库构建；步骤3、高通量测序数据分析及校正。本发明通过定量添加Spike-DNA的方法，矫正检测样品文库构建及测序引起的偏差，获得细菌的绝对丰度，提高了肠道微生物检测分析的准确性。确性。


技术研发人员：张帮周 林爱强 罗联根 肖传兴 柯栋贤 梁银龙
受保护的技术使用者：厦门承葛医学检验实验室有限公司
技术研发日：2023.04.11
技术公布日：2023/8/24