干酪乳杆菌在制备增强鱼抗寒能力的制剂中的应用

1.本发明涉及鱼类健康养殖技术领域，尤其涉及干酪乳杆菌在制备增强鱼抗寒能力的制剂中的应用。


背景技术：

2.微生物广泛存在于自然界，其中肠道微生物是一个庞大复杂的体内生态系统，被视为机体整体构成中至关重要的一部分。肠道中的许多细菌是有益的，与宿主之间存在着互利共生的关系，具有与内分泌器官相似的功能，可通过处理复杂化合物、提供必需营养素、解毒有害分子、调节发育和免疫等途径使宿主受益。
3.在硬骨鱼类中，微生物主要寄生于皮肤、鳃、肠道以及肠道内容物，其中肠道中的微生物种类最为丰富，而影响鱼类肠道菌群形成的因素也有很多，包括：鱼类的发育阶段、肠道结构、饲养条件、应激因子(化学药物、抗生素、杀虫剂)以及环境因子(比如水温)等。研究表明，鱼类肠道菌群的数量和种类都会随着季节而变动。
4.应激指的是机体在受到有害作用的刺激后引发的非特异防御反应。低温作为重要的环境应激因子，会导致生物的体温迅速下降，并引发生理及行为的级联放大反应。鱼类作为变温动物，其生长、繁殖、能量代谢等对温度的响应更为敏感。许多优良水产养殖鱼类具有不耐低温的缺点，冬季冷害常导致巨大经济损失，严重制约着我国水产养殖业的发展。
5.肠道微生物与环境应激存在着双向的互作机制，环境应激可通过神经内分泌以及改变肠道形态等途径来影响肠道菌群的结构；通过植入抗生素、益生菌可调节机体内肠道微生物组成结构，进而促进宿主抵抗环境刺激。研究表明，肠道菌群可通过多种机制向大脑发出信号，给大鼠饲喂乳酸菌能够显著减少脊髓神经中fos蛋白(一种与应激有关的特征表达蛋白)的数量，能够在神经水平减轻应激对动物造成的不良影响。
6.缺少肠道菌群的小鼠会出现机体温度调节功能的损伤，通过饲喂细菌代谢产物丁酸盐可提高小鼠体内的生热能力，从而逆转肠道菌群缺失所产生的不利影响，说明肠道菌群在哺乳动物机体抵抗寒冷的产热过程中扮演着关键的诱导信号角色。
7.由于肠道菌群的可塑性，利用益生菌和益生元调节肠道微生物稳态已形成巨大的产业规模，特别是乳杆菌、乳酸杆菌、双歧杆菌等已广泛用于水产养殖中。


技术实现要素：

8.为解决上述技术问题，本发明的目的是提供干酪乳杆菌在制备增强鱼抗寒能力的制剂中的应用，为水产鱼类的健康养殖提供了方向。
9.本发明的第一个目的是提供干酪乳杆菌在制备增强鱼抗寒能力的制剂中的应用。
10.优选，所述的干酪乳杆菌是干酪乳杆菌gdmcc1.80，其保藏于广东省微生物菌种保藏中心，编号为gdmcc1.80。
11.优选，所述的干酪乳杆菌可以用mrs肉汤培养基培养获得。进一步优选是用mrs肉汤培养基于37℃培养48h，用无菌pbs洗三次，菌体细胞溶于无菌pbs，浓度为109～10
10
cfu/
ml。
12.优选，所述的鱼为斑马鱼或其它不耐低温鱼，特别是幼苗期到1月龄的斑马鱼或其它不耐低温鱼。
13.本发明的第二个目的是提供一种增强鱼抗寒能力的方法，其包括以下步骤：
14.将干酪乳杆菌添加到鱼生长环境中进行培养，增加鱼抗寒能力。
15.优选，所述的干酪乳杆菌是干酪乳杆菌gdmcc1.80，其保藏于广东省微生物菌种保藏中心，编号为gdmcc1.80。
16.优选，所述的鱼为斑马鱼或其它不耐低温鱼，特别是幼苗期到1月龄的斑马鱼或其它不耐低温鱼。
17.优选，干酪乳杆菌以终浓度为106～107cfu/ml直接添加于养鱼水中，每隔24h换新的养鱼水并添加新的菌液，添加干酪乳杆菌后立即喂食。
18.优选，干酪乳杆菌通过定植在鱼体肠道中，并通过改善肠道内的微生物组成结构，从而增强低温耐受能力。
19.本发明至少具有以下优点：
20.本发明发现干酪乳杆菌可成功进入并短时间定植在斑马鱼肠道中，通过改善斑马鱼肠道内的微生物组成结构，从而增强斑马鱼的低温耐受能力，为促进鱼类健康养殖提供新的方向。本发明公开了干酪乳杆菌对鱼类抗寒过程具有干预效果，对于为促进鱼类健康养殖提供新的方向；本发明对本领域了解益生菌的功效以及指导益生菌使用方面都具有重要的意义。
21.上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下为本发明的较佳实施例并配合详细附图说明如后。
附图说明
22.图1是干酪乳杆菌对斑马鱼幼苗低温耐受能力的影响：(a)低温处理不同时间后，对照组和干酪乳杆菌处理组斑马鱼的存活率柱状图；(b)pbs对照组斑马鱼在10℃低温暴露12h后的照片；(c)干酪乳杆菌处理组斑马鱼在10℃低温暴露12h后的照片。
23.图2是干酪乳杆菌对1月龄斑马鱼低温耐受能力的影响：(a)低温水浴过程中，养鱼水的温度变化情况；(b)低温处理不同时间后，对照组和干酪乳杆菌处理组斑马鱼的存活曲线图。
24.图3是干酪乳杆菌对斑马鱼成鱼肠道菌群组成结构的影响：(a)对照组和干酪乳杆菌处理组斑马鱼的肠道菌群在phylum(门)水平的分布；(b)对照组和干酪乳杆菌处理组的肠道菌群在genus(属)水平的差异比较。
具体实施方式
25.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下将结合说明书附图和较优的实施例对本发明作更全面、细致地描述，如无特殊说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂均可从商业途径得到或者可通过现有方法制备得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
26.本发明提供一种增强鱼类耐寒能力的益生菌及其使用方法，所述益生菌为干酪乳
杆菌，来源于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，编号为gdmcc1.80，本领域技术人员可以从该菌种库购买到。
27.本发明中，培养干酪乳杆菌所用的培养基如下：
28.mrs液体培养基配方为：酪蛋白胨10.0g，牛肉粉10.0g，酵母浸粉5.0g，葡萄糖20.0g，硫酸镁0.1g，乙酸钠5.0g，柠檬酸铵2.0g，磷酸氢二钾2.0g，硫酸锰0.05g，吐温80 1.0g，蒸馏水1000ml，将各成分混合均匀，调ph 6.2
±
0.2，121℃灭菌15min。
29.mrs固体培养基每升添加15g琼脂。
30.本发明中，干酪乳杆菌gdmcc1.80的复苏与保存：
31.(1)在超净工作台将干酪乳杆菌冻干粉复苏。用无菌枪头吸取300μl mrs液体培养基，滴入冻干管中，轻轻振荡至其溶解。
32.(2)吸取全部菌悬液，接种在mrs固体培养基平板上，于37℃静止培养48h。
33.(3)待长出单克隆菌落后，用无菌枪头将单克隆挑至装有500μl mrs液体培养基的1.5ml离心管中，于37℃静止培养48h。然后加入500μl无菌的30％甘油。
34.(4)pcr扩16s rdna全长，引物序列：27f(5
’‑
agagtttgatcctggctcag-3’)、1492r(5
’‑
tacgacttaaccccaatcgc-3’)。
35.(5)反应体系：2
×
taqpcrmaster mix 12.5μl、上下游引物各1μl、dna模板0.5μl、ddh2o 10μl；反应程序：95℃5min；94℃1min，55-58℃1min，72℃90s，30个循环；72℃10min。
36.(6)干酪乳杆菌16s rdna序列(5
’‑3’
)如下：
37.taatgatgcagtcgtacgagttctcggtgatgatcggtgcttgcaccgagattcaacatggaacgagtggcggacgggtgagtaacacgtgggt
38.aacctgcccttaagtgggggataacatttggaaacagatgctaataccgcatagatccaagaaccgcatggttcttggctgaaagatggcgtaag
39.ctatcgcttttggatggacccgcggcgtattagctagttggtgaggtaatggctcaccaaggcgatgatacgtagccgaactgagaggttgatcg
40.gccacattgggactgagacacggcccaaactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccacaatggacgcaagtctgatggagcaacgc
41.cgcgtgagtgaagaaggctttcgggtcgtaaaactctgttgttggagaagaatggtcggcagagtaactgttgtcggcgtgacggtatccaacca
42.gaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttatccggatttattgggcgtaaagcgagcgcaggcg
43.gttttttaagtctgatgtgaaagccctcggcttaaccgaggaagcgcatcggaaactgggaaacttgagtgcagaagaggacagtggaactcca
44.tgtgtagcggtgaaatgcgtagatatatggaagaacaccagtggcgaaggcggctgtctggtctgtaactgacgctgaggctcgaaagcatgg
45.gtagcgaacaggattagataccctggtagtccatgccgtaaacgatgaatgctaggtgttggagggtttccgcccttcagtgccgcagctaacgc
46.attaagcattccgcctggggagtacgaccgcaaggttgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaatt
47.cgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcttttgatcacctgagagatcaggtttcccct
tcgggggcaaaatgacaggtggtgcat
48.ggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttatgactagttgccagcatttagttgggcactctagta
49.agactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggatggt
50.acaacgagttgcgagaccgcgaggtcaagctaatctcttaaagccattctcagttcggactgtaggctgcaactcgcctacacgaagtcggaatc
51.gctagtaatcgcggatcagcacgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgagagtttgtaacacccgaag ccggtggcgtaacccttttagggagcgagccgtctaaggtgactagattc(seq id no.1)
52.(7)将测序结果在ncbi中比对(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)，证明所挑选的单克隆菌落都是干酪乳杆菌。将加有30％甘油的干酪乳杆菌作为菌种保藏于-80℃冰箱中。
53.本发明中，干酪乳杆菌gdmcc1.80的扩大培养与收集浓缩：
54.(1)在超净工作台中，用无菌枪头取20μl干酪乳杆菌gdmcc1.80菌种，接种于15ml mrs液体液体培养基中。
55.(2)将接种好的液体培养基置于37℃恒温培养箱静置48h。待菌液生长到od600约为1.2左右时取出。
56.(3)将菌液4℃4000g离心10分钟，在超净工作台弃去上清，用无菌pbs洗两次，最后悬浮于无菌pbs中，浓度约为10
9-10
10
cfu/ml，放于4℃冰箱待用。
57.实验用鱼的养殖
58.斑马鱼在室内循环水系统中养殖，水温控制在28
±
0.5℃，每天照明12h(8:00-20:00)。根据规格大小依次投喂草履虫、丰年虫和冰冻红虫。
59.实施例1
60.检测干酪乳杆菌对斑马鱼幼苗期低温耐受能力的影响，具体的实验操作步骤如下：
61.(1)将刚出膜的斑马鱼幼苗(96hpf)随机分到1l的养鱼缸中，每缸200-300尾(重复4次，为了确保鱼苗的背景一致，只用了同一尾斑马鱼产的胚胎，所以每次用的数量有差异，本文展示结果用的是每缸200尾)。斑马鱼开口后(96hpf)以106～107cfu/ml的终浓度将干酪乳杆菌gdmcc1.80添加到养鱼水体中，每天早晚喂100ml草履虫(100-200个/ml)，以添加同样体积pbs作为对照。每24h换一次养鱼水，并且添加新的菌液和pbs。
62.(2)干酪乳杆菌gdmcc1.80处理2周后，将斑马鱼幼苗分到60mm培养皿中，每盘20尾，然后直接转移至10℃致死低温条件下暴露不同时间后，统计死亡率。
63.实验结果如图1所示，低温处理12h后，pbs组斑马鱼的存活率为40％左右，而干酪乳杆菌处理组的存活率显著高于pbs组，大约在70％左右；低温处理18h后，pbs组斑马鱼的存活率只有20％，而干酪乳杆菌处理两周后，斑马鱼的存活率提高到40％(图1a)。说明10℃致死低温处理12h或者18h，干酪乳杆菌处理组斑马鱼的抗寒能力都显著高于pbs组。
64.实施例2
65.检测干酪乳杆菌gdmcc1.80对1月龄斑马鱼低温耐受能力的影响，具体的实验操作
步骤如下：
66.(1)将1月龄斑马鱼暂养于1l鱼缸，每缸40-50尾鱼苗(重复3次，本文展示结果用的是50尾)，加500ml曝气水，按照10
6-107cfu/ml干酪乳杆菌gdmcc1.80的剂量添加干酪乳杆菌gdmcc1.80到鱼缸中，处理2周，对照用相同体积的pbs。每24h换一次养鱼水，并且添加新的菌液，喂等量丰年虫。
67.(2)干酪乳杆菌处理2周后，比较斑马鱼抗寒能力。具体操作：低温处理前换上不含pbs和干酪乳杆菌的28℃曝气水；早上9点将鱼缸放入13℃的培养箱中水浴，养鱼水温度逐渐降低，5h后保持在11℃(图2a)；每隔6h观察斑马鱼的死亡情况，以心跳停止和对机械刺激无反应作为评价死亡的标准。
68.结果如图2b的存活曲线所示，pbs组在低温处理36h时，1月龄斑马鱼基本上全部死亡，而干酪乳杆菌在低温处理36h存活率在80％左右，直到低温处理96h，干酪乳杆菌处理组才全部死亡。结果证明干酪乳杆菌处理1月龄斑马鱼两周后能够显著提高1月龄斑马鱼的抗寒能力。
69.实施例3
70.检测干酪乳杆菌gdmcc1.80在斑马鱼肠道中的定植情况，具体操作步骤如下：
71.(1)将3月龄斑马鱼雄鱼暂养于1l鱼缸(每缸12尾鱼，重复两次)，按照10
6-107cfu/ml干酪乳杆菌gdmcc1.80的剂量添加干酪乳杆菌gdmcc1.80到鱼缸中，处理2周，对照用相同体积的pbs；每24h换一次养鱼水，并且添加新的菌液，喂等量丰年虫。
72.(2)最后一次换养鱼水时不添加干酪乳杆菌，间隔不同时间并且不进食，取斑马鱼肠道。具体操作：将斑马鱼用灭菌水清洗4遍，并用酒精棉球擦拭斑马鱼表面；在无菌操作下取斑马鱼肠道于1.5ml离心管中，每管2-3尾，加500mlpbs，用移液枪吹打、高速振荡以及超声波破碎的方法匀浆；
73.(3)取100μl匀浆液涂于mrs平板培养基上，37℃培养48h；用白色小枪头直接挑取单克隆菌做为模板pcr扩16s rdna，通过测序鉴定菌的种类。
74.(4)用引物：27f(5
’‑
agagtttgatcctggctcag-3’)、1492r(5
’‑
tacgacttaaccccaatcgc-3’)进行pcr扩增，反应体系：2
×
taqpcr master mix 13μl、上下游引物各1μl、dna模板为少量菌落、ddh2o 10μl；反应程序：95℃5min；94℃1min，55-58℃1min，72℃90s，30个循环；72℃10min。
75.结果如表1所示，pbs对照组的斑马鱼肠道微生物在mrs固体培养基中只能培养肠球菌。干酪乳杆菌处理后间隔48h内，能检测到斑马鱼肠道中存在干酪乳杆菌，然而处理后间隔时间超过72h就无法检测到添加的益生菌。说明干酪乳杆菌能够进入斑马鱼肠道，并且能够短时间定植。
76.表1益生菌在斑马鱼肠道中的定植情况：
[0077][0078]
采用16s rdna测序方法检测益生菌对斑马鱼肠道菌群结构的影响，测序流程如下：
[0079]
(1)取得斑马鱼肠道组织，采用e.z.n.a
tm
mag-bind soil dnakit试剂盒提取肠道内容物细菌的基因组，并以稀释后的基因组dna作为模板。
[0080]
(2)选择16s v3-v4区域，使用带barcode的特异引物(341f：5
’‑
cctaygggrbgcascag-3’，805r：(5
’‑
gactachvgggtatctaatcc-3’)进行pcr。
[0081]
(3)将pcr产物进行混样和纯化，使用dnapcr-free sample preparation kit进行文库构建，最后利用hiseq2500 pe250平台进行测序。
[0082]
(4)测序数据处理：二代测序得到的pe reads首先根据overlap关系进行拼接，区分样本后对序列质量进行质控和过滤，得到高质量的tags数据，通过与数据库进行比对去除嵌合体序列，最终得到有效数据。
[0083]
(5)out聚类(asv去噪)分析和物种注释：利用uparse软件对有效序列聚类成为outs(opera-tional taxonomic units)，然后采用mothur方法与silva的ssurrna数据库进行物种注释分析。
[0084]
结果如图3所示，斑马鱼肠道菌主要由三个门的菌(变形菌门、厚壁菌门和梭杆菌门)组成。其中梭杆菌门在对照组中的含量显著高于益生菌处理组，厚壁菌门在益生菌处理组中的含量显著高于对照组(图3a)。在属水平上益生菌处理组肠道中乳酸杆菌属的含量显著高于pbs组，而鲸蜡杆菌属、甲基杆菌属以及副球菌属在pbs组中的含量显著高于益生菌处理组(图3b)，说明干酪乳杆菌能够改变斑马鱼肠道菌群结构的组成。

技术特征：
1.干酪乳杆菌在制备增强鱼抗寒能力的制剂中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的干酪乳杆菌是干酪乳杆菌gdmcc1.80。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的干酪乳杆菌用mrs肉汤培养基培养获得。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，是用mrs肉汤培养基于37℃培养48h，用无菌pbs洗三次，菌体细胞溶于无菌pbs，浓度为109～10
10
cfu/ml。5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的鱼为斑马鱼或其它不耐低温鱼。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的鱼是幼苗期到1月龄的斑马鱼或其它不耐低温鱼。7.一种增强鱼抗寒能力的方法，其特征在于，包括以下步骤：将干酪乳杆菌添加到鱼生长环境中进行培养，增加鱼抗寒能力。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的干酪乳杆菌是干酪乳杆菌gdmcc1.80。9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的鱼为斑马鱼或其它不耐低温鱼；干酪乳杆菌以终浓度为106～107cfu/ml直接添加于养鱼水中，每隔24h换新的养鱼水并添加新的菌液，添加干酪乳杆菌后立即喂食。10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，干酪乳杆菌通过定植在鱼体肠道中，并通过改善肠道内的微生物组成结构，从而增强低温耐受能力。

技术总结
本发明公开了干酪乳杆菌在制备增强鱼抗寒能力的制剂中的应用。本发明发现干酪乳杆菌可成功进入并短时间定植在斑马鱼肠道中，通过改善斑马鱼肠道内的微生物组成结构，从而增强斑马鱼的低温耐受能力，为促进鱼类健康养殖提供新的方向。本发明公开了干酪乳杆菌对鱼类抗寒过程具有干预效果，对于为促进鱼类健康养殖提供新的方向；本发明对本领域了解益生菌的功效以及指导益生菌使用方面都具有重要的意义。效以及指导益生菌使用方面都具有重要的意义。效以及指导益生菌使用方面都具有重要的意义。


技术研发人员：崔宗斌 任静 葛国栋
受保护的技术使用者：广东省科学院微生物研究所（广东省微生物分析检测中心）
技术研发日：2023.02.17
技术公布日：2023/8/23