一种具有N,N-二甲基甲酰胺降解功能的泛营养副球菌及其应用的制作方法

一种具有n,n-二甲基甲酰胺降解功能的泛营养副球菌及其应用
技术领域
1.本发明涉及一种泛营养副球菌(paracoccus pantotrophus)，具体涉及一种能够降解n,n-二甲基甲酰胺的泛营养副球菌、微生物菌剂、发酵方法及应用，属于环境微生物技术领域。


背景技术：

2.随着国家工业化的发展与人民生活水平的提高，用水量的日益提升与污染物的排放使得水资源污染问题变得越来越严重。
3.n,n-二甲基甲酰胺(dmf)是一种透明、接近无色的液体，可与水、醚、醇、酯、酮、不饱和烃和芳烃等混溶，有“万能溶剂”之称，广泛应用于农药、医药、工业领域中。dmf可以通过呼吸道、消化道和皮肤进入人体，由于dmf多数情况下仅作为有机溶剂而不发生化学反应，因此绝大多数会进入生产废水。
4.目前传统的物理法(萃取、吸附)、化学法(fenton氧化、光催化氧化)使用条件苛刻且处理不彻底。目前生物法筛选出来的现有菌种中，鲜少有能够对高浓度dmf具有优秀耐受性且具有相应降解作用的，实际应用中对该类菌种的需求亟待解决。


技术实现要素：

5.本发明针对目前生物法筛选出来的菌种对高浓度dmf的耐受性和降解效果所存在的不足，提供一种能够耐受高浓度dmf且具有降解功能的泛营养副球菌及其在废水处理中的应用。
6.一种具有n，n-二甲基甲酰胺降解功能的泛营养副球菌(paracoccus pantotrophus)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中科院微生物所，保藏号为cgmcc no.27001，保藏日期为2023年04月03日。
7.本发明的泛营养副球菌自化工污水中筛选分离获得，菌落圆形，白色，不透明，表面光滑湿润，边缘规则，直径约1-2mm。
8.本发明的泛营养副球菌能够降解n,n-二甲基甲酰胺(dmf)的作用机理如下：n,n-二甲基甲酰胺(dmf)在二甲基甲酰胺酶(dmfase)的作用下生成二甲胺(dma)和甲酸，随后二甲胺(dma)会在二甲胺脱氢酶的作用下形成甲胺和甲醛，接着甲胺会在甲胺脱氢酶作用下形成氨和甲醛。
9.本发明菌株的有益效果在于：
10.(1)本发明的泛营养副球菌能够耐受高浓度cod，在好氧、30℃条件下能够耐受化工废水8000ppm的cod，同时应用4d后cod的降解率达到89％；(2)在好氧、30℃条件下，针对1000ppm的dmf浓度，2d可将cod降解90％，同时最终降解后氨氮占总氮量的97％，能够有效将n,n-二甲基甲酰胺转化为氨气；
11.(3)在好氧、30℃条件下，针对5000ppm的dmf浓度，2d可将cod降解90％以上，起效迅速，效果显著；
12.(4)本发明的微生物菌剂具有活菌数高，能够降低购买菌种或微生物菌剂所需的费用，不破坏原始环境、无二次污染、处理效果好、使用方法简便、增强水体可生化性等特点。
13.本发明还要求保护包含该泛营养副球菌的微生物菌剂。
14.本发明的泛营养副球菌的发酵方法包括如下步骤：
15.(1)一级种子培养：无菌条件下，将泛营养副球菌接种于富集培养基中，置于25-35℃、100-150rpm条件下活化12-36小时，获得一级种子培养液；
16.(2)二级种子培养：无菌条件下，将步骤(1)所得的一级种子培养液按照1-3vol％的比例接种于富集培养基中，置于25-35℃、100-150rpm条件下活化12-36小时，获得二级种子培养液；
17.(3)发酵：待发酵培养基灭菌完毕后，将步骤(2)所得的二级种子培养液按照1-5vol％的比例接种于发酵培养基中，控制温度为25-35℃，通气比为(1-2):1、150-300rpm的条件下发酵，待溶氧开始上升时停止发酵，得发酵液。
18.进一步，所述富集培养基的组成为：酵母粉5g/l，蛋白胨10g/l，氯化钠10g/l，溶剂为水，且ph＝6.5-8。
19.进一步，所述发酵培养基的组成为：碳源30-40g/l，氮源5-15g/l，mg
2+
0.2-0.3g/l，po
43-0.3-0.5g/l，fe
2+
(5-15)
×
10-3
g/l，mn
2+
(1-3)
×
10-3
g/l，溶剂为水，且ph＝6.5-8。
20.进一步，所述碳源选自葡萄糖、蔗糖、淀粉、醋酸钠或酒石酸钾钠中的一种或多种。
21.进一步，所述氮源选自酵母浸粉、蛋白胨、尿素、硫酸铵或硝酸钾中的一种或多种。
22.优选的，所述po
43-的来源为磷酸氢二钾或磷酸二氢钾，所述mg
2+
的来源为硫酸镁、硝酸镁、氯化镁中的一种或多种，所述fe
2+
的来源为硫酸亚铁、氯化亚铁、硫酸亚铁铵中的一种或多种，所述mn
2+
的来源为一水硫酸锰、硝酸锰、氯化锰中的一种或多种。
23.发酵方法中所述的通气比是指每分钟内通入发酵罐的空气体积与发酵液总体积之比。
24.该发酵方法的有益效果是：采用本发明的发酵工艺，发酵周期缩短至18h，发酵残留营养物质低，活菌数高达620亿cfu/ml，菌体活力强。
25.本发明还要求保护使用上述泛营养副球菌的活化液和包含泛营养副球菌的微生物菌剂净化水体的方法，包括向水体中施加泛营养副球菌的活化液和包含泛营养副球菌的微生物菌剂的步骤。
26.优选的，泛营养副球菌的活化液和包含泛营养副球菌的微生物菌剂的接种量为100ppm以上，更优选接种量为100-10000ppm，最优选接种量为100-1000ppm。
27.优选的，净化水体过程中控制温度为20-35℃，优选25-35℃，最优选30℃。
28.本发明还要求保护上述的泛营养副球菌和微生物菌剂在水净化领域的应用，优选的，所述泛营养副球菌和微生物菌剂用于降解水中的n，n
–
二甲基甲酰胺(dmf)。
具体实施方式
29.以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并
非用于限定本发明的范围。
30.实施例1：菌株的筛选、分离与鉴定
31.1.富集
32.采集山东省潍坊市某化工厂污水，按10vol％的接种量接种至筛选培养基(n,n
–
二甲基甲酰胺1g，磷酸氢二钠6g，磷酸二氢钾3g，氯化钠0.5g，硫酸镁0.5g，氯化钙0.01g，水1000ml，ph＝7.2
±
0.1)中富集，30℃、100-150rpm恒温摇床培养7天，得到一级富集筛选液；将一级富集筛选液按10vol％接种量接种至新鲜的筛选培养基中，30℃、100-150rpm恒温摇床培养7天，得到二级富集筛选液；将二级富集筛选液按10vol％接种量接种至新鲜的筛选培养基中，30℃、100-150rpm恒温摇床培养7天，得到三级富集筛选液，每级均有三个平行。
33.2.初筛
34.采用梯度稀释法将第三次富集筛选液稀释到10-6
，分别吸取10-3
、10-4
、10-5
、10-6
稀释液各200μl至分离培养基(n,n
–
二甲基甲酰胺1g，磷酸氢二钠6g，磷酸二氢钾3g，氯化钠0.5g，硫酸镁0.5g，氯化钙0.01g，水1000ml,琼脂粉20g，ph＝7.2
±
0.1)中，涂布均匀后倒置于30℃条件下培养约48h至长出单菌落。挑选形态相异的单菌落转接至试管斜面分离培养基上，30℃条件下培养约48h，然后转移至4℃冰箱中保藏备用。
35.按上述分离方法共得到4株菌，分别编号为：dmf-xm、dmf-ss、dmf-qs、dmf-ly。
36.3.复筛
37.无菌环境中，将初筛得到的4株菌分别挑取1环接种于盛有100ml lb培养基(酵母粉5g/l，蛋白胨10g/l，氯化钠10g/l，调ph＝7.20)的250ml三角瓶中，30℃条件下静置培养48h进行活化，得活化液。
38.分别吸取100μl各活化液接种至含100ml已灭菌的评价培养基(n,n
–
二甲基甲酰胺1g，磷酸氢二钠6g，磷酸二氢钾3g，氯化钠0.5g，硫酸镁0.5g，氯化钙0.01g，水1000ml，ph＝7.2
±
0.1)的250ml三角瓶中，控制评价培养基中n,n
–
二甲基甲酰胺为唯一的碳、氮源，于30℃、150r/min的条件下培养。用无菌水代替活化液作为空白，各实验组设置3个平行。定期检测培养基中的cod、总氮、氨氮含量。
39.cod检测方法按照《hj 828-2017水质化学需氧量的测定重铬酸盐法》执行，结果如表1所示：
40.表1.各菌株接种评价培养基后cod检测结果
41.[0042][0043]
由表1中结果可知，该4株菌中dmf-qs菌株对n,n
–
二甲基甲酰胺产生的cod存在高效的降解能力，对n,n
–
二甲基甲酰胺产生的cod的24h降解率为89％，相对其他菌株来说，起效快且稳定。
[0044]
总氮检测方法按照《hj 636-2012水质总氮的测定碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法》执行，氨氮检测方法按照《hj 535-2009氨氮的测定-纳氏试剂分光光度法》执行。结果如表2所示：
[0045]
表2.各菌株接种评价培养基后总氮及氨氮检测结果
[0046][0047]
由表2中结果可知，该4株菌中dmf-qs菌株48h可以将n,n
–
二甲基甲酰胺降解为氨氮，降解完成后氨氮占总氮的比例为97％，表明该dmf-qs菌株已将97％的n,n
–
二甲基甲酰胺转化为了氨气。
[0048]
实施例2：菌株的鉴定
[0049]
1、实验方法
[0050]
1.1细菌基因组dna的提取
[0051]
(1)用2ml离心管收集1.0
×
109(1ml菌液od
600
为1-1.5)的细菌培养物，12,000
×
g离心30s，弃尽上清。用150μl已加入rnase a的buffer s悬浮沉淀。
[0052]
(2)加入20μl溶菌酶贮存液，混合均匀，室温静置5min。
[0053]
(3)加入30μl 0.25mol/l edta(ph 8.0)，混合均匀，冰浴5min。
[0054]
(4)加入450μl buffer g-a，旋涡振荡15s，65℃水浴10min。
[0055]
(5)加入400μl buffer g-b和1ml buffer dv(4℃预冷)，用力混合，12,000
×
g离心2min。
[0056]
(6)尽可能丢弃上相，保留相间沉淀和下相。加入1ml 4℃预冷buffer dv，用力混合，12,000
×
g离心2min。
[0057]
(7)丢弃上相，将下相转移至滤器(滤器置于2ml离心管中)，12,000
×
g离心1min。
[0058]
(8)弃滤器，在滤液中加入400μl buffer bv，混合均匀。
[0059]
(9)将制备管置于2ml离心管中，将步骤8中的混合液移入制备管中，12,000
×
g离心1min。
[0060]
(10)弃滤液，将制备管置回到原2ml离心管中，加入500μl buffer w1，12,000
×
g离心1min。
[0061]
(11)弃滤液，将制备管置回到原2ml离心管中，加入700μl buffer w2，12,000
×
g离心1min。
[0062]
(12)以同样的方法再用700μl buffer w2洗涤一次。
[0063]
(13)弃滤液，将制备管置回到原2ml离心管中，12,000
×
g离心1min。
[0064]
(14)将制备管置于另一洁净的1.5ml离心管中，在silica膜中央加100-200μl eluent或去离子水，室温静置1min。12,000
×
g离心1min洗脱dna。
[0065]
2、细菌基因组pcr扩增
[0066]
表3 pcr扩增引物设计
[0067]
引物名称序列27f5-agagtttgatcctggctcag-3 1492r5-ctacggctaccttgttacga-3
[0068]
pcr扩增反应体系
[0069]
在0.2ml离心管中加入以下成分：
[0070]
表4 pcr扩增反应体系
[0071]
试剂体积基因组dna(20ng/μl)1.0μl10
×
buffer(含2.5mmol/l mg
2+
)5.0μltaq聚合酶(5u/μl)0.5μldntp(10mm)1.0μl27f引物(10um)1.0μl1492r引物(10um)1.0μlddh2o40.5μl总体积50.0μl
[0072]
轻弹混匀，瞬时离心收集管壁上的液滴至管底，在pcr扩增仪上进行pcr反应，反应参数如表5所示：
[0073]
表5 pcr扩增反应程序
[0074]
预变性变性退火延伸终延伸循环数95℃，5min95℃，30s57℃，30s72℃，1min30s72℃，7min35
[0075]
反应完成后，取3μl pcr产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，根据dna marker条带确认pcr扩增片段大小。
[0076]
3、pcr产物的回收
[0077]
pcr产物用tiangendna纯化回收试剂盒回收，具体操作按试剂盒说明书进行，步骤如下：
[0078]
(1)在紫外灯下切下含有目的dna片段的琼脂糖凝胶放入干净的离心管中，称取凝胶重量。
[0079]
(2)加入2倍凝胶重量的体积的buffer de-a，混合均匀后于65℃加热直至凝胶块完全熔化。
[0080]
(3)加0.5个buffer de-a体积的buffer de-b，混合均匀。
[0081]
(4)将混合液转移到dna制备管12,000
×
g离心1min，弃滤液。
[0082]
(5)将制备管置回2ml离心管，加500μl buffer w1，12,000
×
g离心30s，弃滤液。
[0083]
(6)将制备管置回2ml离心管，加700μl buffer w2，12,000
×
g离心30s，弃滤液。以同样的方法再用700μl buffer w2，12,000
×
g离心1min。
[0084]
(7)将制备管置回2ml离心管中，12,000
×
g离心1min。
[0085]
(8)将制备管置于洁净的1.5ml离心管(试剂盒内提供)中，在制备膜中央加30-50μl去离子水，室温静置1-2min。12,000
×
g离心1min洗脱dna。
[0086]
4、序列测定与分析
[0087]
取纯化后的pcr产物，使用测序仪abi3730-xl进行16s rdna基因序列测定，测定结果如seq id no:1所示。
[0088]
5、序列分析
[0089]
将测序得到的序列两端拼接后得到的全长序列提交到ncbi(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)数据库中进行比对，相似度高于97％视为同一种，作为物种鉴定结果，鉴定结果为泛营养副球菌(paracoccus pantotrophus)
[0090]
实施例3：泛营养副球菌的dmf浓度耐受实验
[0091]
1.菌种的活化
[0092]
无菌环境中挑取1环泛营养副球菌接入装有100ml营养肉汤培养基(牛肉粉3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，水1000ml，调ph＝7.20)的250ml三角瓶中，后置于30℃、120rpm条件下培养24h，得到活化菌液，稀释活菌含量至50亿cfu/ml待用。
[0093]
2.配制评价培养基进行降解效果评价
[0094]
评价培养基：n,n
–
二甲基甲酰胺(根据评价培养基所需浓度添加)，磷酸氢二钠6g，磷酸二氢钾3g，氯化钠0.5g，硫酸镁0.5g，氯化钙0.01g，水1000ml，ph＝7.2
±
0.1。
[0095]
无菌环境中，分别向装有100ml评价培养基的250ml顶空瓶中加入活化菌液100μl，置于30℃、150r/min条件下培养，每隔24h检测培养基中的cod、氨氮、总氮含量。共设置1个用无菌水替代活化菌液的空白对照组。具体实验安排如下：
[0096]
(1)实验组1：dmf浓度1000mg/l，活化菌液添加量100ppm，30℃培养；
[0097]
(2)实验组2：dmf浓度3000mg/l，活化菌液添加量100ppm，30℃培养；
[0098]
(3)实验组3：dmf浓度5000mg/l，活化菌液添加量100ppm，30℃培养；
[0099]
(4)空白对照组：以上实验组1/2/3分别设置相同dmf浓度的对照组，对照组添加等量的无菌水。
[0100]
表6.实验组1的评价检测结果
[0101][0102]
根据表6可知，评价培养基设定dmf浓度1000mg/l时，评价2d后cod降解率在90％，氨氮占总氮值为97％，泛营养副球菌在dmf浓度1000mg/l的评价培养基中降解效果与空白对照相比效果显著，且将dmf转化为氨气的效果显著。
[0103]
表7.实验组2的评价检测结果
[0104][0105][0106]
根据表7可知，评价培养基设定dmf浓度3000mg/l时，评价2d后cod降解率在90％，氨氮占总氮值为31％，泛营养副球菌在dmf浓度3000mg/l的评价培养基中降解效果与空白对照相比效果显著，但将dmf转化为氨气的程度有限。
[0107]
表8.实验组3的评价检测结果
[0108][0109]
根据表8可知，评价培养基设定dmf浓度5000mg/l时，评价2d后cod降解率在90％，氨氮占总氮值为23％，泛营养副球菌在dmf浓度5000mg/l的评价培养基中降解效果与空白对照相比效果显著，但将dmf转化为氨气的程度有限。
[0110]
实施例4：泛营养副球菌在实际废水中的评价实验
[0111]
1.菌种的活化
[0112]
无菌环境中挑取1环泛营养副球菌接入装有100ml营养肉汤培养基(牛肉粉3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，水1000ml，调ph＝7.20)的250ml三角瓶中，后置于30℃、120rpm条件下培养24h，得到活化菌液，稀释活性菌含量至50亿cfu/ml待用。
[0113]
2.泛营养副球菌在实际废水中的评价实验
[0114]
实验污水取自山东潍坊寒亭区某化工厂实际含有高浓度dmf的污水。
[0115]
分别向装有100ml山东潍坊寒亭区某化工厂污水的250ml顶空瓶中加入活化菌液100μl，置于30℃、150r/min条件下培养，每隔24h检测污水中的cod、氨氮、总氮含量。共设置
1个用无菌水替代活化菌液的空白对照组。具体实验安排如下：
[0116]
(1)空白对照组：不加活化菌液；
[0117]
(2)实验组：活化菌液添加量1000ppm，30℃培养；
[0118]
表9.泛营养副球菌在实际废水中的评价实验
[0119][0120]
由表9可知，泛营养副球菌的实验组在接种量为1000ppm时，实验4d后cod降解率为89％，氨氮占总氮值为89％，菌株dmf-qs在实际dmf化工污水中降解效果与空白对照相比效果显著。
[0121]
实施例5：微生物菌剂的制备与储存
[0122]
5.1微生物菌剂的制备：
[0123]
(1)一级种子培养：无菌环境中挑取1环泛营养副球菌接入装有100ml富集培养基(酵母粉5g/l，蛋白胨10g/l，氯化钠10g/l，溶剂为水，调ph＝7.20)的250ml三角瓶中，置于30℃、120rpm条件下培养24h，得到一级种子培养液；
[0124]
(2)二级种子培养：无菌环境中，将一级种子培养液分别转接5ml至四个装有500ml富集培养基(酵母粉5g/l，蛋白胨10g/l，氯化钠10g/l，溶剂为水，调ph＝7.20)的1l三角瓶中，置于30℃、120rpm条件下培养24h，得到二级种子培养液；
[0125]
(3)消毒灭菌：培养基物料均在配料罐中配料，然后打入发酵罐，发酵培养基的组成为：酒石酸钾钠35.7g/l，酵母粉7g/l，磷酸氢二钾0.43g/l，硫酸镁0.26g/l，硫酸锰0.007g/l，硫酸亚铁0.036g/l，调ph＝7.20，配制定位30l，开始消毒灭菌。发酵罐实消条件：蒸汽直接进内层升温，110℃开始排汽，排汽时间：20分钟，排汽温度：115℃，发酵罐培养基实消条件：蒸汽直接进内层升温至118℃开始排汽，排汽时间30分钟，排汽温度121℃，消毒后体积约33l，然后冷却至30℃，等待接种；
[0126]
(4)发酵：待发酵罐内的发酵培养基消毒完毕后，将步骤(2)所得的二级种子培养液按照1-5vol％的接种量接种于发酵培养基中，控制温度为25-35℃，通气比为(1-2):1、150-300rpm的条件下发酵，待溶氧开始上升时停止发酵，放料得发酵液；
[0127]
(5)制备微生物菌剂：将步骤(4)所得的发酵液稀释至所需活菌数，即得微生物菌剂，该微生物菌剂与活化菌液在应用中具有相同的功能和效果。
[0128]
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种具有n，n-二甲基甲酰胺降解功能的泛营养副球菌(paracoccus pantotrophus)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为cgmcc no.27001。2.一种微生物菌剂，其特征在于，包含权利要求1所述的泛营养副球菌。3.权利要求1所述泛营养副球菌的发酵方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)一级种子培养：无菌条件下，将该泛营养副球菌接种于富集培养基中，置于25-35℃、100-150rpm条件下活化12-36小时，获得一级种子培养液；(2)二级种子培养：无菌条件下，将步骤(1)所得的一级种子培养液按照1-3vol％的比例接种于富集培养基中，置于25-35℃、100-150rpm条件下活化12-36小时，获得二级种子培养液；(3)发酵：待发酵培养基灭菌完毕后，将步骤(2)所得的二级种子培养液按照1-5vol％的比例接种于发酵培养基中，控制温度为25-35℃，通气比为(1-2):1、150-300rpm的条件下发酵，待溶氧开始上升时停止发酵，得发酵液。4.根据权利要求3所述的发酵方法，其特征在于，所述富集培养基的组成为：酵母粉5g/l，蛋白胨10g/l，氯化钠10g/l，溶剂为水，且ph＝6.5-8。5.根据权利要求3或4所述的发酵方法，其特征在于，所述发酵培养基的组成为：碳源30-40g/l，氮源5-15g/l，mg
2+
0.2-0.3g/l，po
43-0.3-0.5g/l，fe
2+
(5-15)
×
10-3
g/l，mn
2+
(1-3)
×
10-3
g/l，溶剂为水，且ph＝6.5-8。6.根据权利要求5所述的发酵方法，其特征在于，所述碳源选自葡萄糖、蔗糖、淀粉、醋酸钠或酒石酸钾钠中的一种或多种；所述氮源选自酵母浸粉、蛋白胨、尿素、硫酸铵或硝酸钾中的一种或多种。7.一种净化水体的方法，其特征在于，包含向水体中施加权利要求1所述泛营养副球菌的活化液或权利要求2所述微生物菌剂的步骤。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述泛营养副球菌的活化液和微生物菌剂的接种量为100ppm以上，优选接种量为100-10000ppm，最优选接种量为100-1000ppm。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，净化水体过程中控制温度为20-35℃，优选25-35℃，最优选30℃。10.权利要求1所述的泛营养副球菌和权利要求2所述的微生物菌剂在水净化领域的应用，优选的，所述泛营养副球菌和微生物菌剂用于降解水中的n，n
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二甲基甲酰胺。

技术总结
本发明涉及一种具有N，N-二甲基甲酰胺降解功能的泛营养副球菌、包含其的微生物菌剂、发酵方法及应用，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.27001。本发明的泛营养副球菌能够耐受高浓度COD，在好氧、30℃条件下能够耐受化工废水8000ppm的COD，同时应用4d后COD的降解率达到89％；在好氧、30℃条件下，针对1000ppm的DMF浓度，2d可将COD降解90％，同时最终降解后氨氮占总氮量的97％，能够有效将N,N-二甲基甲酰胺转化为氨气。酰胺转化为氨气。


技术研发人员：孙业浩 温胜国 郑素娟 刘圣鹏 刘君
受保护的技术使用者：青岛蔚蓝赛德生物科技有限公司
技术研发日：2023.05.12
技术公布日：2023/8/23