一种高效溶藻弧菌噬菌体粉剂的低温保存方法与流程

1.本发明涉及微生物技术领域，具体来说，涉及一种高效溶藻弧菌噬菌体粉剂的低温保存方法。


背景技术：

2.目前抗生素在控制人、畜细菌性传染病方面的作用不容置疑。然而，抗生素的滥用也带来了如药物残留、细菌耐药性和体内体外环境中菌群失调等诸多问题。近20年来，噬菌体(bacteriophage，常称为phage)作为抗菌剂已逐渐展现出替代抗生素的巨大潜力，并表现出迅猛增长的研究态势。噬菌体是细菌的天敌，本质上是一-种有益病毒，具有体积小、特异性高、稳定性强、安全性高及绿色环保等特点。噬菌体用于养殖业可提高畜、禽、鱼等动物的存活率和生长率，用于医疗可降低患者细菌性疾病的发病率及死亡率，用于食品业可延长食品的保鲜期。因此，噬菌体具有广阔的应用前景。
3.溶藻弧菌是一种养殖渔业常见的条件致病菌，可以感染海水鱼和淡水鱼，表现为鱼类大范围的皮肤损伤和菌血症，严重者可发展为肌肉和多脏器水肿进而导致鱼类死亡。我国是水产养殖大国，每年因溶藻弧菌的感染给水产养殖业造成巨大的经济损失。更严重的是，溶藻弧菌不仅可以感染水产养殖动物，还可以通过水产品的传播导致人类疾病发生。所以，解决水产养殖中的溶藻弧菌的感染问题对于人类健康和经济发展有着重要意义。
4.传统上，水产养殖业广泛应用抗生素来进行弧菌疾病的预防和治疗。但是，近年来抗生素在养殖业的滥用现象越来越严重。过度使用抗生素不仅污染环境、危害人类健康，还导致越来越多的耐药菌产生，最终使抗生素法对治疗弧菌感染变得“束手无策”。因此，对此亟需找到一种安全、高效的可以治疗溶藻弧菌感染的新方法，以替代抗生素，避免传统用药的几多弊端。
5.噬菌体疗法是近几年重新发展起来的一种抗生素替代疗法，与抗生素相比有诸多优点：噬菌体只裂解其宿主菌，不破坏其他有益菌群，专一性强，应用安全性高；噬菌体为自然界中存在的生物，无化学污染，是环境友好型药物；噬菌体可在宿主菌中自主复制，工业生产成本较低廉。因此，噬菌体疗法是一种很有前景的预防和治疗弧菌疾病方法。
6.但是噬菌体属极微小的生物，其活性受各种不同因素的影响，从其制备到实际应用这段时间的保藏条件至关重要，为最大限度地发挥其功效，人们尝试了多种不同的保藏方法。目前国内外关于噬菌体的实用保藏方法主要分为悬液法(suspension)、冻液法(freezing)和干燥法(drying)。每种噬菌体的性质各不相同，若保藏方法不当会造成极大损失。要使噬菌体在长期保藏条件下还具有较高的活性及稳定性，并且不被污染，不仅需要考虑其各自特性，还需考虑如介质、分散剂和温度等外界影响因素。因此，如何制备高效的噬菌体及如何长久进行保存保持活性是现在亟待解决的问题。
7.针对相关技术中的问题，目前尚未提出有效的解决方案。


技术实现要素：

8.针对相关技术中的问题，本发明提出一种高效溶藻弧菌噬菌体粉剂的低温保存方法，以克服现有相关技术所存在的上述技术问题。
9.为此，本发明采用的具体技术方案如下：
10.一种高效溶藻弧菌噬菌体粉剂的低温保存方法，该方法包括以下步骤：
11.配置溶藻弧菌噬菌体，进行纯化与增殖得到噬菌体溶液；
12.向所述噬菌体溶液中加入保护剂，混合均匀形成噬菌体原液；
13.将所述噬菌体原液冷冻降温至0-4℃，并保持30min；
14.将所述噬菌体原液转移喷雾容器中，在无菌环境下利用喷嘴将噬菌体原液进行喷射雾化，并经过含有液氮的容器形成噬菌体粉末；
15.收集冻干的所述噬菌体粉末，进行筛分后封入密封容器内，制备成噬菌体粉剂进行保存。
16.进一步的，所述配置溶藻弧菌噬菌体，进行纯化与增殖得到噬菌体溶液包括以下步骤：
17.将溶藻弧菌的宿主菌接种到液体培养基中，于30℃静置12h培养；
18.接种溶藻弧菌噬菌体至液体培养基中，振荡培养1-2h，再静置培养2-4h，经4000r/min离心后取得上清液；
19.将上清液均分为6份，分别加入宿主菌，用斑点法检测噬菌体是否存在，若存在则挑选噬菌斑进行传代增殖；
20.将上述噬菌斑培育出的噬菌体加入液体培养基采用双层琼脂法作单斑培养，并选取其中噬菌斑加入固体培养基进行增殖；
21.再次选取噬菌斑进行培养增殖，重复三次，通过检测后选取噬菌体纯度最高的作为噬菌体母液进行增殖。
22.进一步的，所述液体培养基采用ph值为7.4-7.8的牛肉汤，所述固体培养基为以液体培养基为基础加入琼脂支撑的平板。
23.进一步的，所述保护剂包括以下质量份数的成分组成：
24.脱脂牛奶8-12份、蛋白胨4-6份、海藻糖1-2份、甘露醇1-3份、壳聚糖0.8-1.2份、氯化钙0.6-1份、滑石粉0.3-0.5份，抗氧化剂0.2-0.4、淀粉0.8-1.2份。
25.进一步的，所述喷嘴采用超声波喷嘴，并将所述噬菌体原液雾化成粒径大小在20-100μm的颗粒。
26.进一步的，所述噬菌体粉剂保存在室温或2-7℃的干燥环境内。
27.进一步的，所述含有液氮的容器内部为密封性干燥无菌的负压环境，且温度为-196℃。
28.进一步的，所述噬菌体原液为中性溶液，采用稀盐酸或氢氧化钠调节溶液ph值。
29.本发明的有益效果为：通过对溶藻弧菌噬菌体进行的培养与重复多次的纯化与增殖，能够培养出高纯度的溶藻弧菌噬菌体，从而大大提高制备得到的溶藻弧菌噬菌体粉剂的药效，提高噬菌体的噬菌能力；配合预先冷冻，能够减少噬菌体原液直接进行喷雾干燥的造成的损失，同时利用超声波喷雾干燥法，大大提高了噬菌体原液的干燥效率，即干燥过程迅速、可直接干燥成粉末、生产效率高、操作人员少并且喷酒面积大、操作方便，噬菌体除菌
效率高；而最终经过喷雾冷冻干燥制备的噬菌体粉剂能够大大提高噬菌体的保存时间与适应性，降低保存环境的要求，进而保证长时间内噬菌体的生物活性；并且加工效率高，适合大规模生产，有利于推进噬菌体在微生物治疗领域的快速应用与普及。
30.此外，在噬菌体原液中添加的保护剂，成分组成合理，能够保证使噬菌体免受溶液损伤和冰晶损伤等物理因素的损伤，并且维持噬菌体极高的存活率和活性，使噬菌体的活动处于半静止或静止状态。
附图说明
31.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
32.图1是根据本发明实施例的一种高效溶藻弧菌噬菌体粉剂的低温保存方法的流程图。
具体实施方式
33.根据本发明的实施例，提供了一种高效溶藻弧菌噬菌体粉剂的低温保存方法。
34.以下实例中，所涉及菌株代号均为本公司的命名方式编号，部分菌株为市场购买获得。
35.溶藻弧菌噬菌体vap7(vibrio alginolyticus phage vap7)的保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，邮编430072；保藏时间为2018年11月09日，保藏编号cctcc no:m 2018767。
36.溶藻弧菌噬菌体vap9(vibrio alginolyticus phagevap9)的保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，邮编430072；保藏时间为2018年11月09日，保藏编号cctcc no:m 2018766。
37.溶藻弧菌噬菌体vap21(vibrio alginolyticus phagevap21)的保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，邮编430072；保藏时间为2018年11月09日，保藏编号cctcc no:m 2018768。
38.现结合附图和具体实施方式对本发明进一步说明，如图1所示，根据本发明实施例的高效溶藻弧菌噬菌体粉剂的低温保存方法，该方法包括以下步骤：
39.s1、配置溶藻弧菌噬菌体，进行纯化与增殖得到噬菌体溶液；
40.其中，所述步骤s1包括以下步骤：
41.s11、将溶藻弧菌的宿主菌接种到液体培养基中，于30℃静置12h培养；
42.s12、接种溶藻弧菌噬菌体至液体培养基中，振荡培养1-2h，再静置培养2-4h，经4000r/min离心后取得上清液；
43.s13、将上清液均分为6份，分别加入宿主菌，用斑点法检测噬菌体是否存在，若存在则挑选噬菌斑进行传代增殖；
44.s14、将上述噬菌斑培育出的噬菌体加入液体培养基采用双层琼脂法作单斑培养，并选取其中噬菌斑加入固体培养基进行增殖；
45.s15、再次选取噬菌斑进行培养增殖，重复三次，通过检测后选取噬菌体纯度最高的作为噬菌体母液进行增殖。
46.其中，所述液体培养基采用ph值为7.4-7.8的牛肉汤，所述固体培养基为以液体培养基为基础加入琼脂支撑的平板。
47.噬菌斑是噬菌体感染敏感宿主细菌以后在含受体菌的涂布平板上形成的肉眼可见的透明圈。在涂布有敏感宿主细胞的固体培养基表面，若接种上相应噬菌体的稀释液，其中每一噬菌体粒子由于先侵染和裂解一个细胞，然后以此为中心，再反复侵染和裂解周围大量的细胞，结果就会在菌苔上形成一个具有一定形状、大小、边缘和透明度的噬菌斑。
48.此外，每组噬菌体增殖后均分别进行pfu/ml和rtd进行测定。
49.s2、向所述噬菌体溶液中加入保护剂，混合均匀形成噬菌体原液；
50.其中，所述保护剂包括以下质量份数的成分组成：
51.脱脂牛奶8-12份、蛋白胨4-6份、海藻糖1-2份、甘露醇1-3份、壳聚糖0.8-1.2份、氯化钙0.6-1份、滑石粉0.3-0.5份，抗氧化剂0.2-0.4、淀粉0.8-1.2份。
52.其中噬菌体保护剂的组分合理，其中脱脂奶粉、蛋白胨和淀粉等形成整个保存保护剂的骨架，防止低分子物质的碳化和氧化，同时保护活性物质不受温度影响，使保护剂形成多孔性、疏松的海绵状物且具有一定的含水量，在冻存过程中保持原有的构架，从而增加溶解度；多种糖类保持存活状态以及对水分起缓解作用，并且保持电解质浓度。噬菌体保存保护剂可以使噬菌体免受溶液损伤和冰晶损伤等物理因素的损伤，并且维持噬菌体极高的存活率和活性，使噬菌体的活动处于半静止或静止状态。此外，多种糖类保持存活状态以及对水分起缓解作用，并且保持电解质浓度。噬菌体保存保护剂可以使噬菌体低温保存下免受溶液损伤和冰晶损伤等物理因素的损伤，并且维持噬菌体极高的存活率和活性，使噬菌体的活动处于半静止或静止状态。
53.此外，所述噬菌体原液为中性溶液，采用稀盐酸或氢氧化钠调节溶液ph值。
54.s3、将所述噬菌体原液冷冻降温至0-4℃，并保持30min，从而进行预先冷冻，减少后续喷雾冷冻干燥时的噬菌体损失。
55.s4、将所述噬菌体原液转移喷雾容器中，在无菌环境下利用喷嘴将噬菌体原液进行喷射雾化，并经过含有液氮的容器形成噬菌体粉末；
56.其中，所述喷嘴采用超声波喷嘴，并将所述噬菌体原液雾化成粒径大小在20-100μm的颗粒。
57.此外，所述含有液氮的容器内部为密封性干燥无菌的负压环境，且温度为-196℃。
58.s5、收集冻干的所述噬菌体粉末，进行筛分后封入密封容器内，制备成噬菌体粉剂进行保存。
59.其中，所述噬菌体粉剂保存在室温或2-7℃的干燥环境内。
60.此外，在选择噬菌体粉剂保存环境时，室温保藏虽简便，但稳定性较差；2-7℃冷藏需要冷链供给，一般能保藏一年以上，效价降低速率约为1log/年，最适合于工厂大规模生产与保藏。而-20℃冷冻能改善储存稳定性，但需要更多的冷链供给，且存在冻融问题，一般适用于实验室保藏；以及-80和-196℃(液氮)保藏稳定性最佳，但仅适用于实验室保藏。因此，本方法制备的噬菌体粉剂为了满足生产需求以及实际运用，可长时间保存在室温或2-7℃的干燥环境内，不需要额外进行超低温冷冻。
61.实施例一
62.一种高效溶藻弧菌噬菌体粉剂的低温保存方法，包括以下步骤：
63.1)将溶藻弧菌的宿主菌接种到液体培养基中，于30℃静置12h培养
64.2)接种溶藻弧菌噬菌体至液体培养基中，振荡培养1h，再静置培养2h，经4000r/min离心后取得上清液；
65.3)将上清液进行三次纯化增殖培养，得到噬菌体纯度最高的溶液作为噬菌体溶液；
66.4)向噬菌体溶液中加入脱脂牛奶8份、蛋白胨4份、海藻糖1份、甘露醇1份、壳聚糖0.8份、氯化钙0.6份、滑石粉0.3份，抗氧化剂0.2、淀粉0.8份，混合均匀形成噬菌体原液；
67.5)将所述噬菌体原液冷冻降温至4℃，并保持30min
68.6)将所述噬菌体原液转移喷雾容器中，在无菌环境下利用喷嘴将噬菌体原液进行喷射雾化，收集液氮容器冻干的噬菌体粉末，进行筛分后封入密封容器内，制备成噬菌体粉剂在4℃干燥环境下进行保存。
69.实施例二
70.一种高效溶藻弧菌噬菌体粉剂的低温保存方法，包括以下步骤：
71.1)将溶藻弧菌的宿主菌接种到液体培养基中，于30℃静置12h培养
72.2)接种溶藻弧菌噬菌体至液体培养基中，振荡培养1.5h，再静置培养3h，经4000r/min离心后取得上清液；
73.3)将上清液进行三次纯化增殖培养，得到噬菌体纯度最高的溶液作为噬菌体溶液；
74.4)向噬菌体溶液中加入脱脂牛奶10份、蛋白胨5份、海藻糖1.5份、甘露醇2份、壳聚糖1份、氯化钙0.8份、滑石粉0.4份，抗氧化剂0.3、淀粉4份，混合均匀形成噬菌体原液；
75.5)将所述噬菌体原液冷冻降温至4℃，并保持30min
76.6)将所述噬菌体原液转移喷雾容器中，在无菌环境下利用喷嘴将噬菌体原液进行喷射雾化，收集液氮容器冻干的噬菌体粉末，进行筛分后封入密封容器内，制备成噬菌体粉剂在4℃干燥环境内进行保存。
77.实施例三
78.一种高效溶藻弧菌噬菌体粉剂的低温保存方法，包括以下步骤：
79.1)将溶藻弧菌的宿主菌接种到液体培养基中，于30℃静置12h培养
80.2)接种溶藻弧菌噬菌体至液体培养基中，振荡培养2h，再静置培养4h，经4000r/min离心后取得上清液；
81.3)将上清液进行三次纯化增殖培养，得到噬菌体纯度最高的溶液作为噬菌体溶液；
82.4)向噬菌体溶液中加入脱脂牛奶12份、蛋白胨6份、海藻糖2份、甘露醇3份、壳聚糖1.2份、氯化钙1份、滑石粉0.5份，抗氧化剂0.4、淀粉1.2份，混合均匀形成噬菌体原液；
83.5)将所述噬菌体原液冷冻降温至4℃，并保持30min
84.6)将所述噬菌体原液转移喷雾容器中，在无菌环境下利用喷嘴将噬菌体原液进行喷射雾化，收集液氮容器冻干的噬菌体粉末，进行筛分后封入密封容器内，制备成噬菌体粉剂在4℃干燥环境进行保存。
85.实施例四
86.一种高效溶藻弧菌噬菌体粉剂的低温保存方法，包括以下步骤：
87.1)将溶藻弧菌的宿主菌接种到液体培养基中，于30℃静置12h培养
88.2)接种溶藻弧菌噬菌体至液体培养基中，振荡培养1h，再静置培养2h，经4000r/min离心后取得上清液；
89.3)将上清液进行三次纯化增殖培养，得到噬菌体纯度最高的溶液作为噬菌体溶液；
90.4)向噬菌体溶液中加入脱脂牛奶8份、蛋白胨4份、海藻糖1份、甘露醇1份、壳聚糖0.8份、氯化钙0.6份、滑石粉0.3份，抗氧化剂0.2、淀粉0.8份，混合均匀形成噬菌体原液；
91.5)将所述噬菌体原液冷冻降温至4℃，并保持30min
92.6)将所述噬菌体原液转移喷雾容器中，在无菌环境下利用喷嘴将噬菌体原液进行喷射雾化，收集液氮容器冻干的噬菌体粉末，进行筛分后封入密封容器内，制备成噬菌体粉剂在20℃干燥环境下进行保存。
93.对使用实施例一至四的噬菌体保护剂的保存1、3、6、9个月后的噬菌体污染情况以及存活率分别进行考察，如表1所示：
94.表1
[0095][0096]
如表1可知，四组噬菌体均未污染，并且可知噬菌体在9个月均内保持80％以上的存活率，且随着保护剂的添加剂量增加噬菌体的存活率也相应的得到一定程度的提高；而低温环境下的存活率要高于室温下的存活率。
[0097]
综上所述，借助于本发明的上述技术方案，通过对溶藻弧菌噬菌体进行的培养与重复多次的纯化与增殖，能够培养出高纯度的溶藻弧菌噬菌体，从而大大提高制备得到的溶藻弧菌噬菌体粉剂的药效，提高噬菌体的噬菌能力；配合预先冷冻，能够减少噬菌体原液直接进行喷雾干燥的造成的损失，同时利用超声波喷雾干燥法，大大提高了噬菌体原液的干燥效率，即干燥过程迅速、可直接干燥成粉末、生产效率高、操作人员少并且喷酒面积大、操作方便，噬菌体除菌效率高；而最终经过喷雾冷冻干燥制备的噬菌体粉剂能够大大提高噬菌体的保存时间与适应性，降低保存环境的要求，进而保证长时间内噬菌体的生物活性；并且加工效率高，适合大规模生产，有利于推进噬菌体在微生物治疗领域的快速应用与普
及。
[0098]
此外，在噬菌体原液中添加的保护剂，成分组成合理，能够保证使噬菌体免受溶液损伤和冰晶损伤等物理因素的损伤，并且维持噬菌体极高的存活率和活性，使噬菌体的活动处于半静止或静止状态。
[0099]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种高效溶藻弧菌噬菌体粉剂的低温保存方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：配置溶藻弧菌噬菌体，进行纯化与增殖得到噬菌体溶液；向所述噬菌体溶液中加入保护剂，混合均匀形成噬菌体原液；将所述噬菌体原液冷冻降温至0-4℃，并保持30min；将所述噬菌体原液转移喷雾容器中，在无菌环境下利用喷嘴将噬菌体原液进行喷射雾化，并经过含有液氮的容器形成噬菌体粉末；收集冻干的所述噬菌体粉末，进行筛分后封入密封容器内，制备成噬菌体粉剂进行保存。2.根据权利要求1所述的一种高效溶藻弧菌噬菌体粉剂的低温保存方法，其特征在于，所述配置溶藻弧菌噬菌体，进行纯化与增殖得到噬菌体溶液包括以下步骤：将溶藻弧菌的宿主菌接种到液体培养基中，于30℃静置12h培养；接种溶藻弧菌噬菌体至液体培养基中，振荡培养1-2h，再静置培养2-4h，经4000r/min离心后取得上清液；将上清液均分为6份，分别加入宿主菌，用斑点法检测噬菌体是否存在，若存在则挑选噬菌斑进行传代增殖；将上述噬菌斑培育出的噬菌体加入液体培养基采用双层琼脂法作单斑培养，并选取其中噬菌斑加入固体培养基进行增殖；再次选取噬菌斑进行培养增殖，重复三次，通过检测后选取噬菌体纯度最高的作为噬菌体母液进行增殖。3.根据权利要求2所述的一种高效溶藻弧菌噬菌体粉剂的低温保存方法，其特征在于，所述液体培养基采用ph值为7.4-7.8的牛肉汤，所述固体培养基为以液体培养基为基础加入琼脂支撑的平板。4.根据权利要求1所述的一种高效溶藻弧菌噬菌体粉剂的低温保存方法，其特征在于，所述保护剂包括以下质量份数的成分组成：脱脂牛奶8-12份、蛋白胨4-6份、海藻糖1-2份、甘露醇1-3份、壳聚糖0.8-1.2份、氯化钙0.6-1份、滑石粉0.3-0.5份，抗氧化剂0.2-0.4、淀粉0.8-1.2份。5.根据权利要求1所述的一种高效溶藻弧菌噬菌体粉剂的低温保存方法，其特征在于，所述喷嘴采用超声波喷嘴，并将所述噬菌体原液雾化成粒径大小在20-100μm的颗粒。6.根据权利要求1所述的一种高效溶藻弧菌噬菌体粉剂的低温保存方法，其特征在于，所述噬菌体粉剂保存在室温或2-7℃的干燥环境内。7.根据权利要求1所述的一种高效溶藻弧菌噬菌体粉剂的低温保存方法，其特征在于，所述含有液氮的容器内部为密封性干燥无菌的负压环境，且温度为-196℃。8.根据权利要求1所述的一种高效溶藻弧菌噬菌体粉剂的低温保存方法，其特征在于，所述噬菌体原液为中性溶液，采用稀盐酸或氢氧化钠调节溶液ph值。

技术总结
本发明公开了一种高效溶藻弧菌噬菌体粉剂的低温保存方法，该方法包括以下步骤：配置溶藻弧菌噬菌体，进行纯化与增殖得到噬菌体溶液；向所述噬菌体溶液中加入保护剂，混合均匀形成噬菌体原液；将所述噬菌体原液冷冻降温至0-4℃，并保持30min；将所述噬菌体原液转移喷雾容器中，在无菌环境下利用喷嘴将噬菌体原液进行喷射雾化，并经过含有液氮的容器形成噬菌体粉末；收集冻干的所述噬菌体粉末，进行筛分后封入密封容器内，制备成噬菌体粉剂进行保存。有益效果：通过多次纯化与增殖能够制备高效溶藻弧菌噬菌体粉剂，且经过喷雾冷冻干燥制备能够大大提高噬菌体的保存时间与适应性，降低保存环境的要求，保证噬菌体的生物活性。保证噬菌体的生物活性。保证噬菌体的生物活性。


技术研发人员：何四龙 丛郁 徐旭凌 乔欢 肖逍 许文建 丁良 樊小九 徐天舜 许小康 李涛 华雨田
受保护的技术使用者：菲吉乐科（南京）生物科技有限公司
技术研发日：2022.02.14
技术公布日：2023/8/23