基于pt-NGS的心脏感染病原体检测引物组、试剂盒及方法与流程

基于pt-ngs的心脏感染病原体检测引物组、试剂盒及方法
技术领域
1.本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及基于pt-ngs的心脏感染病原体检测引物组、试剂盒及方法。
技术背景
2.心肌炎是常见的心肌炎性疾病，占青少年猝死病因的42％，也是心脏移植最常见的适应征。病毒是导致感染性心肌炎的最常见病因，可通过心肌活检组织pcr测序明确病原体。中国人心肌炎的病原体分布情况尚不清楚。由于病原不明，心肌炎的治疗策略目前仅以对症支持为主，患者可能进展至心肌病和终末期心衰。
3.临床迫切需要一种能够快速明确心脏是否存在现症感染的检测方法。既往研究发现，嗜心肌病毒可能仅在组织中复制表达，而外周血核酸检测阴性。心肌活检是明确组织感染的唯一途径，但检测心脏病原存在下述困难：
4.1、活检组织中病原核酸量少，传统测序方法只能检测几种特定病毒，可能导致漏诊。
5.2、rna病毒离体后不易保存，现有临床手段无法检测嗜心肌rna病毒。
6.3、目前国内尚无检测嗜心肌病毒的成品panel(基因组合/基因包)。
7.4、细菌、真菌、原虫多种病原微生物可导致心肌炎，但检测这些病原体需要更多组织，并采取病原培养等不同原理的检测方法，耗时较长，时效性难以满足临床需求。
8.与非靶向的宏基因组测序所使用的核酸片段随机测序法不同，基于二代测序的病原靶向测序(pathogen targeted ngs，pt-ngs)使用大量针对目标病原体的引物对样品中的核酸进行多重pcr扩增，再通过高通量测序对扩增产物进行同步定量分析。前期该技术已成功应用于呼吸道和脑脊液的病原体检测。鉴于ptngs结合了pcr检测的高灵敏度以及测序反应的高特异性，特别适于应用于微量样本，将该技术应用于心脏感染病原体检测极具潜力。
9.目前关于心肌炎病原体分布的文献均来自于国外，常见病毒包括细小病毒b19及柯萨奇病毒b组。但中国人群心肌炎的病原谱尚不清楚。由于缺乏敏感高效的心肌病原检测手段，目前对于感染性心肌炎病因治疗手段有限。
10.为了开发批量检测心脏病原体的试剂盒，前期申请人团队尝试了另一种相对应用广泛的二代测序方法——宏基因组测序，该技术已被应用于心内膜炎、中枢神经感染的病原学诊断。但结果显示该方法造价昂贵且易受人源核酸片段干扰。


技术实现要素：

11.针对上述存在的技术局限性，为了降低测序成本，避免人源核酸序列干扰，加快检测流程，及时迅速指导临床用药，本发明提出了基于pt-ngs的心脏感染病原体检测引物组、试剂盒及方法；其是申请人通过查找文献并结合前期的实验结果，采用pt-ngs原理，个性化定制了一款全面检测嗜心肌病毒、细菌、真菌、寄生虫及其他微生物的心脏病原体检测流
程；并形成试剂盒向临床推广，解决无法批量鉴定心脏感染病原体的临床痛点，将中国心肌炎的诊断检测水平提升至国际一流水平，克服了

背景技术：
中提到的不足和缺陷。
12.为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
13.本发明的发明点是提供了基于pt-ngs的心脏感染病原体检测引物组，包括第1引物对至第103引物对，其中，第n引物对由seq id no.(2n-1)所示的第n正向扩增引物和seq id no.2n所示的第n反向扩增引物组成，n＝1～103。
14.具体的，所述心脏感染病原体检测引物组包括如下表1所示的引物对。
15.表1表1
16.具体如表2所示。
17.表2
18.可选地，上述的基于pt-ngs的心脏感染病原体检测引物组，每条正向扩增引物的5'端连接有seq id no.207所示的正向通用引物，每条反向扩增引物的5'端连接有seq id no.208所示的反向通用引物。
19.正向通用引物seq id no.207：
20.caagcagaagacggcatacgagat；
21.反向通用引物seq id no.208：
22.aatgatacggcgaccaccgagatctacac。
23.可选地，上述的基于pt-ngs的心脏感染病原体检测引物组，还包括有接头引物对，接头引物对为seq id no.209所示的正向接头引物和seq id no.210所示的反向接头引物。
24.正向接头引物seq id no.209：
25.gtgactggagttccttggcacccgagaattcca；
26.反向接头引物seq id no.210：
27.acactctttccctacacgacgctcttccgatct。
28.本发明的第二个发明点是提供了一种基于pt-ngs的心脏感染病原体检测试剂盒，此种试剂盒包括有上述的心脏感染病原体检测引物组。
29.可选地，上述的基于pt-ngs的心脏感染病原体检测试剂盒，所述试剂盒还包括逆转录酶和dna聚合酶。
30.可选地，上述的基于pt-ngs的心脏感染病原体检测试剂盒，所述试剂盒还包括样本总dna提取试剂、pcr扩增产物纯化磁珠。
31.样本总dna提取试剂可以是任意能够提取样本总dna的试剂、试剂组合或商品化的试剂盒。
32.试剂盒产品的组成成分、规格、数量及保存条件如下表3所示。
33.表3组分名称包装规格(100次)数量保存条件5
×
rt mix400μl/管1-20℃po panel mix400μl管1-20℃3
×
t_enzyme mix1ml管2-20℃iac-po-09100μl1-20℃2pcr barcodexx f15μl8-20℃
2pcr barcodexx r15μl8-20℃dna clean beads8.4ml12-8℃
34.表3中，5
×
rt mix：逆转录酶，用于将rna逆转录为cdna；
35.po panel mix：超多重pcr引物panel；
[0036]3×
t_enzyme mix：dna聚合酶，用于pcr扩增；
[0037]
iac-po：人工合成若干条两端包含与所述扩增子的引物互补配对片段的差异靶标序列，用以提高扩增文库质量(序列选自公开号cn111518879a，名称为《一种提高多重pcr扩增文库质量的方法》的专利)；
[0038]
2pcr barcodexx f&2pcr barcodexx r：用于区分不同样本的标记引物序列；
[0039]
dna clean beads：用于纯化扩增产物的磁珠。
[0040]
2pcr barcodexx f的标记引物，其序列如seq id no.211所示：
[0041]
caagcagaagacggcatacgagatacgcgtacgtgactggagttccttggcacccgagaattcca；
[0042]
2pcr barcodexx r的标记引物，其序列如seq id no.212所示：
[0043]
aatgatacggcgaccaccgagatctacaccgatacagacactctttccctacacgacgctcttccgatct。
[0044]
本发明的第三个发明点是提供了一种非诊断和治疗目的基于pt-ngs的心脏感染病原体检测方法，包括以下步骤：s1.获得待测样本的总dna/rna；s2.将步骤s1中获得的rna逆转录为cdna；s3.以步骤s1获得的总dna和步骤s2中逆转录反应得到的cdna为模板，利用前述的引物组进行超多重pcr扩增；s4.以步骤s3获得的超多重pcr扩增产物以及对照dna作为模板，利用前述的接头引物对进行pcr扩增，对多重pcr扩增产物添加测序接头序列，得到测序文本库；s5.对步骤s4制备好的测序文本库进行质检和定量，并根据文库定量结果进行混库；s6.对步骤s5获得的混库后的测序文本库进行高通量测序，得到测序序列；s7.对测序序列数据进行引物识别，再与病原数据库中的序列进行对比，最终确定样本中的病原体种类和含量；s8.利用下述公式计算病原体近似浓度c：c＝n
×
p/2m
×
102/ml；其中，n为对照dna浓度，m为对照dna reads读取数，p为准确比对上特定病原体靶标的reads读取数。
[0045]
可选地，上述的基于pt-ngs的心脏感染病原体检测方法，步骤s3中，所述超多重pcr扩增的反应体系为：po-05panel mix 4-8μl、3
×
t_enzyme mix10μl、总dna模板5-10μl，补加无核酸酶水至总体积为30μl；超多重pcr的反应条件为：95℃3min；95℃20sec，60℃4min，循环20-28次；72℃5min，反应结束后产物冷却至4℃保存。
[0046]
可选地，上述的基于pt-ngs的心脏感染病原体检测方法，步骤s4中，所述多重pcr扩增的反应体系为：3
×
t_enzyme mix 10μl、2pcr barcodexx f 1μl、2pcr barcodexx r 1μl，补加无核酸酶水至总体积为30μl；多重pcr反应条件为：95℃3min；95℃20sec，58℃
30sec，72℃1min，循环8-12次；72℃5min。
[0047]
本发明中的心脏感染病原体检测方法是基于非诊断和治疗目的的方法。
[0048]
本发明中的待测样本为受试者的体液、组织或血液样本。
[0049]
本发明还提供了前述基于pt-ngs的心脏感染病原体检测引物组在制备适用于本发明所述病原体检测方法的试剂盒中的用途。
[0050]
本发明最终能够通过上述基于pt-ngs的心脏感染病原体检测引物组、试剂盒及方法，定制出适合中国人的病原检测引物谱；以及基于鉴定不同病毒亚型的精度要求，进而可改进一系列测序流程。
[0051]
与现有技术相对比，本发明具有以下优点：本发明提供的基于pt-ngs的心脏感染病原体检测引物组、试剂盒及方法，有效提高了心脏感染病原体检测过程中的pcr检测灵敏度及测序过程的特异性，首次提供了检测嗜心肌病毒的成品panel，大幅增加了可检测病原体的数量，降低了漏检率。同时，此种检测方法所需样本量小、检测时间短，适用于临床治疗的筛查需求。
附图说明
[0052]
图1为本发明一实施例中所实施的基于pt-ngs的心脏感染病原体检测的全流程图。
[0053]
图2为本发明一实施例中，心肌组织样本pt-ngs测序后，病毒和细菌检出频次结果统计。
[0054]
图3为本发明一实施例中，心肌组织样本pt-ngs测序后，背景菌和灰区病原体的检出频次结果统计。
[0055]
图4为本发明一实施例中，外周血样本pt-ngs测序后，病毒和细菌检出频次结果统计。
[0056]
图5为本发明一实施例中，外周血样本pt-ngs测序后，背景菌和灰区病原体的检出频次结果统计。
[0057]
图6为本发明一实施例中，样本心肌炎患者心肌活检结果；
[0058]
其中，图6a显示了心肌间见灶性炎细胞浸润，部分心肌细胞退变、消失，心肌间质纤维增生；图6b显示了心肌组织及外周血ngs测序结果与eb病毒序列符合，病毒载量分别为2
×
102/l(心肌组织)、1
×
102/l(外周血)；图6c、d显示了患者心肌组织ebv核酸经过荧光定量pcr验证，样本的ct值为22.31，弱阳性；患者心肌活检组织中经一代测序和二代测序均发现eb病毒序列；且组织中病毒载量高于外周血，故可排除血液干扰导致的心肌组织假阳性；结合图6a中典型病理特征，患者eb病毒感染导致的心肌炎诊断明确；经静脉丙种球蛋白治疗后患者痊愈出院。
[0059]
图7为本发明一实施例中引物组1(group1)的多重pcr扩增结果曲线，横坐标为循环数，纵坐标为荧光强度rn。
[0060]
图8为本发明一实施例中引物组2(group2)的多重pcr扩增结果曲线，横坐标为循环数，纵坐标为荧光强度rn。
[0061]
图9为本发明一实施例中引物组3(group3)的多重pcr扩增结果曲线，横坐标为循环数，纵坐标为荧光强度rn。
[0062]
图10为本发明一实施例中引物组4(group4)的多重pcr扩增结果曲线，横坐标为循环数，纵坐标为荧光强度rn。
[0063]
图11为本发明一实施例中引物组5(group5)的多重pcr扩增结果曲线，横坐标为循环数，纵坐标为荧光强度rn。
[0064]
图12为本发明一实施例中引物组6(group6)的多重pcr扩增结果曲线，横坐标为循环数，纵坐标为荧光强度rn。
[0065]
图13为本发明一实施例中引物组7(group7)的多重pcr扩增结果曲线，横坐标为循环数，纵坐标为荧光强度rn。
[0066]
图14为本发明一实施例中引物组8(group8)的多重pcr扩增结果曲线，横坐标为循环数，纵坐标为荧光强度rn。
[0067]
图15为本发明一实施例中引物组9(group9)的多重pcr扩增结果曲线，横坐标为循环数，纵坐标为荧光强度rn。
[0068]
图16为本发明一实施例中引物组10(group10)的多重pcr扩增结果曲线，横坐标为循环数，纵坐标为荧光强度rn。
[0069]
图17为本发明一实施例中表4分组中通道1的扩增曲线结果图。
[0070]
图18为本发明一实施例中表4分组中通道2的扩增曲线结果图。
[0071]
图19为本发明一实施例中表4分组中通道3的扩增曲线结果图。
[0072]
图20为本发明一实施例中表4分组中通道4的扩增曲线结果图。
[0073]
图21为本发明一实施例中各组引物的检出限检测结果汇总。
具体实施方式
[0074]
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面对本发明进行进一步详细说明。但是应该理解，此处所描述仅仅用以解释本发明，并不用于限制本发明的范围。
[0075]
除非另有定义，本文所使用的所有的技术术语和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同，本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在限制本发明。本文中所使用的试剂和仪器均商购可得，所涉及的表征手段均可参阅现有技术中的相关描述，本文中不再赘述。
[0076]
为了进一步了解本发明，下面结合最佳实施例对本发明作进一步的详细说明。实施例1
[0077]
基于pt-ngs的心脏感染病原体检测引物组，包括第1引物对至第103引物对，其中，第n引物对由seq id no.(2n-1)所示的第n正向扩增引物和seq id no.2n所示的第n反向扩增引物组成，n＝1～103。
[0078]
具体的，心脏感染病原体检测引物组包括如表1和表2的seq id no.1-seq id no.206所示的引物对。
[0079]
引物组中，每条正向扩增引物的5'端连接有seq id no.207所示的正向通用引物，每条反向扩增引物的5'端连接有seq id no.208所示的反向通用引物。
[0080]
正向通用引物seq id no.207：
[0081]
caagcagaagacggcatacgagat；
[0082]
反向通用引物seq id no.208：
[0083]
aatgatacggcgaccaccgagatctacac。
[0084]
引物组中，还包括有接头引物对，接头引物对为seq id no.209所示的正向接头引物和seq id no.210所示的反向接头引物。
[0085]
正向接头引物seq id no.209：
[0086]
gtgactggagttccttggcacccgagaattcca；
[0087]
反向接头引物seq id no.210：
[0088]
acactctttccctacacgacgctcttccgatct。
[0089]
本发明还提供了包括有上述心脏感染病原体检测引物组的基于pt-ngs的心脏感染病原体检测试剂盒。
[0090]
试剂盒还包括逆转录酶和dna聚合酶。
[0091]
试剂盒还包括样本总dna提取试剂、pcr扩增产物纯化磁珠。
[0092]
样本总dna提取试剂可以是任意能够提取样本总dna的试剂、试剂组合或商品化的试剂盒。
[0093]
试剂盒产品的组成成分、规格、数量及保存条件如前述表3所示。
[0094]
表3中，5
×
rt mix：逆转录酶，用于将rna逆转录为cdna；
[0095]
po panel mix：超多重pcr引物panel；
[0096]3×
t_enzyme mix：dna聚合酶，用于pcr扩增；
[0097]
iac-po：人工合成若干条两端包含与所述扩增子的引物互补配对片段的差异靶标序列，用以提高扩增文库质量(序列选自公开号cn111518879a，名称为《一种提高多重pcr扩增文库质量的方法》的专利)；
[0098]
2pcr barcodexx f&2pcr barcodexx r：用于区分不同样本的标记引物序列；
[0099]
dnaclean beads：用于纯化扩增产物的磁珠。
[0100]
2pcr barcodexx f的标记引物，其序列如seq id no.211所示：
[0101]
caagcagaagacggcatacgagatacgcgtacgtgactggagttccttggcacccgagaattcca；
[0102]
2pcr barcodexx r的标记引物，其序列如seq id no.212所示：
[0103]
aatgatacggcgaccaccgagatctacaccgatacagacactctttccctacacgacgctcttccgatct。
[0104]
本发明还提供了一种非诊断和治疗目的基于pt-ngs的心脏感染病原体检测方法，包括以下步骤：s1.获得待测样本的总dna/rna；s2.将步骤s1中获得的rna逆转录为cdna；s3.以步骤s1获得的总dna和步骤s2中逆转录反应得到的cdna为模板，利用前述的引物组进行超多重pcr扩增；s4.以步骤s3获得的超多重pcr扩增产物以及对照dna作为模板，利用前述的接头引物对进行pcr扩增，对多重pcr扩增产物添加测序接头序列，得到测序文本库；s5.对步骤s4制备好的测序文本库进行质检和定量，并根据文库定量结果进行混库；s6.对步骤s5获得的混库后的测序文本库进行高通量测序，得到测序序列；s7.对测序序列数据进行引物识别，再与病原数据库中的序列进行对比，最终确定
样本中的病原体种类和含量；s8.利用下述公式计算病原体近似浓度c：c＝n
×
p/2m
×
102/ml；其中，n为对照dna浓度，m为对照dna reads读取数，p为准确比对上特定病原体靶标的reads读取数。
[0105]
步骤s3中，超多重pcr扩增的反应体系为：po-05panel mix 4-8μl、3
×
t_enzyme mix 10μl、总dna模板5-10μl，补加无核酸酶水至总体积为30μl；超多重pcr的反应条件为：95℃3min；95℃20sec，60℃4min，循环20-28次；72℃5min，反应结束后产物冷却至4℃保存。
[0106]
步骤s4中，多重pcr扩增的反应体系为：3
×
t_enzyme mix 10μl、2pcr barcodexx f 1μl、2pcr barcodexx r 1μl，补加无核酸酶水至总体积为30μl；多重pcr反应条件为：95℃3min；95℃20sec，58℃30sec，72℃1min，循环8-12次；72℃5min。
[0107]
本发明中的心脏感染病原体检测方法是基于非诊断和治疗目的的方法。
[0108]
本发明中的待测样本为受试者的体液、组织或血液样本。
[0109]
本发明还提供了前述基于pt-ngs的心脏感染病原体检测引物组在制备适用于本发明所述病原体检测方法的试剂盒中的用途。实施例2
[0110]
本发明试剂盒拟通过超多重pcr，对目标病原体的特异区域进行富集，然后利用高通技术获得这些区域的具体序列，再通过生物信息学技术对这些序列进行比对分型，这样对样本量需求低，能同时检测上百种常见的病原体。结果将首次揭示中国人心肌炎病原体分布谱。
[0111]
定制试剂盒开发过程如下：
[0112]
1)病原体列表筛选，通过查找文献和结合前期预实验的经验定制目标病原体列表。
[0113]
2)通过查阅文献和已知数据库(refseq，genebank)设计出对应的引物集。
[0114]
3)有标准株的病原体，购买atcc标准株提取核酸；无标准株的病原体，合成质粒。
[0115]
4)引物panel优化。采用核酸或者质粒，通过pcr+sds page法，进行引物panel验证，若出现引物二聚体、扩增效率过低、引物特异性不高等现象，重新设计合成引物再次验证。
[0116]
5)pcr反应条件优化。为使不同引物有均一的扩增效率，通过pcr+sds page法，摸索不同引物浓度配比，摸索pcr反应buffer(dna聚合酶、mg
2+
离子、dntp、底物核酸)配方&pcr反应程序。
[0117]
6)灵敏度验证。将实施例1步骤s3中，不同病原体(核酸水平或者菌落水平)进行梯度稀释，从核酸水平或菌落水平验证ptngs检测下限(lod)。
[0118]
7)特异性验证。针对seq id no.1中每一种目标病原体，验证ptngs原始数据中，不同病原体核酸序列是否唯一匹配。
[0119]
8)临床真实样本验证。验证临床样本的灵敏度、特异性、阳性预测值、阴性预测值。
[0120]
为保证试剂盒的阳性/阴性预测值，设计对照如下：
[0121]
a)阴性对照组：以心肌肥厚为表型的心肌病患者(根据临床可排除心肌炎)，拟入选10例，心肌活检组织标本及外周血标本进行ptngs测序。
[0122]
b)阳性对照组：血培养阳性的感染性心内膜炎患者，因药物疗效不佳、行瓣膜置换手术，拟入选10例，术中取病变瓣膜及外周血送检ptngs。
[0123]
单次样品检测的全流程图如图1所示。
[0124]
研究人员建立了心肌组织送检流程sop，形成了数据完整的心肌炎临床-影像-生物样本数据库。下列是预实验结果：
[0125]
2021年4月-11月，序贯入组37例心肌炎患者，总计72例样本(包含血样33例和心肌组织标本39例)已进行ptngs预实验，结果显示如图2-图5所示。
[0126]
图2中，组织ptngs测序结果：39份心肌标本中阳性30例，弱阳性8例，阴性1例。检出频次最高的病毒为巨细胞病毒及人疱疹病毒6b型；细菌为嗜麦芽窄食单胞菌。
[0127]
图3中，组织ptngs测序结果：39份心肌标本中最常见的背景污染菌为葡萄球菌属及不动杆菌属。处于灰区的病原体需要结合临床对进行个体化分析，以甄别是否为致病菌(病毒)。
[0128]
图4中，外周血ptngs测序结果：33份血样中阳性28例，弱阳性5例，阴性0例。检出频次最高的病毒为eb病毒、细环病毒、巨细胞病毒及人疱疹病毒；细菌为嗜麦芽窄食单胞菌。
[0129]
图5中，外周血ptngs测序结果：33份血样中最常见的背景污染菌为葡萄球菌属；细环病毒临床意义未明，不排除为背景菌。灰区中，eb病毒及疱疹病毒检出率最高，结合临床分析，部分为致病病毒。实施例3
[0130]
以1例33岁男性患者为例，此患者因发热、胸痛、头痛入院，心肌酶、bnp等心肌损伤及心衰指标显著升高。心肌活检符合典型心肌炎镜下改变，经ptngs测序结果符合eb病毒感染，如图6所示为此心肌炎患者心肌活检结果。图6a：心肌间见灶性炎细胞浸润，部分心肌细胞退变、消失，心肌间质纤维增生。图6b：心肌组织及外周血ngs测序结果与eb病毒序列符合，病毒载量分别为6
×
102/l(心肌组织)、1
×
102/l(外周血)。图6c、d：患者心肌组织ebv核酸经过荧光定量pcr验证，样本的ct值为22.31，弱阳性。据此确诊为eb病毒心肌炎，大剂量免疫球蛋白治疗后患者休克好转，体温降至正常出院。实施例4
[0131]
利用病原体靶向测序(pathogen-targeted next-generation sequencing，ptngs)的方法检测心肌炎患者心肌组织中的病原微生物，其实验室检测环节主要包括以下步骤：
[0132]
一、样本预处理：
[0133]
(1)将心肌组织用无菌手术剪剪碎后，加入2mm粒径的研磨珠和750μl裂解液，采用最大功率研磨5min，使组织匀浆化；
[0134]
(2)将全部匀浆后的样本溶液转移至新的研磨管中(预装0.1mm&0.2mm研磨珠)，采用最大功率研磨5～20min，使所有细胞破裂从而释放核酸。
[0135]
二、核酸提取：
[0136]
(1)将研磨管放在高速离心机中以≥10，000
×
g离心1min，然后转移上清400μl至离心柱1(安装在收集管1上)，8，000
×
g离心1min，弃滤柱1；
[0137]
(2)向滤液中加入1200μldna结合液，充分混匀，取800μl混匀后的溶液加入离心柱2(安装在收集管2上)，10，000
×
g离心1min，弃滤液；
[0138]
(3)更换新的收集管3，加入400μl漂洗液1，10，000g离心1min，弃滤液；
[0139]
(4)继续向滤柱中加入700μl漂洗液2，10，000g离心1min，弃滤液；
[0140]
(5)再次向滤柱中加入200μl漂洗液2，10，000g离心1min，弃滤液；
[0141]
(6)将滤柱安装在一个新的1.5ml离心管上，向离心柱的中央滴加100μl nuclease-free water，静置3min，然后10，000g离心2min以洗脱核酸。
[0142]
三、文库构建：
[0143]
(1)使用上海冰缘医疗科技有限公司的病原体靶向测序建库试剂盒(pathogeno one pro，sj0005)先富集样本中的病原微生物靶序列；反应体系包含：po-05panel mix 4-8μl、3
×
t_enzyme mix 10μl、template 5-10μl，补加nuclease-free water至总体积为30μl；pcr反应条件为：95℃3min，(95℃20sec，60℃4min)
×
20-28个循环，72℃5min，反应结束后产物冷却至4℃保存；
[0144]
(2)加测序接头：上一步产物纯化后，两端加上适配illumina miseq测序平台的接头序列，反应体系包含：3
×
t_enzyme mix 10μl、2pcr barcodexx f 1μl、2pcr barcodexx r 1μl，补加nuclease-free water至总体积为30μl；反应条件为：95℃3min，(95℃20sec，58℃30sec，72℃1min)
×
8-12个循环，72℃5min；反应结束后，产物再次经过纯化即得到制备好的病原体靶向测序文库。
[0145]
四、文库质检与混合：
[0146]
将制备好的文库进行电泳质检，分析文库片段大小，正常的文库约为200-400bp，且无明细的二聚体和非特异性条带，然后再使用qubit4.0荧光计准确定量文库浓度，按照文库的定量结果进行混库。
[0147]
五、上机测序：
[0148]
混库准确定量后稀释至4nm，然后取5μl稀释后的文库加入5μl新鲜配制的0.2n的naoh，混匀瞬离后室温放置5min使文库变性；变性后的文库调整至最适上机浓度，然后使用illumina miseq reagent nano kit进行高通量测序，测序平台为：illumina miseq，测序读长为pe75。
[0149]
六、数据分析：
[0150]
下机的原始数据首先进行接头识别，识别出接头的reads砍掉接头以及后续序列，然后进行低质量过滤，保留高质量数据；对高质量数据进行引物识别，保留双端正确比对的reads再与病原数据库进行比对，最终确定样本中的病原体种类和含量。实施例5
[0151]
为了验证本发明所提供的检测引物组中各个引物的具体性能，还利用rt-pcr对引物能力进行测试，引物分组如表4所示。
[0152]
表4
通道通道1通道2通道3通道4波长530nm580nm610nm660nm染料famvictexas redcy5group1eb病毒白色念珠菌肺炎衣原体粪肠球菌group2结核分枝杆菌复合群金黄色葡萄球菌巨细胞病毒柯萨奇病毒a16group3肠道病毒a71单纯疱疹病毒1型单纯疱疹病毒2型呼吸道合胞病毒a/bgroup4流感嗜血杆菌沙门氏菌属水痘-带状疱疹病毒腺病毒
group52019新型冠状病毒埃可病毒细小病毒b19疱疹病毒6型(hhv6)group6hiv病毒甲型流感病毒乙型流感病毒流行性腮腺炎病毒group7麻疹病毒风疹病毒禽流感病毒黄热病毒group8伯氏疏螺旋体梅毒螺旋体克氏锥虫肺炎支原体group9草绿色链球菌牛链球菌放线菌肺炎克雷伯菌group10细环病毒人疱疹病毒7型wu多瘤病毒dna内参
[0153]
依据表4的分组，对每组引物进行了无干扰的多重pcr以检测引物的性能。group1～group10的多重扩增结果如图7-图16所示。
[0154]
四个通道(通道1-4)的扩增曲线如图17-图20所示，通过标准曲线列出线性方程，计算扩增效率e＝10-1
/斜率-1
，由扩增效率计算结果可知：
[0155]
1)所有靶标在多重pcr中的扩增效率e均介于90％～110％之间，扩增效率适中，说明反应体系和反应条件比较合适；
[0156]
2)线性方程的r2值均》0.98，且非常趋近于1，说明数据线性关系好，结果可重复性高，且不同浓度的初始模板均具有相同的扩增效率。
[0157]
同时，依据上述表4的分组，还对引物的检测下限(检测限、检出限、lod)进行了测试，测试结果如图21所示。检测过程中，模拟模板浓度分别为：1、2、4、6拷贝，具体如表5所示。
[0158]
表5
[0159]
检出限检测过程：
[0160]
按照每20μl反应体系加入8μl模板，大约相当于0.25～0.5拷贝/μl的模板浓度，假设上样量200μl，洗脱体积50μl，考虑核酸抽提效率，则lod约为：100～300拷贝/ml样本。
[0161]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.基于pt-ngs的心脏感染病原体检测引物组，其特征在于，包括第1引物对至第103引物对，其中，第n引物对由seq id no.(2n-1)所示的第n正向扩增引物和seq id no.2n所示的第n反向扩增引物组成，n＝1～103。2.根据权利要求1所述的基于pt-ngs的心脏感染病原体检测引物组，其特征在于，每条正向扩增引物的5'端连接有seq id no.207所示的正向通用引物，每条反向扩增引物的5'端连接有seq id no.208所示的反向通用引物。3.根据权利要求2所述的基于pt-ngs的心脏感染病原体检测引物组，其特征在于，还包括有接头引物对，接头引物对为seq id no.209所示的正向接头引物和seq id no.210所示的反向接头引物。4.一种基于pt-ngs的心脏感染病原体检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-3任一所述的心脏感染病原体检测引物组。5.根据权利要求4所述的基于pt-ngs的心脏感染病原体检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括逆转录酶和dna聚合酶。6.根据权利要求5所述的基于pt-ngs的心脏感染病原体检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括样本总dna提取试剂、pcr扩增产物纯化磁珠。7.一种非诊断和治疗目的基于pt-ngs的心脏感染病原体检测方法，其特征在于，包括以下步骤：s1.获得待测样本的总dna/rna；s2.将步骤s1中获得的rna逆转录为cdna；s3.以步骤s1获得的总dna和步骤s2中逆转录反应得到的cdna为模板，利用权利要求2所述的引物组进行超多重pcr扩增；s4.以步骤s3获得的超多重pcr扩增产物以及对照dna作为模板，利用权利要求3所述的接头引物对进行pcr扩增，对多重pcr扩增产物添加测序接头序列，得到测序文本库；s5.对步骤s4制备好的测序文本库进行质检和定量，并根据文库定量结果进行混库；s6.对步骤s5获得的混库后的测序文本库进行高通量测序，得到测序序列；s7.对测序序列数据进行引物识别，再与病原数据库中的序列进行对比，最终确定样本中的病原体种类和含量；s8.利用下述公式计算病原体近似浓度c：c＝n
×
p/2m
×
102/ml；其中，n为对照dna浓度，m为对照dna reads读取数，p为准确比对上特定病原体靶标的reads读取数。8.根据权利要求7所述的基于pt-ngs的心脏感染病原体检测方法，其特征在于，步骤s3中，所述超多重pcr扩增的反应体系为：po-05panel mix 4-8μl、3
×
t_enzyme mix 10μl、总dna模板5-10μl，补加无核酸酶水至总体积为30μl；超多重pcr的反应条件为：95℃3min；95℃20sec，60℃4min，循环20-28次；72℃5min，反应结束后产物冷却至4℃保存。9.根据权利要求7所述的基于pt-ngs的心脏感染病原体检测方法，其特征在于，步骤s4中，所述多重pcr扩增的反应体系为：3
×
t_enzyme mix 10μl、2pcr barcodexx f 1μl、2pcr barcodexx r 1μl，补加无核酸酶水至总体积为30μl；多重pcr反应条件为：95℃3min；95℃20sec，58℃30sec，72℃1min，循环8-12次；72℃5min。

技术总结
本发明提供了基于pt-NGS的心脏感染病原体检测引物组，包括第1引物对至第103引物对，其中，第n引物对由SEQ ID No.(2n-1)所示的第n正向扩增引物和SEQ ID No.2n所示的第n反向扩增引物组成，n＝1～103；还公开了包含此引物组的试剂盒及方法。与现有技术相对比，本发明具有以下优点：本发明提供的基于pt-NGS的心脏感染病原体检测引物组、试剂盒及方法，有效提高了心脏感染病原体检测过程中的PCR检测灵敏度及测序过程的特异性，首次提供了检测嗜心肌病毒的成品panel，大幅增加了可检测病原体的数量，降低了漏检率。同时，此种检测方法所需样本量小、检测时间短，适用于临床治疗的筛查需求。适用于临床治疗的筛查需求。适用于临床治疗的筛查需求。


技术研发人员：刘颖娴 徐希奇 荆志成 郭帆 方理刚
受保护的技术使用者：上海冰缘医疗科技有限公司
技术研发日：2023.03.29
技术公布日：2023/8/23