槲皮素通过SCAP/SREBP2/NLRP3通路减轻脂多糖诱导的急性肺损伤的影响

槲皮素通过scap/srebp2/nlrp3通路减轻脂多糖诱导的急性肺损伤的影响
技术领域
1.本发明属于生物技术技术领域，具体的说是槲皮素通过scap/srebp2/nlrp3通路减轻脂多糖诱导的急性肺损伤的影响。


背景技术：

2.急性肺损伤(acutelunginjury，ali)和急性呼吸窘迫综合征(acuterespiratorydistresssyndrome，ards)是由多种致病因素导致的以顽固性低氧血症为特征的临床综合征；作为一种急性炎症性疾病，主要表现为肺组织炎症损伤，伴发非心源性呼吸困难、严重低氧血症、肺水肿，发病率和死亡率均较高，长期研究仍然未能对其病理生理机制得出确切的结论，早期识别ards是诊治的关键，学界经过长期研究制定出了目前得到广泛认可的“柏林定义”，其有效的指导了如何处理这一临床危重症。
3.肺炎和脓毒症是诱发急性肺损伤的重要因素，中性粒细胞在炎症过程中释放大量炎症因子，放大形成炎症风暴反应导致肺泡上皮及肺微血管内皮损伤，引起弥漫性肺部损伤。含炎症细胞的水肿液在肺泡腔形成，进而使得肺水肿及透明膜形成，导致肺泡换气障碍。
4.研究表明nlrp3炎症小体激活，从而启动细胞分泌成熟形式的il-1β，以促进炎症过程和氧化应激，加重内皮损伤，有研究证实，srebp2在动脉粥样硬化易发血流介导的nlrp3炎性小体激活中起到了关键作用，从而导致炎症因子释放加重血管内皮细胞炎症，而对srebp2抑制则可以有效降低nlrp3的表达。
5.槲皮素作为一种天然生物类黄酮化合物槲皮素具有抗纤维化、抗病毒、抗癌、抗炎和抗氧化的特性，研究表明使用槲皮素可通过降低scap、srebp2从而有效减轻炎症损伤，此外研究证实槲皮素可以通过协调nlrp3炎症体的信号，抑制脂多糖诱导的nlrp3炎症相关蛋白的表达以及后续炎症反应，然而槲皮素在ards中的作用及机制尚未阐明，因此，本研究探讨槲皮素在小鼠急性肺损伤中的作用及对scap/srebp2/nlrp3通路介导的炎症反应调节影响，为ards的治疗提供理论依据；为此，本发明提供槲皮素通过scap/srebp2/nlrp3通路减轻脂多糖诱导的急性肺损伤的影响。


技术实现要素：

6.为了弥补现有技术的不足，解决上述背景技术中所提的问题，本发明提出的槲皮素通过scap/srebp2/nlrp3通路减轻脂多糖诱导的急性肺损伤的影响。
7.本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：本发明所述的槲皮素通过scap/srebp2/nlrp3通路减轻脂多糖诱导的急性肺损伤的影响,该影响研究方法如下所示：
8.s1：实验动物分组与处理；
9.s2：细胞培养及其分组；
10.s3：实验动物肺湿干比(w/d)评估肺水肿及其支气管肺泡灌洗液
(bronchoalveolar lavage fluid，balf)收集；
11.s4：实验动物肺组织病理学观察；
12.s5：elisa法检测肿瘤坏死因子-α(tnf-α)、白细胞介素-6(il-6)、和白细胞介素-1β(il-1β)水平；
13.s6：westernblot检测通路蛋白；
14.s7：qpcr检测相关核酸表达；
15.s8：流式细胞术检测细胞死亡率与统计学处理使用graphpadprism9.0软件统计分析。
16.优选的，所述s1中实验动物分组与处理的方法如下所示：
17.a1：将40只雄性c57bl/6小鼠随机分为对照组、lps组、lps+que组和que组，每组10只，其中lps为脂多糖，que为槲皮素；
18.a2：其中lps+que组和que组小鼠分别腹腔注射100mg/kg的槲皮素溶液，lps组和对照组注射等量pbs缓冲液；
19.a3：1h后，使用50mg/kg戊巴比妥麻醉四组小鼠后，对固定小鼠行气管插管，对lps组、lps+que组小鼠经气管插管滴注5mg/kg、总体积100μl的lps，同时对照组和que组按照上述操作滴注同等体积的无菌pbs缓冲液；
20.a4：滴注后竖立小鼠2-3min使溶液在肺部充分沉淀，于造模24h后处死小鼠，收集标本进行检测。
21.优选的，所述s2中细胞培养与分组如下所示：
22.b1：将huvecs细胞用含10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素的1640培养基在37℃、5％co2细胞培养箱中培养，其中将huvecs细胞是指人脐静脉内皮细胞；
23.b2：将细胞分为4组：对照组、lps组、lps+que组和que组，其中lps+que组和que组先用槲皮素(30mmol/l)处理1h，然后lps组和lps+que组用lps(1μg/ml)处理24h，最后收集上述四组细胞进行进一步实验。
24.优选的，所述s3中实验动物肺湿干比(w/d)评估肺水肿：将s1中的四组小鼠处死后，取左肺组织，将之置于事先称重的锡箔纸上称量肺湿重(wetweight,w)，后再将样本置于80℃烤箱48h至恒重后，称量其干重(dryweight,d)，通过w/d计算肺组织的干湿比；所述s3中支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，balf)收集：将s1中四组小鼠麻醉后气管插管，用1mlpbs缓冲液冲洗肺部3-5次以收集balf，让获取的balf以1500rpm在4℃条件下离心15min后取上清液，收集的上清液储存在-80℃冰箱备用。
25.优选的，所述s4中实验动物肺组织病理学观察如下所示
26.c1：取小鼠右肺，浸入4％多聚甲醛中24h；
27.c2：然后用不同浓度的乙醇溶液对标本脱水处理，石蜡包埋，切成5-7μm厚的切片，接着二甲苯脱蜡，苏木精伊红(he)染色；
28.c3：染色完成后，脱水封片，然后镜下观察小鼠肺组织形态。
29.优选的，所述s5中elisa法检测肿瘤坏死因子-α(tnf-α)、白细胞介素-6(il-6)、和白细胞介素-1β(il-1β)水平：按照elisa试剂盒说明书操作，测定s3中各组小鼠balf(即肺泡灌洗液)和细胞培养基(上清液)中tnf-α、il-6、和il-1β的水平。
30.优选的，所述s6中westernblot检测通路蛋白如下所示：
31.d1：取小鼠肺组织和huvecs细胞，使用含有pmsf的ripa缓冲液从肺组织或细胞中提取蛋白质，并使用bca试剂盒测定蛋白质浓度；
32.d2：定量后加入上样缓冲液，在沸水中变性10min，-20℃储存备用；
33.d3：配制10％sds-page凝胶，每孔加入50μg蛋白样品，电泳后转膜至pvdf膜，用含5％脱脂奶粉的tbst封闭1h，加入相应的一抗4℃孵育过夜；tbst缓冲液洗膜3次，加入二抗37℃孵育1h，tbst缓冲液洗膜3次，超敏发光液显影曝光，用imagej软件系统对蛋白条带灰度值进行分析。
34.优选的，所述qpcr检测相关核酸表达：
35.e1：取小鼠肺组织和huvecs，加入rnaiso充分混匀，经异丙醇沉淀、75％乙醇洗涤后，用depc水溶解。用核酸分析仪检测其浓度，将rna逆转录为cdna；
36.e2：引物序列：scap上游5'-gcatcacagcccttgtcttc-3'下游5'-cactgtgttgctgctgctgta-3'；srebp2上游
37.5'-gtcgatcaagtcagcagccaag-3'下游
38.5'-ttggcctgaggtttcaccaag-3'；nlrp3上游5'-tacggccgtctacgtcttct-3'下游5'-cgcagatcacactcctcaaa-3'；gapdh上游5'-tgtgtccgtcgtggatctga-3'下游
39.5'-ttgctgttgaagtcgcaggag-3'。
40.优选的，所述s8中流式细胞术检测细胞死亡率采用annexinv-fitc/pi凋亡检测试剂盒测定细胞死亡率，将huvecs细胞重悬于500μl的结合缓冲液再用fitc标记的annexinv(5μl)和pi(5μl)在室温避光孵育15-20min，用流式细胞仪测定细胞死亡率；所述s8中统计学处理使用graphpadprism9.0软件统计分析，计量资料以x
±
s表示，组间比较采用单因素方差分析，组内两两比较采用lsd-t检验，p＜0.05为差异有统计学意义。
41.本发明的有益效果如下：
42.1.本发明所述的槲皮素通过scap/srebp2/nlrp3通路减轻脂多糖诱导的急性肺损伤的影响，通过实验方法表达槲皮素在小鼠急性肺损伤中的作用及对scap/srebp2/nlrp3通路介导的炎症反应调节影响，为ards的治疗提供理论依据。
附图说明
43.下面结合附图对本发明作进一步说明。
44.图1是he染色观察肺组织病理学改变；
45.图2是槲皮素对lps造模小鼠肺组织水肿和炎症反应的影响；
46.图3是检测小鼠肺组织scap/srebp2/nlrp3核酸及蛋白水平；
47.图4是槲皮素对huvecs细胞活性和炎症因子水平的影响；
48.图5是检测huvecs中scap/srebp2/nlrp3核酸及蛋白水平；
具体实施方式
49.为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。
50.该影响研究方法如下所示：
51.s1：实验动物分组与处理；
52.s2：细胞培养及其分组；
53.s3：实验动物肺湿干比(w/d)评估肺水肿及其支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，balf)收集；
54.s4：实验动物肺组织病理学观察；
55.s5：elisa法检测肿瘤坏死因子-α(tnf-α)、白细胞介素-6(il-6)、和白细胞介素-1β(il-1β)水平；
56.s6：westernblot检测通路蛋白；
57.s7：qpcr检测相关核酸表达；
58.s8：流式细胞术检测细胞死亡率与统计学处理使用graphpadprism9.0软件统计分析。
59.所述s1中实验动物分组与处理的方法如下所示：
60.a1：将40只雄性c57bl/6小鼠随机分为对照组、lps组、lps+que组和que组，每组10只，其中lps为脂多糖，que为槲皮素；
61.a2：其中lps+que组和que组小鼠分别腹腔注射100mg/kg的槲皮素溶液，lps组和对照组注射等量pbs缓冲液；
62.a3：1h后，使用50mg/kg戊巴比妥麻醉四组小鼠后，对固定小鼠行气管插管，对lps组、lps+que组小鼠经气管插管滴注5mg/kg、总体积100μl的lps，同时对照组和que组按照上述操作滴注同等体积的无菌pbs缓冲液；
63.a4：滴注后竖立小鼠2-3min使溶液在肺部充分沉淀，于造模24h后处死小鼠，收集标本进行检测。
64.所述s2中细胞培养与分组如下所示：
65.b1：将huvecs细胞用含10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素的1640培养基在37℃、5％co2细胞培养箱中培养，其中将huvecs细胞是指人脐静脉内皮细胞；
66.b2：将细胞分为4组：对照组、lps组、lps+que组和que组，其中lps+que组和que组先用槲皮素(30mmol/l)处理1h，然后lps组和lps+que组用lps(1μg/ml)处理24h，最后收集上述四组细胞进行进一步实验。
67.所述s3中实验动物肺湿干比(w/d)评估肺水肿：将s1中的四组小鼠处死后，取左肺组织，将之置于事先称重的锡箔纸上称量肺湿重(wetweight,w)，后再将样本置于80℃烤箱48h至恒重后，称量其干重(dryweight,d)，通过w/d计算肺组织的干湿比；所述s3中支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，balf)收集：将s1中四组小鼠麻醉后气管插管，用1mlpbs缓冲液冲洗肺部3-5次以收集balf，让获取的balf以1500rpm在4℃条件下离心15min后取上清液，收集的上清液储存在-80℃冰箱备用。
68.所述s4中实验动物肺组织病理学观察如下所示
69.c1：取小鼠右肺，浸入4％多聚甲醛中24h；
70.c2：然后用不同浓度的乙醇溶液对标本脱水处理，石蜡包埋，切成5-7μm厚的切片，接着二甲苯脱蜡，苏木精伊红(he)染色；
71.c3：染色完成后，脱水封片，然后镜下观察小鼠肺组织形态。
72.所述s5中elisa法检测肿瘤坏死因子-α(tnf-α)、白细胞介素-6(il-6)、和白细胞介素-1β(il-1β)水平：按照elisa试剂盒说明书操作，测定s3中各组小鼠balf(即肺泡灌洗
液)和细胞培养基(上清液)中tnf-α、il-6、和il-1β的水平。
73.所述s6中westernblot检测通路蛋白如下所示：
74.d1：取小鼠肺组织和huvecs细胞，使用含有pmsf的ripa缓冲液从肺组织或细胞中提取蛋白质，并使用bca试剂盒测定蛋白质浓度；
75.d2：定量后加入上样缓冲液，在沸水中变性10min，-20℃储存备用；
76.d3：配制10％sds-page凝胶，每孔加入50μg蛋白样品，电泳后转膜至pvdf膜，用含5％脱脂奶粉的tbst封闭1h，加入相应的一抗4℃孵育过夜；tbst缓冲液洗膜3次，加入二抗37℃孵育1h，tbst缓冲液洗膜3次，超敏发光液显影曝光，用imagej软件系统对蛋白条带灰度值进行分析。
77.所述qpcr检测相关核酸表达：
78.e1：取小鼠肺组织和huvecs，加入rnaiso充分混匀，经异丙醇沉淀、75％乙醇洗涤后，用depc水溶解。用核酸分析仪检测其浓度，将rna逆转录为cdna；
79.e2：引物序列：scap上游5'-gcatcacagcccttgtcttc-3'下游5'-cactgtgttgctgctgctgta-3'；srebp2上游
80.5'-gtcgatcaagtcagcagccaag-3'下游
81.5'-ttggcctgaggtttcaccaag-3'；nlrp3上游5'-tacggccgtctacgtcttct-3'下游5'-cgcagatcacactcctcaaa-3'；gapdh上游5'-tgtgtccgtcgtggatctga-3'下游
82.5'-ttgctgttgaagtcgcaggag-3'。
83.所述s8中流式细胞术检测细胞死亡率采用annexinv-fitc/pi凋亡检测试剂盒测定细胞死亡率，将huvecs细胞重悬于500μl的结合缓冲液再用fitc标记的annexinv(5μl)和pi(5μl)在室温避光孵育15-20min，用流式细胞仪测定细胞死亡率；所述s8中统计学处理使用graphpadprism9.0软件统计分析，计量资料以x
±
s表示，组间比较采用单因素方差分析，组内两两比较采用lsd-t检验，p＜0.05为差异有统计学意义。
84.小鼠肺组织病理学损伤：
85.造模24h后，he染色结果如图1显示，图1a对照组和图1dque组肺泡结构基本完整，间隔不厚，肺泡间质无明显；与对照组比较，图1blps组小鼠肺泡正常结构明显破坏，其内可见明显出血及炎症细胞浸润，间隔增厚；与图1blps组小鼠比较，图1clps+que组小鼠肺组织结构破坏减轻，肺泡结构可见，出血及炎症细胞浸润减少。
86.小鼠肺组织湿/干重比值：
87.如图2a展示肺组织w/d值能够有效反映肺水肿程度，与对照组相比，lps组w/d值有明显增高(p＜0.05)，与lps组比较，lps+que组w/d值显示存在降低(p＜0.05)，这表明使用que可以缓解lps造模小鼠肺水肿程度，图2a：肺组织湿/干重比。
88.肺泡灌洗液中总蛋白质、总细胞数：
89.如2b-c所示，造模24小时后麻醉小鼠取balf，相较于对照组，lps组balf蛋白含量和总细胞数明显升高(p＜0.05)；相较于lps组，lps+que组balf蛋白含量和总细胞数明显降低(p＜0.05)；表明通过补充que能降低lps造模小鼠肺血管通透性并减轻肺部炎症反应，图2b：balf中的总细胞数；图2c：balf中的总蛋白质浓度。
90.肺泡灌洗液中炎症因子水平：
91.如图2d-f所示，ali的过程中可出现级联放大的炎症反应；肺组织促炎性细胞因子
(il-1β、il-6、tnf-α)的变化反映了机体的炎症水平；elisa结果显示，在小鼠急性肺损伤模型里，balf中il-1β、il-6以及tnf-α显著升高，而通过注射que能显著降低这些炎症因子表达水平(p＜0.05)，图2d：balf中tnf-α的水平；图2e：balf中il-1β的水平；图2f：balf中il-6的水平。
92.如图3a-c所示，经qpcr检测结果显示，与对照组相比较，scap、srebp2及nlrp3在lps组表达均存在升高(p《0.05)，与lps组相比较，lps+que组的scap、srebp2及nlrp3的表达则出现下降，(p《0.05)；同样，如图3d-e所示，由westernblot检测结果得出：与对照组相比较，lps组小鼠肺组scap/srebp2/nlrp3信号通路相关蛋白(scap、srebp2、nlrp3)表达均存在升高(p《0.05)；与lps组相比较，lps+que组的相关蛋白表达水平呈现出降低(p《0.05)，其中图3a：scap核酸表达水平；图3b：srebp2核酸表达水平；图3c：nlrp3核酸表达水平；图3d：小鼠肺组织westernblot检测结果；图3e：scap蛋白相对表达水平；图3f：srebp2蛋白相对表达水平；图3g：nlrp3蛋白相对表达水平。
93.huvecs细胞活力及炎症因子水平：
94.如图4a-f所示，cck-8与流式细胞术检测结果表明：与对照组比较，lps组细胞活力明显下降，死亡率明显增高(p《0.05)；与lps组比较，lps+que组细胞活力明显提高而死亡率则呈现下降(p《0.05)；如图4g-ielisa检测结果显示，与对照组比较，lps组细胞培养基中il-1β、il-6和tnf-α的水平明显增高(p《0.05)；与lps组比较，lps+que组炎症因子的水平则出现降低(p《0.05)，图4a：细胞死亡率；图4b：对照组；图4c：lps组；图4d：lps+que组；图4e：que组；图4f：细胞活性；图4g：huvecs上清液中tnf-α的水平；图4h：huvecs上清液中il-1β的水平；图4i：huvecs上清液中il-6的水平。
95.huvecs细胞scap/srebp2/nlrp3水平：
96.如图5a-c所示，qpcr检测结果显示，与对照组相比，scap、srebp2及nlrp3在lps组表达升高(p《0.05)，与lps组相比较，lps+que组的scap、srebp2及nlrp3的表达降低明显(p《0.05)；如图5d-gwesternblot检测结果表明：与对照组相比，lps组细胞培养基scap、srebp2及nlrp3表达均存在升高(p《0.05)；与lps组相比较，lps+que组的相关蛋白表达降低(p《0.05)，图5a：scap核酸表达水平；图5b：srebp2核酸表达水平；图5c：nlrp3核酸表达水平；图5d：小鼠肺组织westernblot检测结果；图5e：scap蛋白相对表达水平；图5f：srebp2蛋白相对表达水平；图5g：nlrp3蛋白相对表达水平。
97.上述前、后、左、右、上、下均以说明书附图中的图1为基准，按照人物观察视角为标准，装置面对观察者的一面定义为前，观察者左侧定义为左，依次类推。
98.在本发明的描述中，需要理解的是，术语“中心”、“纵向”、“横向”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明保护范围的限制。
99.以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

技术特征：
1.槲皮素通过scap/srebp2/nlrp3通路减轻脂多糖诱导的急性肺损伤的影响，其特征在于，该影响研究方法如下所示：s1：实验动物分组与处理；s2：细胞培养及其分组；s3：实验动物肺湿干比(w/d)评估肺水肿及其支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，balf)收集；s4：实验动物肺组织病理学观察；s5：elisa法检测肿瘤坏死因子-α(tnf-α)、白细胞介素-6(il-6)、和白细胞介素-1β(il-1β)水平；s6：westernblot检测通路蛋白；s7：qpcr检测相关核酸表达；s8：流式细胞术检测细胞死亡率与统计学处理使用graphpadprism9.0软件统计分析。2.根据权利要求1所述的槲皮素通过scap/srebp2/nlrp3通路减轻脂多糖诱导的急性肺损伤的影响，其特征在于，所述s1中实验动物分组与处理的方法如下所示：a1：将40只雄性c57bl/6小鼠随机分为对照组、lps组、lps+que组和que组，每组10只，其中lps为脂多糖，que为槲皮素；a2：其中lps+que组和que组小鼠分别腹腔注射100mg/kg的槲皮素溶液，lps组和对照组注射等量pbs缓冲液；a3：1h后，使用50mg/kg戊巴比妥麻醉四组小鼠后，对固定小鼠行气管插管，对lps组、lps+que组小鼠经气管插管滴注5mg/kg、总体积100μl的lps，同时对照组和que组按照上述操作滴注同等体积的无菌pbs缓冲液；a4：滴注后竖立小鼠2-3min使溶液在肺部充分沉淀，于造模24h后处死小鼠，收集标本进行检测。3.根据权利要求2所述的槲皮素通过scap/srebp2/nlrp3通路减轻脂多糖诱导的急性肺损伤的影响，其特征在于，所述s2中细胞培养与分组如下所示：b1：将huvecs细胞用含10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素的1640培养基在37℃、5％co2细胞培养箱中培养，其中将huvecs细胞是指人脐静脉内皮细胞；b2：将细胞分为4组：对照组、lps组、lps+que组和que组，其中lps+que组和que组先用槲皮素(30mmol/l)处理1h，然后lps组和lps+que组用lps(1μg/ml)处理24h，最后收集上述四组细胞进行进一步实验。4.根据权利要求3所述的槲皮素通过scap/srebp2/nlrp3通路减轻脂多糖诱导的急性肺损伤的影响，其特征在于，所述s3中实验动物肺湿干比(w/d)评估肺水肿：将s1中的四组小鼠处死后，取左肺组织，将之置于事先称重的锡箔纸上称量肺湿重(wetweight,w)，后再将样本置于80℃烤箱48h至恒重后，称量其干重(dryweight,d)，通过w/d计算肺组织的干湿比；所述s3中支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，balf)收集：将s1中四组小鼠麻醉后气管插管，用1mlpbs缓冲液冲洗肺部3-5次以收集balf，让获取的balf以1500rpm在4℃条件下离心15min后取上清液，收集的上清液储存在-80℃冰箱备用。5.根据权利要求4所述的槲皮素通过scap/srebp2/nlrp3通路减轻脂多糖诱导的急性肺损伤的影响，其特征在于，所述s4中实验动物肺组织病理学观察如下所示
c1：取小鼠右肺，浸入4％多聚甲醛中24h；c2：然后用不同浓度的乙醇溶液对标本脱水处理，石蜡包埋，切成5-7μm厚的切片，接着二甲苯脱蜡，苏木精伊红(he)染色；c3：染色完成后，脱水封片，然后镜下观察小鼠肺组织形态。6.根据权利要求5所述的槲皮素通过scap/srebp2/nlrp3通路减轻脂多糖诱导的急性肺损伤的影响，其特征在于，所述s5中elisa法检测肿瘤坏死因子-α(tnf-α)、白细胞介素-6(il-6)、和白细胞介素-1β(il-1β)水平：按照elisa试剂盒说明书操作，测定s3中各组小鼠balf(即肺泡灌洗液)和细胞培养基(上清液)中tnf-α、il-6、和il-1β的水平。7.根据权利要求6所述的槲皮素通过scap/srebp2/nlrp3通路减轻脂多糖诱导的急性肺损伤的影响，其特征在于，所述s6中westernblot检测通路蛋白如下所示：d1：取小鼠肺组织和huvecs细胞，使用含有pmsf的ripa缓冲液从肺组织或细胞中提取蛋白质，并使用bca试剂盒测定蛋白质浓度；d2：定量后加入上样缓冲液，在沸水中变性10min，-20℃储存备用；d3：配制10％sds-page凝胶，每孔加入50μg蛋白样品，电泳后转膜至pvdf膜，用含5％脱脂奶粉的tbst封闭1h，加入相应的一抗4℃孵育过夜；tbst缓冲液洗膜3次，加入二抗37℃孵育1h，tbst缓冲液洗膜3次，超敏发光液显影曝光，用imagej软件系统对蛋白条带灰度值进行分析。8.根据权利要求7所述的槲皮素通过scap/srebp2/nlrp3通路减轻脂多糖诱导的急性肺损伤的影响，其特征在于，所述qpcr检测相关核酸表达：e1：取小鼠肺组织和huvecs，加入rnaiso充分混匀，经异丙醇沉淀、75％乙醇洗涤后，用depc水溶解。用核酸分析仪检测其浓度，将rna逆转录为cdna；e2：引物序列：scap上游5'-gcatcacagcccttgtcttc-3'下游5'-cactgtgttgctgctgctgta-3'；srebp2上游5'-gtcgatcaagtcagcagccaag-3'下游5'-ttggcctgaggtttcaccaag-3'；nlrp3上游5'-tacggccgtctacgtcttct-3'下游5'-cgcagatcacactcctcaaa-3'；gapdh上游5'-tgtgtccgtcgtggatctga-3'下游5'-ttgctgttgaagtcgcaggag-3'。9.根据权利要求8所述的槲皮素通过scap/srebp2/nlrp3通路减轻脂多糖诱导的急性肺损伤的影响，其特征在于，所述s8中流式细胞术检测细胞死亡率采用annexinv-fitc/pi凋亡检测试剂盒测定细胞死亡率，将huvecs细胞重悬于500μl的结合缓冲液再用fitc标记的annexinv(5μl)和pi(5μl)在室温避光孵育15-20min，用流式细胞仪测定细胞死亡率；所述s8中统计学处理使用graphpadprism9.0软件统计分析，计量资料以x
±
s表示，组间比较采用单因素方差分析，组内两两比较采用lsd-t检验，p＜0.05为差异有统计学意义。

技术总结
本发明属于生物技术技术领域，具体的说是槲皮素通过SCAP/SREBP2/NLRP3通路减轻脂多糖诱导的急性肺损伤的影响，包括影响研究方法如下所示：S1：实验动物分组与处理；S2：细胞培养及其分组；S3：实验动物肺湿干比(W/D)评估肺水肿及其支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)收集；S4：实验动物肺组织病理学观察；S5：ELISA法检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、和白细胞介素-1β(IL-1β)水平；S6：Westernblot检测通路蛋白；S7：qPCR检测相关核酸表达；S8：流式细胞术检测细胞死亡率与统计学处理使用GraphPadPrism9.0软件统计分析；本发明以通过实验方法表达槲皮素在小鼠急性肺损伤中的作用及对SCAP/SREBP2/NLRP3通路介导的炎症反应调节影响，为ARDS的治疗提供理论依据。为ARDS的治疗提供理论依据。为ARDS的治疗提供理论依据。


技术研发人员：敬和昆 王导新
受保护的技术使用者：重庆医科大学
技术研发日：2023.03.17
技术公布日：2023/8/23