用于一氧化氮自由基检测与成像的复合荧光探针及合成方法

1.本发明涉及一种一氧化氮自由基(no
·
)的检测方法，具体涉及一种基于碳点与金属聚合物复合的荧光探针对no
·
的检测与荧光成像，属于分析与环境健康领域。


背景技术：

2.长期暴露于重金属和环境类分泌干扰物等环境污染物会导致机体功能的损伤和多种疾病的发生，这种引起损害的生物途径之一就是氧化应激，此时产生的高活性氧化分子和抗氧化剂之间的长期失衡会进一步引起组织损伤。no
·
作为活性氮的中心分子是一种典型的抗氧化剂，能够有效清除人体内过多的脂质自由基和活性氧自由基，因此氧化应激条件下no
·
的浓度通常会增加，从而导致高反应性活性氮onoo-水平的升高和细胞损伤，同时最近有研究表明no
·
自身不可控分泌同样会诱导活性氧/活性氮(ros/rns)的产生，因此对于no
·
等抗氧化剂的实时检测显得尤为重要。
3.目前传统的no
·
检测方法有电子自旋共振光谱法、比色法、荧光法、化学发光法和电化学方法等，其中荧光法因其高灵敏度、良好的选择性、操作简便、快速响应和原位实时成像等优势受到越来越多的关注，但由于no
·
的半衰期短、反应活性高，对于体外和体内的no
·
的灵敏选择性测定仍然是一个挑战。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，并提供一种用于一氧化氮自由基检测与成像的复合荧光探针及合成方法。
5.本发明所采用的具体技术方案如下：
6.第一方面，本发明提供了一种用于一氧化氮自由基检测与成像的复合荧光探针的合成方法，具体如下：
7.s1：将咪唑-2-甲醛(ica)加入谷胱甘肽水溶液中，得到ica-gsh淡黄色透明溶液，随后向其中加入含1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的甲醇溶液，充分搅拌后再加入含n-羟基琥珀酰亚胺的甲醇溶液，继续搅拌，最后再滴加氮,硫掺杂碳量子点(n,s-cds)溶液，反应后得到n,s-cds@ica溶液；
8.s2：将所述n,s-cds@ica溶液与甲醇混合，接着在搅拌条件下加入含咪唑-2-甲醛的甲醇溶液，随后加入硝酸锌溶液充分混合；将产物高速离心后收集沉淀，清洗后将黄棕色沉淀重新分散于无水乙醇中，得到用于一氧化氮自由基检测与成像的复合荧光探针。
9.作为优选，所述氮,硫掺杂碳量子点溶液的制备方法如下：
10.分别称取200mg邻苯二胺和130mg尿素，加入30ml 2.8mol/l硫酸溶液超声溶解，得到澄清混合溶液；将所述澄清混合溶液转移到聚四氟乙烯内衬的高压反应釜中，于210℃反应8h得到墨绿色浑浊液体；将所述墨绿色浑浊液体冷却到室温后，在9000rpm转速下离心10min去除杂质，取上清液通过0.22μm微孔滤膜后再用纤维素酯膜透析20h，氮,硫掺杂碳量子点在透析袋内呈黑色沉淀状析出；随后以转速10000rpm离心10min，再用10ml无水乙醇溶
解得到酒红色透明溶液，即氮,硫掺杂碳量子点溶液。
11.作为优选，所述氮,硫掺杂碳量子点溶液和复合荧光探针均置于4℃保存。
12.作为优选，所述步骤s1具体如下：
13.将368.4mg的谷胱甘肽溶于60ml超纯水中，加入1ml 2m氢氧化钠溶液，得到谷胱甘肽水溶液；然后将115mg的咪唑-2-甲醛加入所述谷胱甘肽水溶液中搅拌过夜，得到ica-gsh淡黄色透明溶液；取20ml所述ica-gsh淡黄色透明溶液，向其中加入5ml含1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐65mg的甲醇溶液，充分搅拌30min，再加入5ml含n-羟基琥珀酰亚胺40mg的甲醇溶液，继续搅拌20min，最后滴加1ml所述氮,硫掺杂碳量子点溶液，搅拌过夜得到n,s-cds@ica溶液。
14.作为优选，所述步骤s2具体如下：
15.取24ml所述n,s-cds@ica溶液与20ml甲醇混合，快速搅拌下加入含咪唑-2-甲醛7.2ml的甲醇溶液，然后加入0.9ml 100mm的硝酸锌溶液混合并持续搅拌40min；将产物经10000rpm转速离心12min后收集，并用甲醇和超纯水各洗涤3次，所得黄棕色沉淀重新分散于10ml无水乙醇中，得到复合荧光探针。
16.第二方面，本发明提供了一种利用第一方面任一所述合成方法得到的用于一氧化氮自由基检测与成像的复合荧光探针。
17.本发明相对于现有技术而言，具有以下有益效果：
18.本发明首先以邻苯二胺、尿素与硫酸为原料通过水热法合成了氮,硫掺杂发红光的碳点(n,s-cds)，为了提高探针的选择性、稳定性和响应速度，利用谷胱甘肽(gsh)通过酰胺化反应把n,s-cds与锌为中心离子的聚合物连接起来，合成了高灵敏、高选择性快速检测一氧化氮自由基(no
·
)的复合荧光探针(n,s-cds@zn-ica)。
附图说明
19.图1为n,s-cds@zn-ica复合探针对no
·
的荧光响应。实验条件：n,s-cds@zn-ica:60mg/l,pbs:20mm(ph＝7.5),λ
ex
＝540nm.
20.图2中，(a)n,s-cds@zn-ica探针浓度对no
·
淬灭效应的影响；(b)溶剂对no
·
淬灭探针荧光效率的影响；(c)ph对no
·
淬灭探针荧光效率的影响；(d)平衡时间对no
·
淬灭探针荧光强度的影响。其中：f0和f分别表示snp加入前后的荧光强度,n,s-cds@zn-ica:60mg/l,snp:20μm,pbs:20mm(ph＝7.5),λ
ex
＝540nm.
21.图3中，(a)n,s-cds@zn-ica探针对不同snp浓度响应的荧光光谱图；(b)荧光淬灭效率(f
0-f)/f0与snp浓度的线性关系。其中：f0和f分别代表加入snp前后探针的荧光强度。n,s-cds@zn-ica:60mg/l,pbs:20mm(ph＝7.5),λ
ex
＝540nm.
22.图4中，(a)n,s-cds@zn-ica探针对阴阳离子、抗氧化剂和活性物种的荧光响应；(b)n,s-cds@zn-ica探针在no
·
与其它各类阴阳离子、抗氧化剂和活性物种共存时的干扰情况。其中，(1)blank,(2)na
+
(10mm),(3)k
+
(10mm),(4)ca
2+
,(5)mg
2+
,(6)zn
2+
,(7)cl-,(8)hco
3-,(9)f-,(10)no
3-,(11)co
32-,(12)so
42-,(13)aa,(14)gsh,(15)l-cys,(16)glu,(17)onoo-,(18)h2o2,(19)
·
oh,(20)1o2,(21)hocl,(22)snp；其它所有离子和抗氧化剂浓度为1mm,活性物种浓度均为50μμ,snp：20μm。f0和f分别代表加入snp前后探针的荧光强度，n,s-cds@zn-ica：60mg/l,pbs:20mm(ph＝7.5),λ
ex
＝540nm.
23.图5为mcf-7细胞外源性no
·
的荧光成像(a)和平均荧光强度(b).其中：n,s-cds@zn-ica：100.0mg/l，snp:40.0μm.激发滤光片560
±
20nm,发射滤光片630
±
37.5nm。
具体实施方式
24.下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步阐述和说明。本发明中各个实施方式的技术特征在没有相互冲突的前提下，均可进行相应组合。
25.实施例
26.本实施例首先制备了一种复合荧光探针(n,s-cds@zn-ica探针)，该复合荧光探针可用于一氧化氮自由基检测与成像。其合成方法具体如下：
27.1)氮,硫掺杂碳量子点(n,s-cds)溶液的制备，具体如下：
28.分别称取200mg邻苯二胺和130mg尿素放入50ml烧杯中，加入30ml 2.8mol/l硫酸溶液超声溶解，得到澄清混合溶液。将上述澄清混合溶液转移到50ml聚四氟乙烯内衬的高压反应釜中，于210℃反应8h得到墨绿色浑浊液体。将制得的墨绿色浑浊液体冷却到室温后，在9000rpm转速下离心10min去除杂质，取上清液通过0.22μm微孔滤膜后再用纤维素酯膜透析20h，氮,硫掺杂碳量子点在透析袋内呈黑色沉淀状析出。随后以转速10000rpm离心10min，再用10ml无水乙醇溶解得到酒红色透明溶液，即氮,硫掺杂碳量子点溶液。氮,硫掺杂碳量子点溶液需要置于4℃保存。
29.2)n,s-cds@ica的制备，具体如下：
30.将谷胱甘肽(gsh，1.2mmol,368.4mg)溶于60ml超纯水中，加入1ml 2m氢氧化钠溶液，得到谷胱甘肽水溶液；然后将咪唑-2-甲醛(ica，1.2mmol,115mg)加入上述谷胱甘肽水溶液中搅拌过夜，得到ica-gsh淡黄色透明溶液。取20ml制得的ica-gsh淡黄色透明溶液，向其中加入5ml含1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc，0.34mmol,65mg)的甲醇溶液，充分搅拌30min，再加入5ml含n-羟基琥珀酰亚胺(nhs，0.34mmol,40mg)的甲醇溶液，继续搅拌20min，最后滴加1ml通过步骤1)制得的氮,硫掺杂碳量子点溶液，搅拌过夜得到n,s-cds@ica溶液。
31.3)n,s-cds@zn-ica探针的制备：
32.取24ml步骤2)制得的n,s-cds@ica溶液与20ml甲醇混合，快速搅拌下加入ica甲醇溶液(7.2ml,100mm)，然后加入0.9ml 100mm的硝酸锌zn(no3)2溶液混合并持续搅拌40min，烧杯内瞬间产生沉淀。将沉淀产物经10000rpm转速离心12min后收集，并用甲醇和超纯水各洗涤3次，所得黄棕色沉淀重新分散于10ml无水乙醇中，得到复合荧光探针，并于4℃冰箱中保存待用。
33.为了验证本实施例制得的复合荧光探针对一氧化氮自由基(no
·
)的作用效果，还进行了如下检测实验：
34.(4)n,s-cds@zn-ica探针对一氧化氮自由基(no
·
)的荧光检测，具体如下：
35.硝普钠(snp)作为常用的一氧化氮自由基供体，经过可见光照射后可以可控地在水溶液中持续释放no
·
，将不同浓度的snp水溶液分别加入到装有12μl 10g/l n,s-cds@zn-ica探针乙醇溶液的离心管中，然后加入200μl pbs缓冲溶液(ph＝6.0)与334μl无水乙醇，最后用超纯水稀释定容到2.0ml，室温下分别静置5min，在540nm激发波长下记录612nm处的荧光强度，激发/发射狭缝宽度均为5nm。
36.如图1所示，为n,s-cds@zn-ica复合探针对no
·
的荧光响应结果。从图中可以看出，n,s-cds@zn-ica复合探针在激发波长540nm处，n,s-cds发射出619nm的红色荧光，zn-ica聚合物本身不发荧光，加入no
·
后n,s-cds表面的邻苯二胺结构可以选择性地与no
·
反应形成苯并三唑结构，并与n,s-cds发生电荷转移(pet)，使n,s-cds@zn-ica复合探针的荧光蓝移7nm，并发生明显淬灭。
37.为了优化n,s-cds@zn-ica复合探针测定条件，还对复合探针的检测条件(包括探针浓度、溶剂、ph和响应时间)进行了优化，结果分别如图2所示。由图2可以看出，复合探针的浓度为60mg/l，16.7％乙醇作为溶剂，ph为7.5，响应时间5min为最优化测定条件。
38.在优化后的最佳实验条件下，试验了探针对no
·
的定量检测，结果如图3。当snp浓度处于0.25-25μm范围时，荧光淬灭效率(f
0-f)/f0与snp浓度呈良好的线性关系，线性方程式为(f
0-f)/f0＝0.02534[snp]+0.02636(r2＝0.9902)，snp的检出限(lod)为96.0nm(3σ/k，其中σ是空白溶液的标准偏差，k是校准曲线的斜率)。
[0039]
为考察n,s-cds@zn-ica探针对no
·
的选择性，试验了如下常见的阴阳离子(na
+
,k
+
,mg
2+
,ca
2+
,zn
2+
,cl-,hco
3-,no
3-,f-,co
32-,so
42-)、抗氧化剂(aa、glu、gsh、l-cys)和活性物质ros/rns(onoo-、no
·
、1o2、h2o2、hocl、
·
oh)对探针选择性的影响，结果如图4所示。由图可知，n,s-cds@zn-ica探针对no
·
的检测具有良好的选择性。
[0040]
(5)n,s-cds@zn-ica探针对细胞外源性no
·
的荧光成像，具体如下：
[0041]
首先将mcf-7细胞均匀接种于24孔板中的9孔(每孔5
×
104)过夜培养至贴壁。然后将n,s-cds@zn-ica探针(100mg/l)分别添加到每孔培养基中，继续培养2h后去除培养基后，用倒置荧光显微镜(日本奥林巴斯)进行成像观察。然后每孔细胞中再加入含有40μm snp的dmem培养基孵育30min，随后用pbs清洗细胞两次，再将上述9孔细胞平分为三组继续在新配制的dmem培养基中分别培养0h、6h和12h后，用倒置荧光显微镜(日本奥林巴斯)进行成像观察。
[0042]
snp是一种有效的医用级一氧化氮供体，微摩级浓度的snp可以持续释放纳摩尔级浓度的一氧化氮自由基，对于外源性no
·
成像实验，直接将细胞与snp共同孵育。从图5a b1-b2可以看出，加入40μμsnp孵育30min后细胞荧光强度相比于空白对照组a1-a2明显降低。但将含有snp的培养基去除掉后，继续将细胞在新鲜配制的培养基中分别孵育6h和12h小时后，细胞内荧光信号逐渐恢复(如图5a c1-c2、d1-d2)，如图5b所示细胞平均荧光强度也相应增加，可能是由于细胞内高浓度(～5mm)的谷胱甘肽(gsh)及其它含有半胱氨酸残基的多肽结构与no
·
竞争反应形成亚硝基硫醇，阻碍了n,s-cds@zn-ica探针对no
·
的响应，使其荧光恢复，表明该探针可用于细胞外源性no
·
动态变化的荧光成像，可以作为一种灵敏的无创监测活细胞外源性no
·
的工具。
[0043]
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，然其并非用以限制本发明。有关技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此凡采取等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

技术特征：
1.一种用于一氧化氮自由基检测与成像的复合荧光探针的合成方法，其特征在于，具体如下：s1：将咪唑-2-甲醛加入谷胱甘肽水溶液中，得到第一溶液，随后向其中加入含1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的甲醇溶液，充分搅拌后再加入含n-羟基琥珀酰亚胺的甲醇溶液，继续搅拌，最后滴加氮,硫掺杂碳量子点溶液，反应后得到n,s-cds@ica溶液；s2：将所述n,s-cds@ica溶液与甲醇混合，接着在搅拌条件下加入含咪唑-2-甲醛的甲醇溶液，随后加入硝酸锌溶液充分混合；将产物高速离心后收集沉淀，清洗后将沉淀重新分散于无水乙醇中，得到用于一氧化氮自由基检测与成像的复合荧光探针。2.根据权利要求1所述的用于一氧化氮自由基检测与成像的复合荧光探针的合成方法，其特征在于，所述氮,硫掺杂碳量子点溶液的制备方法如下：分别称取200mg邻苯二胺和130mg尿素，加入30ml 2.8mol/l硫酸溶液超声溶解，得到第二溶液；将所述第二溶液转移到聚四氟乙烯内衬的高压反应釜中，于210℃反应8h得到第三溶液；将所述第三溶液冷却到室温后，在9000rpm转速下离心10min去除杂质，取上清液通过0.22μm微孔滤膜后再用纤维素酯膜透析20h，氮,硫掺杂碳量子点在透析袋内呈黑色沉淀状析出；随后以转速10000rpm离心10min，再用10ml无水乙醇溶解得到氮,硫掺杂碳量子点溶液。3.根据权利要求1所述的用于一氧化氮自由基检测与成像的复合荧光探针的合成方法，其特征在于，所述氮,硫掺杂碳量子点溶液和复合荧光探针均置于4℃保存。4.根据权利要求1所述的用于一氧化氮自由基检测与成像的复合荧光探针的合成方法，其特征在于，所述步骤s1具体如下：将368.4mg的谷胱甘肽溶于60ml超纯水中，加入1ml 2m氢氧化钠溶液，得到谷胱甘肽水溶液；然后将115mg的咪唑-2-甲醛加入所述谷胱甘肽水溶液中搅拌过夜，得到第一溶液；取20ml所述第一溶液，向其中加入5ml含1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐65mg的甲醇溶液，充分搅拌30min，再加入5ml含n-羟基琥珀酰亚胺40mg的甲醇溶液，继续搅拌20min，最后滴加1ml所述氮,硫掺杂碳量子点溶液，搅拌过夜得到n,s-cds@ica溶液。5.根据权利要求1所述的用于一氧化氮自由基检测与成像的复合荧光探针的合成方法，其特征在于，所述步骤s2具体如下：取24ml所述n,s-cds@ica溶液与20ml甲醇混合，快速搅拌下加入含咪唑-2-甲醛7.2ml的甲醇溶液，然后加入0.9ml 100mm的硝酸锌溶液混合并持续搅拌40min；将产物经10000rpm转速离心12min后收集，并用甲醇和超纯水各洗涤3次，所得黄棕色沉淀重新分散于10ml无水乙醇中，得到复合荧光探针。6.一种利用权利要求1～5任一所述合成方法得到的用于一氧化氮自由基检测与成像的复合荧光探针。

技术总结
本发明公开了一种用于一氧化氮自由基检测与成像的复合荧光探针及合成方法，属于分析与环境健康领域。合成方法包括将咪唑-2-甲醛加入谷胱甘肽水溶液中，随后向其中加入含1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的甲醇溶液，充分反应后再滴加氮,硫掺杂碳量子点溶液，反应后得到N,S-CDs@ICA溶液；将N,S-CDs@ICA溶液与甲醇混合，接着在搅拌条件下加入含咪唑-2-甲醛的甲醇溶液，随后加入硝酸锌溶液充分混合；将产物高速离心后收集沉淀，清洗后将沉淀重新分散于无水乙醇中，得到用于一氧化氮自由基检测与成像的复合荧光探针。本发明提高了探针的选择性、稳定性和响应速度，合成了高灵敏、高选择性快速检测NO


技术研发人员：童裳伦 张萌
受保护的技术使用者：浙江大学
技术研发日：2023.04.04
技术公布日：2023/8/23