一种光致热抗菌修饰的响应型止血水凝胶及其制备方法和应用

1.本发明属于生物材料技术和医疗产品领域，具体涉及一种光致热抗菌修饰的响应型止血水凝胶及其制备方法和应用。


背景技术：

2.创面的管理与修复每年都需要耗费巨量的人力、物力和财力，已成为近年来困扰人们生命健康的重要难题之一。伤口敷料在创面愈合过程中始终承担并发挥着重要的功效。然而，传统敷料，如纱布和棉球等，容易与伤口处的分泌物粘连在一起，在揭除更换敷料时容易对患者造成二次伤害，且纱布和棉球等在潮湿的环境下极易滋生细菌，造成伤口的感染，严重阻碍伤口的正常愈合。正是因为传统敷料在止血和抑菌方面仍存在相当大的缺陷，目前急需发明一种新型的兼具止血、抗菌和促伤口修复的多功能伤口敷料。
3.水凝胶敷料能够在短时间内吸收组织液和血细胞完成止血过程，此外，水凝胶的三维网状结构具有透气性，能够为创面局部提供润湿的微环境促进创面愈合。基于天然高分子材料开发的水凝胶敷料近年来在创面修复领域展现出巨大的应用潜力。然而，天然高分子基水凝胶丰富的含水特性一定程度上牺牲了其机械稳定性，而且润湿的微环境同样极易滋生细菌，严重阻碍创面愈合过程。因此，基于天然高分子材料所开发的水凝胶伤口敷料仍需进一步的增强止血和抗菌功能修饰。
4.现阶段，天然高分子基水凝胶敷料的止血过程主要通过材料吸收血液、俘获并沉聚血细胞完成。例如，呈阳离子电性的壳聚糖材料能够快速吸附呈阴离子电性的血细胞，从而在短时间内对伤口进行止血。通过海洋贻贝所开发的仿生组织粘附型水凝胶同样能够在短时间内吸收血液并俘获大量血细胞。如专利cn110448271b公开了一种抗菌粘附导电止血抗氧化的可注射复合水凝胶及其制备方法和应用，其使用多巴胺对明胶和碳纳米管改性，并通过多巴胺在碱性环境下的聚合反应完成了具有抗菌粘附导电型的止血复合水凝胶，其止血机制正是基于凝胶体系中的壳聚糖和多巴胺对血细胞的物理粘附和沉积作用。
5.相较于上述物理止血机理，人体自身存在的凝血因子(如血清胺等)能够快速激活止血信号通路完成止血，具有高效无毒无副作用的优势。然而目前尚未出现基于生理凝血机制开发应用的商业化止血水凝胶。


技术实现要素：

6.针对现有技术中存在的问题和不足，本发明的目的旨在提供一种光致热抗菌修饰的响应型止血水凝胶及其制备方法和应用。
7.为实现发明目的，本发明采用的技术方案如下：
8.本发明第一方面提供了一种光致热抗菌修饰的响应型止血水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
9.s1：将血清胺接枝在明胶上，得到血清胺改性明胶；
10.s2：向原儿茶醛溶液中加入三价铁盐溶液，混匀得到混合溶液，调节混合溶液的ph为9～10，搅拌3～5h，反应结束后得到pa@fe络合物溶液；
11.s3：将所述血清胺改性明胶溶于水得到血清胺改性明胶溶液，并与所述pa@fe络合物溶液混合，得到前驱体溶液，所述前驱体溶液经固化后即得光致热抗菌修饰的响应型止血水凝胶。
12.根据上述一种光致热抗菌修饰的响应型止血水凝胶的制备方法，优选地，步骤s1中将血清胺接枝在明胶上的具体操作为：向明胶溶液中加入血清胺盐酸盐，混合均匀后再依次加入edc和nhs，反应12～14h，反应结束后将所得产物在水中进行透析，然后冻干即得血清胺改性明胶。
13.根据上述一种光致热抗菌修饰的响应型止血水凝胶的制备方法，优选地，所述透析的截留分子量为8～14kda。
14.根据上述一种光致热抗菌修饰的响应型止血水凝胶的制备方法，优选地，所述明胶与血清胺盐酸盐的质量比为1～2:1，所述edc的用量为明胶质量的25％～40％，所述nhs的用量为明胶质量的10％～40％。
15.根据上述一种光致热抗菌修饰的响应型止血水凝胶的制备方法，优选地，所述冻干的具体操作为：将透析后的产物加入培养皿，于-30℃～-20℃下预冻12～14h然后再冷冻干燥24～36h。
16.根据上述一种光致热抗菌修饰的响应型止血水凝胶的制备方法，优选地，所述明胶溶液的质量浓度为1％～3％。
17.根据上述一种光致热抗菌修饰的响应型止血水凝胶的制备方法，优选地，步骤s2中所述三价铁盐与原儿茶醛的摩尔比为1:3～5。
18.根据上述一种光致热抗菌修饰的响应型止血水凝胶的制备方法，优选地，步骤s3中所述血清胺改性明胶溶液的浓度为20wt％～30wt％，所述pa@fe络合物溶液的浓度为0.02～0.10m。
19.根据上述一种光致热抗菌修饰的响应型止血水凝胶的制备方法，优选地，步骤s3中所述pa@fe络合物溶液与血清胺改性明胶溶液的体积比为1:2～3。
20.本发明第二方面提供一种如第一方面所述的制备方法制得的止血水凝胶产品。
21.本发明第三方面提供如第二方面所述的止血水凝胶产品在制备伤口敷料中的应用。
22.与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
23.1.现有的水凝胶敷料多为物理止血机制，本发明通过将人体自身存在的凝血因子血清胺接枝到明胶分子链上，对明胶进行改性，改性后的明胶再与pa@fe络合体复合，利用血清胺的生物快速响应止血作用和pa@fe络合体长期有效的光致热抗菌能力，制备了一种基于生理凝血机制的响应型止血抗菌水凝胶，为水凝胶敷料的制备提供了一种新的思路。
24.2.本发明制备的光致热抗菌修饰的响应型止血水凝胶，能够在短时间内(3min左右)聚集血细胞并完成止血过程。其响应机理为血清胺活化生物体内的如血小板因子4、血管性血友病因子和纤维蛋白原等多种止血因子，加速对血细胞的集聚，同时pa@fe络合体中多酚官能团、铁离子与血细胞及细胞外基质等的相互作用破坏了血液的介稳性使血液集聚，基于凝胶基体中的血清胺和pa@fe络合体的协同作用完成止血过程，实现物理和生理的
协同止血效果。
25.3.血清胺分子链上的吲哚部位及吲哚环上的羟基能够有效消除伤口局部产生的氧自由基，pa分子链中的邻苯二酚基团同样具有自由基清除能力，血清胺与pa之间的协同作用赋予了本发明制备的光致热抗菌修饰的响应型止血水凝胶优异的抗氧化性能，为伤口的快速愈合提供适宜的环境，避免伤口及邻近组织的继发损伤。
26.4.本发明制备的光致热抗菌修饰的响应型止血水凝胶，是一种具有近红外光热响应的凝胶敷料，在光照后能快速产生光热响应，在光照15min内温度可从20℃上升到55℃并趋于稳定；同时，移除光源后，凝胶又能在极短的时间(5min)内恢复到初始温度，具备良好的光热响应和恢复效应，实现水凝胶的光致热抗菌功能。
27.5.相较于纯明胶水凝胶，本发明制备的光致热抗菌修饰的响应型止血水凝胶能够针对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌进行杀灭，灭菌率接近100％，为创面提供良好的无菌愈合环境并促进局部组织再生和创面愈合。
附图说明
28.图1为血清胺(sh)、明胶(gel)、血清胺改性明胶(gels)的结构表征图谱，其中(a)为gel和gels的紫外可见吸收光谱，(b)为sh、gel和gels的核磁氢谱，(c)为sh、gel和gels的傅里叶红外光谱；
29.图2为pa@fe络合物在碱性溶液中的紫外吸收光谱图和拉曼光谱图；
30.图3为本发明对比例1、对比例2、对比例3和实施例1所得样品的sem图和元素分布图；
31.图4为本发明对比例1、对比例2、对比例3和实施例1所得样品的体外凝血时间及凝血7min时各组的血液状态；
32.图5为本发明对比例1、对比例2、对比例3和实施例1所得样品粘附红细胞的sem图；
33.图6为本发明对比例1、对比例2、对比例3和实施例1所得样品的dpph清除率；
34.图7为本发明对比例1、对比例2、对比例3和实施例1所得样品的光热效应图片、近红外光照射下的升温曲线和移除光源后的降温曲线；
35.图8为本发明对比例1、对比例2、对比例3和实施例1所得样品表面e.coli、s.aureus的菌落分布图及对各组样品对e.coli、s.aureus的杀菌率。
具体实施方式
36.以下实施例仅适用于对本发明进行进一步阐述。应该说明的是，本发明所使用的所有技术以及科学术语除另有说明外具有与本发明所属技术领域相同的含义。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，均采用本技术领域常规技术，或按照生产厂商所建议的条件；所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
37.为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
38.实施例1
39.一种光致热抗菌修饰的响应型止血水凝胶，制备方法包括以下步骤：
40.(1)制备血清胺改性明胶(gel-s)
41.在50℃水浴锅磁力搅拌条件下，将2g明胶(gel)均匀溶解在100ml去离子水中，将溶解完成的透明亮黄色明胶溶液冷却至室温并调节其ph值至5.5，转入37℃水浴锅中，向明胶溶液中加入1g血清胺盐酸盐(sh)混合均匀，再依次加入0.5g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)和0.25gn-羟基琥珀酰亚胺(nhs)粉末，黑暗条件下持续反应12h。反应结束后，将所得溶液转入透析袋中(8kda)，在去离子水中透析3天。透析结束后，将所得透析液倒入塑料培养皿中，在-20℃冰箱中预冻12h然后再用真空冷冻干燥机冷冻干燥24h，即得血清胺改性明胶(gel-s)，放入干燥器中保存备用。
42.(2)制备光致热pa@fe络合物
43.本实施例采用碱性环境下(ph＝9)一锅法合成原儿茶醛-三价铁离子络合物(pa@fe)，具体步骤如下：
44.80℃下将原儿茶醛(pa)溶于去离子水中，搅拌15min得到均匀溶液。fecl3在常温下溶于去离子水中，并超声10min确保fecl3均匀分散在溶液中。用滴管将fecl3溶液逐滴滴入pa溶液中，确保fecl3与pa的摩尔比为1:3，搅拌15min，使pa与fecl3充分混合均匀。然后向混合液中加入naoh溶液，调节混合液的ph值为9，在室温下搅拌3h使二者充分反应，最终得到pa@fe络合物。
45.(3)制备光致热抗菌修饰的响应型止血水凝胶
46.50℃下，将步骤(1)制备的gel-s以30％(m/v)的浓度溶解于去离子水中，得到gel-s溶液。按照pa@fe溶液与gel-s溶液体积比1:2，将浓度为0.02m的pa@fe溶液缓慢加入到gel-s溶液中，搅拌5min混合均匀，得到前驱体溶液，随后将该前驱体溶液注入模具中，即得光致热抗菌修饰的响应型止血水凝胶，对应的水凝胶命名为gels-pa@fe
0.02
，其中0.02代表pa@fe溶液的浓度为0.02m。
47.对比例1：制备纯明胶水凝胶(gel)
48.50℃下，将明胶以30％(v/v)的浓度溶解于去离子水中配制成均匀溶液，然后将溶液注入模具转移到4℃冰箱静置12h得到纯明胶水凝胶，将该纯明胶水凝胶命名为gel。
49.对比例2：制备血清胺改性明胶水凝胶(gels)
50.50℃下，将实施例1步骤(1)制备的gel-s以30％(v/v)的浓度溶解于去离子水中配制成均匀溶液，然后将溶液注入模具转移到4℃冰箱静置12h得到血清胺改性明胶水凝胶，将该血清胺改性明胶水凝胶命名为gels。
51.对比例3：制备明胶/pa@fe络合物水凝胶(gel-pa@fe
0.02
)
52.50℃下，将明胶以30％(v/v)的浓度溶解于去离子水中，得到明胶溶液。按照pa@fe溶液与明胶溶液体积比1:2，将浓度为0.02m的pa@fe溶液缓慢加入到明胶溶液中，搅拌5min混合均匀，得到前驱体溶液，随后将该前驱体溶液注入模具中，即得明胶/pa@fe络合物水凝胶，将该明胶/pa@fe络合物水凝胶命名为gel-pa@fe
0.02
，其中0.02代表pa@fe溶液的浓度为0.02m。
53.实施例2
54.一种光致热抗菌修饰的响应型止血水凝胶，制备方法包括以下步骤：
55.(1)制备血清胺改性明胶(gel-s)
56.在50℃水浴锅磁力搅拌条件下，将2g明胶(gel)均匀溶解在100ml去离子水中，将溶解完成的透明亮黄色明胶溶液冷却至室温并调节其ph值至6.0，转入37℃水浴锅中，向明
s溶液。按照pa@fe溶液与gel-s溶液体积比1:3，将浓度为0.1m的pa@fe溶液缓慢加入到gel-s溶液中，搅拌5min混合均匀，得到前驱体溶液，随后将该前驱体溶液注入模具中，即得光致热抗菌修饰的响应型止血水凝胶，对应的水凝胶命名为gels-pa@fe
0.1
，其中0.1代表pa@fe溶液的浓度为0.1m。
71.结构表征和性能测试
72.1.血清胺改性明胶(gels)的结构表征
73.对纯明胶及上述实施例1步骤(1)制得的血清胺改性后的明胶进行uv-vis，傅里叶红外光谱(ftir)以及核磁氢谱(1hnmr)表征。
74.(1)uv-vis表征：利用紫外可见分光光度计，对改性前后的明胶溶液在250-400nm波长范围内进行uv-vis光谱扫描，以分析接枝前后官能团的变化情况。如图1(a)所示为改性前后的明胶紫外可见吸收光谱图，从图1(a)中可以看出，纯明胶无明显的吸收特征峰，而gels样品在280nm处出现较强的特征吸收峰，正好对应血清胺的特征吸收波长，说明sh被成功接枝到明胶分子链上。
75.(2)1h nmr表征：利用核磁共振波谱仪对制得的各组样品进行核磁氢谱测试，从而分析血清胺(sh)接枝明胶前后化学位移的变化，氢谱测试所用的溶剂为氘水，样品测试浓度为15mg/ml，磁场强度为400mhz，结果如图1(b)所示。
76.从图1(b)可以看出，与gel相比，gels的核磁氢谱在6.8至7.5ppm间出现了新的峰值，代表sh分子链中吲哚基团中的芳香质子特征峰。此外，gels的核磁氢谱在2.8ppm出现的特征峰则来自于sh分子链中亚甲基的质子峰，综合以上结果可以证实gels的成功制备。
77.(3)ftir表征：ftir能够反应出材料改性前后官能团的变化。采用溴化钾(kbr)压片法对各组样品进行红外测试。kbr易吸水在压片前需要进行干燥处理(120℃烘烤6h)，然后将样品(2mg)分别与kbr(200mg)在玛瑙研钵中研磨，将研磨均匀的粉末转移到模具中，在压片机下用20kpa左右的压力压片1min将样品压制成透明薄片，压片的厚度约2mm。放入傅里叶红外光谱仪中在4000-400cm-1
范围内扫描，扫描时的分辨率为4cm-1
，结果如图1(c)所示。
78.从图中可以看出1651cm-1
特征吸收峰代表着酰胺i带中c＝o的伸缩振动。由于sh分子结构中含有羟基，当sh被引入gel分子链上后，导致分子链间氢键作用增强，使得gels谱图中的羟基伸缩振动峰从3480cm-1
偏移至3377cm-1
处。
79.2.pa@fe络合物的结构表征
80.(1)uv-vis表征：利用紫外可见分光光度计(uv-vis)分析pa与fe的络合形式。在400-900nm范围内记录实施例1步骤(2)制备的pa@fe络合溶液的uv-vis光谱，结果如图2(a)所示。
81.图2(a)中结果表明优化后的碱性环境(ph＝9)能够有效诱导pa和fe形成稳定的三络合物，溶液呈现红褐色，特征吸收峰出现在450nm处。
82.(2)raman表征：采用激光拉曼光谱仪(raman)验证pa@fe的结构。将制备好的pa@fe溶液冷冻干燥成粉末后压制成片。在785nm激光下，使用激光拉曼光谱仪收集片剂表面的拉曼光谱，每个片剂表面至少测量三个点，光谱仪针孔和狭缝均设置为400μm。
83.图2(b)中结果显示曲线中470-670cm-1
和1200-1500cm-1
波段处均出现了特征峰，表明pa@fe样品中形成了多个金属配位键。
84.3.光致热抗菌修饰的响应型止血水凝胶的结构表征
85.采用场发射扫描电子显微镜和x射线能谱仪分别对各组水凝胶的微观形貌和元素分布进行分析。结果参见图3，其中(a)为gel(对比例1)、gels(对比例2)、gel-pa@fe
0.02
(对比例3)、gels-pa@fe
0.02
(实施例1)的sem照片，(b)为gels-pa@fe
0.02
(实施例1)水凝胶的c、n、o和fe元素分布图像。
86.从图3(a)可知复合水凝胶均呈现出典型的多孔连通结构，相比gel水凝胶，gels、gel-pa@fe
0.02
和gels-pa@fe
0.02
水凝胶的孔径均明显缩小，网络结构更加致密紧凑，gels-pa@fe
0.02
复合水凝胶内部甚至由于局部交联过度呈现紧实无孔的断层区域，这是因为血清胺被引入明胶分子链上后导致分子链间的氢键作用得到增强，分子链排列更加紧密，从而缩小了泡孔尺寸；此外，pa@fe在凝胶体系中充当了交联剂，pa分子结构中的醛基与明胶分子结构中的氨基发生了席夫碱反应，导致网络结构进一步致密。
87.从图3(b)可知，c、n、o和fe四种元素均匀地分布在gels-pa@fe
0.02
凝胶截面，其中c元素来自于gels的主链分子和sh分子中的吲哚结构，因此含量最为丰富，fe元素主要来自于pa@fe
0.02
络合物，含量最少。以上结果表明，本发明成功制备了gels-pa@fe
0.02
水凝胶。
88.4.光致热抗菌修饰的响应型止血水凝胶的性能评价
89.对gel(对比例1)、gels(对比例2)、gel-pa@fe
0.02
(对比例3)、gels-pa@fe
0.02
(实施例1)水凝胶样品进行性能评价。
90.(1)体外凝血时间(bct)和粘附红细胞数量
91.使用柠檬酸钠抗凝羊全血测试不同水凝胶的体外凝血时间(bct)。称取160mg水凝胶样品，将各样品剪碎放入5ml离心管中并置于37℃水浴锅中预热5min。随后，向各离心管中加入1ml柠檬酸钠抗凝羊全血和80μl 0.25m cacl2溶液并使二者均匀混合，每隔一段时间将离心管倒置，观察管中羊血的流动情况，如图4(a)所示为凝血7min时各个样品的血液状态。将羊血凝固的时间记为凝血时间，空白组为不加水凝胶组，各样品的凝血时间参见图4(b)。用pbs溶液轻轻冲洗水凝胶表面2次，除去未粘附的红细胞。之后将粘附在水凝胶表面的红细胞用2.5％(v/v)戊二醛固定1h，然后依次用70％、80％、90％和100％(v/v)乙醇进行梯度脱水，每次脱水15min，最后将样品放入sem中，观察红细胞的形貌，结果参见图5。
92.从图4(a)可知，空白参照组和gel水凝胶组中的血液仍处于流动状态，而gels、gel-pa@fe
0.02
和gels-pa@fe
0.02
水凝胶组中的血液均已完全凝固，表明血清胺与pa@fe的引入均可加速血液凝固过程。
93.从图4(b)可知，相较于空白组(7.8min)，gel水凝胶的凝血时间(7.3min)略有缩短，这是因为明胶水凝胶吸收血液后溶胀，促进血小板聚集从而加速血液凝固。而血清胺则是一种有效的凝血介质，因此gels水凝胶的凝血时间进一步缩短，为6.6min。当水凝胶体系中引入pa@fe络合体后，和gels-pa@fe
0.02
水凝胶的凝血时间分别为5.1min和3.7min，这是因为pa@fe中含有的邻苯二酚和fe与血细胞、细胞外基质等的相互作用破坏了血液的介稳性从而使血液集聚完成凝血，同时，血清胺与pa@fe络合体的协同作用导致gels-pa@fe
0.02
水凝胶的凝血效率最为高效。
94.从图5可以看出，gel水凝胶表面仅附着少量的红细胞，经血清胺改性后的凝胶表面附着的红细胞明显增加，说明血清胺对明胶水凝胶凝血性能的有效提升。当水凝胶体系中同时引入血清胺和pa@fe络合体后，凝胶表面附着的红细胞继续增加，这与凝血时间结果
趋势一致，说明络合体能够进一步提升血清胺改性水凝胶的凝血性能，这也归功于血清胺与pa@fe络合体的协同作用。
95.以上结果表明，本发明制备的gels-pa@fe
0.02
水凝胶具有高效凝血作用，能够在短时间内(3.7min)聚集血细胞完成止血过程。
96.(2)抗氧化性能测定
97.通过清除稳定的1，1-二苯基-2-苦基肼(dpph)自由基，评价各组水凝胶的抗氧化性质。具体操作为：在黑暗中将dpph(100μm)溶解在无水乙醇中，然后将20mg水凝胶分散在3mldpph溶液中。将混合物在黑暗中搅拌30min，并通过紫外可见分光光度计测量在517nm处的吸光度。dpph清除率通过以下公式计算：
[0098][0099]
其中ab，ah分别是空白组(dpph+乙醇)和水凝胶组(dpph+乙醇+水凝胶)在517nm处的吸光度，各组水凝胶的抗氧化性能结果参见图6。
[0100]
图6结果表明，从dpph溶液的颜色变化可以直观地看出本发明制备的gels-pa@fe
0.02
水凝胶具有最优异的自由基清除效率，溶液颜色从最初的暗紫色，逐渐转变为淡紫色最终变为浅黄色，表明溶液中的dpph自由基逐渐被清除。经量化计算后可得，gels水凝胶(40.63％)和gel-pa@fe
0.02
水凝胶(47.01％)的dpph清除率远高于gel水凝胶(4.73％)。此外与gels水凝胶(40.63％)和gel-pa@fe
0.02
水凝胶(47.01％)相比，本发明制备的gels-pa@fe
0.02
水凝胶(80.49％)的dpph清除率在二者的基础上有了明显的提升，这是因为血清胺是天然的吲哚衍生物，其分子链上的吲哚部位以及吲哚环上的羟基官能团能够清除多种类型的自由基；此外，pa分子链中的邻苯二酚基团同样具有自由基清除能力，血清胺与pa之间的协同作用导致gels-pa@fe0.02水凝胶的dpph清除率远大于其他三组水凝胶。
[0101]
以上结果表明，本发明制备的gels-pa@fe水凝胶具有优异的抗氧化性能。
[0102]
(3)光热效应
[0103]
在各组水凝胶上方照射808nm的近红外光(0.6w)，每组水凝胶的照射时间设置为15min。使用热成像相机拍摄光热图像并记录特定时间的温度，gel、gels、gel-pa@fe
0.02
和gels-pa@fe0.02水凝胶在808nm近红外光照射下的光热图像如图7(a)所示，图7(b)、图7(c)分别为gel、gels、gel-pa@fe
0.02
和gels-pa@fe
0.02
水凝胶在808nm近红外光照射下的升温曲线和降温曲线。
[0104]
从图7(a)中可知，gel水凝胶不具有光热效应，在光照射15min内光热图像仍然是深蓝色。gels水凝胶具有微弱的光热效应，在照射15min内，光热图像的中心区域逐渐转变为浅黄色。由于光热剂pa@fe的引入，gel-pa@fe
0.02
和gels-pa@fe
0.02
水凝胶的光热效应明显增加，随着时间的推移，两种水凝胶中心区域的温度逐渐辐射到整个水凝胶表面并且白色光斑逐渐增大，同一时刻下gels-pa@fe
0.02
水凝胶的光斑面积略大于gel-pa@fe
0.02
水凝胶。
[0105]
从图7(b)为可知，gel水凝胶不受光照的影响，在近红外光照射15min后，其温度基本不发生变化。而gels水凝胶在光照15min后，温度略微增加最高升高至25.15℃。照射15min后，gel-pa@fe
0.02
和gels-pa@fe
0.02
水凝胶的最高温度分别升高至52.15和56.75℃，这也进一步说明光热效应的主要来源是pa@fe。图7(c)为关闭近红外光源后水凝胶的降温曲线。gel-pa@fe
0.02
和gels-pa@fe
0.02
水凝胶表面温度在30s内迅速下降，避免了残余热量对周
围组织引发的损伤。
[0106]
以上结果表明，本发明制备的gels-pa@fe水凝胶具有光热效应。
[0107]
(4)抗菌活性
[0108]
采用平板计数法测定各组水凝胶对革兰氏阴性菌大肠杆菌(e.coli)和革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(s.aureus)的抗菌活性。具体方法为：将10μl无菌pbs中的细菌悬浮液(105cfu/ml)滴加到灭菌后的各组水凝胶表面，用808nm近红外光在水凝胶上方垂直照射15min后，将1ml无菌pbs注射到每个孔中，以重新悬浮幸存的细菌。将细菌稀释液(100μl)均匀涂布在固体培养基上。在37℃下培养24h后，计数菌落数，每组设3个平行样本，取平均值。抗菌率通过以下公式计算：
[0109][0110]
其中a和a0分别是实验组和对照组中的菌落数。其中实验组为分别为gel、gels、gel-pa@fe
0.02
和gels-pa@fe
0.02
水凝胶，对照组为琼脂培养基，结果如图8所示。
[0111]
如图8(a)为各组水凝胶在808nm近红外光照射15min后表面革兰氏阴性菌大肠杆菌(e.coli)的菌落分布图，(b)为各组水凝胶在808nm近红外光照射15min后表面革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(s.aureus)的菌落分布图，(c)为各组水凝胶在808nm近红外光照射15min后对革兰氏阴性菌大肠杆菌(e.coli)的杀菌率，(d)为各组水凝胶在808nm近红外光照射15min后对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(s.aureus)的杀菌率。
[0112]
从图8可知，没有近红外光辅助的情况下，与对照组相比，所有水凝胶组的菌落数没有明显减少，因为在温度没有升高的前提下，水凝胶与菌液短时间接触不足以有效地杀死细菌。照射15min后，gel和gels水凝胶组的菌落数量与照射前相比仍没有明显差异，对e.coli的抗菌率分别为5.51％和15.17％，对s.aureus的抗菌率分别为11.06％和13.5％。而gel-pa@fe和gels-pa@fe
0.02
水凝胶因二者具有良好的光热转换能力，可使细菌的膜蛋白发生变性，因此二者对e.coli和s.aureus的抗菌率均在98％以上。
[0113]
以上结果表明，本发明制备的gels-pa@fe
0.02
水凝胶有着优异的近红外辅助抗菌能力，这有利于其成为一种潜在的生物医用材料。
[0114]
综上所述，本发明成功制备了一种光致热抗菌修饰的响应型水凝胶，该水凝胶能够在短时间内(3min左右)聚集血细胞并完成止血过程，同时还具有优良的抗氧化性能，能够有效消除氧自由基，为伤口的快速愈合提供适宜的环境，且具有良好的光热响应和高效的灭菌能力，为创面提供良好的无菌愈合环境并促进局部组织再生和创面愈合。
[0115]
上述实施例为本发明的具体实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它任何不超出本发明设计思路组合、改变、修饰、替代、简化，均落入本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种光致热抗菌修饰的响应型止血水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：s1：将血清胺接枝在明胶上，得到血清胺改性明胶；s2：向原儿茶醛溶液中加入三价铁盐溶液，混匀得到混合溶液，调节混合溶液的ph为9～10，搅拌反应3～5h，反应结束后得到pa@fe络合物溶液；s3：将所述血清胺改性明胶溶于水得到血清胺改性明胶溶液，并与所述pa@fe络合物溶液混合，得到前驱体溶液，所述前驱体溶液经固化后即得光致热抗菌修饰的响应型止血水凝胶。2.根据权利要求1所述的一种光致热抗菌修饰的响应型止血水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤s1中将血清胺接枝在明胶上的具体操作为：向明胶溶液中加入血清胺盐酸盐，混合均匀后再依次加入edc和nhs，反应12～14 h，反应结束后将所得产物在水中进行透析，然后冻干即得血清胺改性明胶。3.根据权利要求2所述的一种光致热抗菌修饰的响应型止血水凝胶的制备方法，其特征在于，所述明胶与血清胺盐酸盐的质量比为1～2:1，所述edc的用量为明胶质量的25%～40%，所述nhs的用量为明胶质量的10%～40%。4.根据权利要求3所述的一种光致热抗菌修饰的响应型止血水凝胶的制备方法，其特征在于，所述明胶溶液的质量浓度为1%～3%。5.根据权利要求2所述的一种光致热抗菌修饰的响应型止血水凝胶的制备方法，其特征在于，所述冻干的具体操作为：将透析后的产物加入培养皿，于-30℃～-20℃下预冻12～14 h，然后再冷冻干燥24～36 h。6.根据权利要求5所述的一种光致热抗菌修饰的响应型止血水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤s2中所述三价铁盐与原儿茶醛的摩尔比为1:3～5。7.根据权利要求6所述的一种光致热抗菌修饰的响应型止血水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤s3中所述血清胺改性明胶溶液的浓度为20 wt～30 wt%，所述pa@fe络合物溶液的浓度为0.02～0.10 m。8.根据权利要求1～7任一所述的一种光致热抗菌修饰的响应型止血水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤s3中所述pa@fe络合物溶液与血清胺改性明胶溶液的体积比为1:2～3。9.如权利要求1～8任一所述的制备方法制得的止血水凝胶产品。10.如权利要求9所述的止血水凝胶产品在制备伤口敷料中的应用。

技术总结
本发明涉及生物材料技术和医疗产品领域，具体公开了一种光致热抗菌修饰的响应型止血水凝胶及其制备方法和应用。本发明通过将血清胺接枝到明胶分子链上进行改性，改性后的明胶再与PA@Fe络合体复合，利用血清胺的生物快速响应止血作用和PA@Fe络合体的光致热抗菌能力，制备了一种基于生理凝血机制的响应型止血抗菌水凝胶，为水凝胶敷料的制备提供了一种新的思路。所述水凝胶能够在短时间内（3 min左右）聚集血细胞并完成止血过程，具有优良的抗氧化性能，能够有效消除伤口局部产生的氧自由基，为伤口的快速愈合提供适宜的环境。此外，良好的光热响应和恢复效应赋予水凝胶光致热抗菌功能，为创面提供良好的无菌愈合环境并促进局部组织再生和创面愈合。局部组织再生和创面愈合。


技术研发人员：江永超 汤克勇 刘捷 乔嘉路
受保护的技术使用者：郑州大学
技术研发日：2023.06.05
技术公布日：2023/8/23