多菌种酶制剂生产葡甘低聚糖生产工艺的制作方法

1.本发明涉及细菌的发酵培养工艺，尤其涉及多菌种酶制剂生产葡甘低聚糖生产工艺。


背景技术：

2.魔芋主要成分为葡萄糖和甘露糖以1:1.6~1.7的比例相结合形成的葡甘聚糖，在我国西南山区产量最高，目前在国内主要作为一种粗纤维食粮或作为食品添加剂，附加值不高。葡甘聚糖是由d-甘露糖与d-葡萄糖残基按照1.69:1(白魔芋)或1.5或1.6:1(花魔芋)的分子比基于β-1,4-糖苷键相连接而成，其水溶性和凝胶性显著高于普通魔芋精粉，从而替代了普通魔芋精粉，并具有防止便秘的功效，还是一种植物性胶体且具有独特的理化性质，因而拥有广泛的开发价值和应用前景。
3.葡甘低聚糖是由2~10个单糖分子通过糖苷键连接而成的寡糖，可以有效促进生物体内以双歧杆菌为代表的肠道有益菌群的增殖，抑制病原菌生长、改善肠道内菌群结构、减少有毒代谢产物产生、防止便秘、保护肝脏、抗肿瘤及增强机体免疫力等多种生理功能。葡甘低聚糖还具有稳定、低甜度、低热量、不引发龋齿、降血糖、改善血液成分、降低血清总胆固醇和甘油三酯水平、安全无毒等特点，是新一代功能性食品。
4.葡甘聚糖酶是一类能够水解葡甘聚糖的内切酶，能水解植物胶(如魔芋)生成葡甘低聚糖。葡甘聚糖酶在动物、植物和微生物体内都有存在，而微生物是其主要来源。采用了枯草芽孢杆菌产生的葡甘聚糖酶对魔芋进行酶解，制成不同类型的葡甘低聚糖，拓宽了葡甘聚糖的应用范围，使其大幅度增值，具有重大的经济效益和社会效益。目前葡甘聚糖酶的生产菌株，主要集中在枯草芽孢杆菌上，菌种单一，无法拓宽产葡甘聚糖酶的菌株资源，且葡甘聚糖酶的产率低，不能够实现大规模量产，本发明采用的是黄单胞杆菌和枯草芽孢杆菌以拓宽产葡甘聚糖酶的产率。


技术实现要素：

5.针对现有技术的缺陷，本发明的目的是提供多菌种酶制剂生产葡甘低聚糖生产工艺，以解决上述背景技术中提出的问题。本发明的选择了黄单胞杆菌和枯草芽孢杆菌两种菌种发酵产生葡甘聚糖酶，不仅拓宽了产葡甘聚糖酶的菌株资源，而且提高了葡甘聚糖酶的产率，能够实现大规模量产，整个发酵方法有发酵周期短；条件温和，易于控制；且培养基具有葡甘聚糖酶产率高，葡甘聚糖酶活力高等优点。
6.本发明采取的技术方案如下：多菌种酶制剂生产葡甘低聚糖生产工艺，包括如下步骤：步骤一：葡甘聚糖酶的制备：采用枯草芽孢杆菌和黄单胞杆菌经魔芋粉液体发酵诱导产生葡甘聚糖酶液，葡甘聚糖酶液ph为7.5，温度为45℃；步骤二：葡甘聚糖酶活与还原糖的测定：取1.0％的魔芋胶溶液2.0ml，加入0.1ml葡甘聚糖酶液，于45℃反应15min，用dns法测定还原糖量；以1min水解魔芋粉液体产生1μ
mol还原糖所需的酶量定义为1个葡甘聚糖酶酶活单位iu/g；步骤三：酶解制备葡甘低聚糖：分别称取100目的魔芋粉5g溶于100ml预先添加了葡甘聚糖酶液的ph7.5缓冲液中，酶与魔芋粉液体的配比关系均为50 iu/g魔芋粉液体；反应混合物于45℃保温水解，期间每隔1h取样测定还原糖含量，反应24h后于100℃10min灭酶活。
7.作为优选，步骤二：1.0％的魔芋胶溶液用ph 7.5的磷酸缓冲液配置。
8.作为优选，步骤一：将枯草芽孢杆菌和黄单胞杆菌接种于lb液体培养基中制成种子培养液；取5ml培养的种子培养液接种于产葡甘聚糖酶的发酵初始培养基中，接种量为10%，于150r/m、35℃条件下培养。
9.作为优选，所述生产葡甘聚糖酶发酵初始培养基的配方含甘露醇12g/l，蛋白胨16g/l，mn2+399.04g/l，维生素b20.02g/l；培养基的ph为5.6。
10.作为优选，将黄单胞杆菌和枯草芽孢杆菌接种于lb固体平板培养基上，于35℃下培养24h，即活化；将活化后的菌株用接种针将菌体接种至种子培养基，35℃，转速150r/min下培养24h，即为种子培养液。
11.作为优选，取种子培养液5ml接种于产葡甘聚糖酶的培养基中培养34h，接种量为10％，于150r/m、35℃条件下培养，取发酵液在4℃下，10000r/min离心10min，得上清液即为葡甘聚糖酶液。
12.作为优选，种子培养基：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化钠10g/l，ph为7，121℃灭菌20min。
13.本发明的显著优点在于：本发明的选择了黄单胞杆菌和枯草芽孢杆菌两种菌种发酵产生葡甘聚糖酶，不仅拓宽了产葡甘聚糖酶的菌株资源，而且提高了葡甘聚糖酶的产率，能够实现大规模量产，整个发酵方法有发酵周期短；条件温和，易于控制；且培养基具有葡甘聚糖酶产率高，葡甘聚糖酶活力高等优点。
附图说明
14.为了更清楚的说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单介绍，显而易见的，对于本领域技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
15.图1为不同菌种产生的葡甘聚糖酶的酶活测定iu/ml。
16.图2为葡甘聚糖酶解24h后产物组分质谱分析图。
17.图3为葡甘低聚糖与质谱分析m/z值的对应关系。
具体实施方式
18.下面将对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明的一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
19.需要说明，在不冲突的情况下，以下实施例及实施例中的特征可以相互组合。还应
当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
20.除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
21.当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。下列实施例中所需要的材料或试剂，如无特殊说明均为市场购得。
22.下述实施例中涉及的多菌种酶制剂生产葡甘低聚糖生产工艺。
23.魔芋粉：湖北恩施楚叶魔芋食品有限公司；葡甘聚糖酶：本实验室筛选的枯草芽孢杆菌和黄单胞杆菌经魔芋粉液体发酵诱导产生，最适ph为7.5，最适温度为45℃；其他试剂均为国产分析纯。
24.实施例1多菌种酶制剂生产葡甘低聚糖生产工艺，包括如下步骤：步骤一：将黄单胞杆菌和枯草芽孢杆菌接种于lb固体平板培养基上，于35℃下培养24h，即活化；将活化后的菌株用接种针将菌体接种至种子培养基，35℃，转速150r/min下培养24h，即为种子培养液。取种子培养液5ml接种于产葡甘聚糖酶的培养基中培养34h，接种量为10％，于150r/m、35℃条件下培养，取发酵液在4℃下，10000r/min离心10min，得上清液即为葡甘聚糖酶液，葡甘聚糖酶液ph为7.5，温度为45℃。
25.种子培养基：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化钠10g/l，ph为7，121℃灭菌20min。所述生产葡甘聚糖酶发酵初始培养基的配方含甘露醇12g/l，蛋白胨16g/l，mn2+399.04g/l，维生素b20.02g/l；培养基的ph为5.6。
26.步骤二：葡甘聚糖酶活与还原糖的测定：取1.0％的魔芋胶溶液(ph7.5的磷酸缓冲液配置)2.0ml，加入0.1ml粗酶液，于45℃反应15min，用dns法测定还原糖量。在上述试验条件下，以1min水解魔芋粉液体产生1μmol还原糖(以甘露糖计)所需的酶量定义为1个葡甘聚糖酶酶活单位(iu/g)；步骤三：分别称取100目的魔芋粉5g溶于100ml预先添加了葡甘聚糖酶液的ph7.5缓冲液中，酶与魔芋粉液体的配比关系均为50iu/g魔芋粉液体。反应混合物于45℃保温水解，期间每隔1h取样测定还原糖含量，反应24h后于100℃10min灭酶活。混合液于12000r/m离心10min，收集上清，利用质谱对产物组分进行分析。
27.步骤四：maldi-tofms分析葡甘低聚糖组分：取10μl水解液上清，溶于10μl50%的乙醇中，混匀。吸取3μl混合液，与3μl2,5-二羟基苯甲酸(dhb)混合(dhb溶于50%乙腈与0.1%的三氟乙酸)，再取1μl混合液点于分析靶上，进行质谱检测。选择maldi-tofms基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪：德国布鲁克道尔顿公司进行质谱检测。质谱条件为使用正离子反射模式检测，质量扫描范围m/z100-2200，仪器控制软件为flex control software，数据处理软件为flex analysis software。
28.实施例2不同菌种产生的葡甘聚糖酶的酶活测定，酶活性分析见图1。
29.从图1可知，在相同的反应条件下，黄单胞杆菌和枯草芽孢杆菌产生的葡甘聚糖酶的酶活性最强，单独的黄单胞杆菌、枯草芽孢杆菌产生的葡甘聚糖酶的酶活性较弱。
30.实施例3酶解液组分分析：图2葡甘聚糖酶解24h后产物组分质谱分析。图2为不同菌种的产物分析图。魔芋胶水解反应24h后，将水解产物离心，收集上清进行ms分析，结果见图2。根据分子量(m/z值)推断(图3)，多聚糖魔芋粉液体经碱性葡甘聚糖酶酶解后，葡甘低聚糖从二糖至十糖都被检测到，种类多。
31.本发明的选择了黄单胞杆菌和枯草芽孢杆菌两种菌种发酵产生葡甘聚糖酶，不仅拓宽了产葡甘聚糖酶的菌株资源，而且提高了葡甘聚糖酶的产率，能够实现大规模量产，整个发酵方法有发酵周期短；条件温和，易于控制；且培养基具有葡甘聚糖酶产率高，葡甘聚糖酶活力高等优点。
32.虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
33.容易理解的是，本领域技术人员在本技术提供的几个实施例的基础上，可以对本技术的实施例进行结合、拆分、重组等得到其他实施例，这些实施例均没有超出本技术的保护范围。
34.以上的具体实施方式，对本技术实施例的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上仅为本技术实施例的具体实施方式而已，并不用于限定本技术实施例的保护范围，凡在本技术实施例的技术方案的基础之上，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本技术实施例的保护范围之内。

技术特征：
1.多菌种酶制剂生产葡甘低聚糖生产工艺，其特征在于，包括如下步骤：步骤一：葡甘聚糖酶的制备：采用枯草芽孢杆菌和黄单胞杆菌经魔芋粉液体发酵诱导产生葡甘聚糖酶液，葡甘聚糖酶液ph为7.5，温度为45℃；步骤二：葡甘聚糖酶活与还原糖的测定：取1.0％的魔芋胶溶液2.0ml，加入0.1ml葡甘聚糖酶液，于45℃反应15min，用dns法测定还原糖量；以1min水解魔芋粉液体产生1μmol还原糖所需的酶量定义为1个葡甘聚糖酶酶活单位iu/g；步骤三：酶解制备葡甘低聚糖：分别称取100目的魔芋粉5g溶于100ml预先添加了葡甘聚糖酶液的ph7.5缓冲液中，酶与魔芋粉液体的配比关系均为50 iu/g魔芋粉液体；反应混合物于45℃保温水解，期间每隔1h取样测定还原糖含量，反应24h后于100℃10min灭酶活。2.根据权利要求1所述的多菌种酶制剂生产葡甘低聚糖生产工艺，其特征在于，步骤二：1.0％的魔芋胶溶液用ph 7.5的磷酸缓冲液配置。3.根据权利要求1所述的多菌种酶制剂生产葡甘低聚糖生产工艺，其特征在于，步骤一：将枯草芽孢杆菌和黄单胞杆菌接种于lb液体培养基中制成种子培养液；取5ml培养的种子培养液接种于产葡甘聚糖酶的发酵初始培养基中，接种量为10%，于150r/m、35℃条件下培养。4.根据权利要求3所述的多菌种酶制剂生产葡甘低聚糖生产工艺，其特征在于，所述生产葡甘聚糖酶发酵初始培养基的配方含甘露醇12g/l，蛋白胨16g/l，mn
2+
399.04g/l，维生素b20.02g/l；培养基的ph为5.6。5.根据权利要求4所述的多菌种酶制剂生产葡甘低聚糖生产工艺，其特征在于，将黄单胞杆菌和枯草芽孢杆菌接种于lb固体平板培养基上，于35℃下培养24h，即活化；将活化后的菌株用接种针将菌体接种至种子培养基，35℃，转速150r/min下培养24h，即为种子培养液。6.根据权利要求5所述的多菌种酶制剂生产葡甘低聚糖生产工艺，其特征在于，取种子培养液5ml接种于产葡甘聚糖酶的培养基中培养34h，接种量为10％，于150r/m、35℃条件下培养，取发酵液在4℃下，10000r/min离心10min，得上清液即为葡甘聚糖酶液。7.根据权利要求5所述的多菌种酶制剂生产葡甘低聚糖生产工艺，其特征在于，种子培养基：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化钠10g/l，ph为7，121℃灭菌20min。

技术总结
本发明提供了多菌种酶制剂生产葡甘低聚糖生产工艺，属于细菌的发酵培养领域，包括：葡甘聚糖酶的制备：采用枯草芽孢杆菌和黄单胞杆菌经魔芋粉液体发酵诱导产生葡甘聚糖酶液，葡甘聚糖酶液pH为7.5，温度为45℃；酶解制备葡甘低聚糖：分别称取100目的魔芋粉5g溶于100mL预先添加了葡甘聚糖酶液的pH7.5缓冲液中，酶与魔芋粉液体的配比关系均为50 IU/g魔芋粉液体；反应混合物于45℃保温水解，期间每隔1h取样测定还原糖含量，反应24h后于100℃10min灭酶活。本发明的选择了黄单胞杆菌和枯草芽孢杆菌两种菌种发酵产生葡甘聚糖酶，不仅拓宽了产葡甘聚糖酶的菌株资源，而且提高了葡甘聚糖酶的产率，且培养基具有葡甘聚糖酶产率高，葡甘聚糖酶活力高等优点。聚糖酶活力高等优点。聚糖酶活力高等优点。


技术研发人员：李奕颉
受保护的技术使用者：山东汇润膳食堂股份有限公司
技术研发日：2023.05.26
技术公布日：2023/8/23