具有可用于DNA适体筛选的新型人工碱基的脱氧核糖核苷、脱氧核糖核苷酸、及核酸的制作方法

具有可用于dna适体筛选的新型人工碱基的脱氧核糖核苷、脱氧核糖核苷酸、及核酸
技术领域
1.本发明涉及具有可用于dna适体筛选的新型人工碱基的脱氧核糖核苷或脱氧核糖核苷酸、及含有其的核酸。


背景技术：

2.dna适体是具有30个碱基至70个碱基的链长的单链dna通过自退火而形成热力学上稳定的特定的立体结构，从而变得可以与低分子化合物和蛋白质等靶分子特异地发生相互作用的dna分子种的总称。dna适体由于其对靶分子的亲和性和与靶分子的相互作用的选择性与抗体同等良好，也被称为合成抗体，被期待为下一代的用于新药创制的形态。
3.另一方面，2011年指数富集配体的系统进化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment，selex)法的专利(专利文献1)的存续期限结束后，适体的研究逐年变得活跃，但作为药物上市了的适体至今仅macugen(注册商标)1种制品。作为其理由，dna适体的药物代谢动力学性质被认为是较主要的原因，除此之外，因dna适体所具有的物性而难以获得与靶分子结合的适体也被认为是原因之一，换言之，由于dna适体所具有的物性，可获得适体的靶分子的多样性受到限制。
4.现有技术文献
5.专利文献
6.专利文献1:美国专利第5475096号说明书


技术实现要素：

7.发明所要解决的技术问题
8.对可获得dna适体的靶分子的多样性产生限制的主要原因被认为如下。
9.(1)dna的情况下，被广泛使用的作为构成单位的核酸碱基限于天然型的4种(a、t、g、c)。因此，与天然型氨基酸存在20种相比，天然型核酸碱基用于形成相互作用的构成单位少，所以形成相互作用的组合的种类也相应地缺乏。
10.(2)dna的情况下，天然型的4种核酸碱基的碱基部分被用于与蛋白质等靶分子直接相互作用，天然型的碱基部分的结构缺乏柔软性，脂溶性也并没有那么强，所以不能说适合作为期待脂溶性相互作用的部分结构。
11.(3)含dna的寡聚核酸在磷酸结合部分带负电荷。因此，寡聚核酸与带负电荷的靶分子产生静电排斥，所以难以相互作用，可作为适体的靶点的分子种类存在限制。
12.关于dna适体创制中的上述限制，美国的索玛逻辑公司(somalogic,inc.)获得基于selex法的种子适体(seed aptamer)后，通过以化学合成方式引入导入有柔性脂溶性取代基的人工碱基的方法(后修饰(post modification)法)尝试解决。经过反复试验对dna适体的活性最适化，索玛逻辑公司成功获得了超过1000种以蛋白质为靶分子的适体(larry gold等,plos one,2010,5(11):e15004；gupta s等,j.biol.chem.(2014)p8706-19)。
13.然而，现阶段没有推测寡聚核酸的高级结构的手段，因此导入有脂溶性取代基的人工碱基的引入并不一定能够实现活性的提高。该后修饰法需要大量采用诱导适体合成的反复试验，所以效率非常差，成本高，活性也以kd值计极限为数十nm，作为低成本的适体获得方法，存在改善的余地。另外，如上所述，dna适体在磷酸结合部分带负电荷，因此难以与带负电荷的靶分子发生相互作用。作为获得或改善与带负电荷的靶分子结合的dna适体的手段，可考虑将导入有带正电荷的取代基的人工碱基引入dna适体的方法。然而，通过selex法获得的dna适体在多数情况下自身所具有的磷酸结合部分与靶分子的带正电荷的部分结构发生相互作用，因此通过后修饰将具有带正电荷的取代基的人工碱基引入适体会导致静电排斥，可能会有反效果。因此，为了获得让dna适体获得对带负电荷的靶分子的充分的相互作用，认为重要的是并非在选择带正电荷的取代基之后修饰碱基部分引入，而是在用于selex法的dna文库中事先导入具有带正电荷的取代基的人工碱基，这是优选的。换言之，可认为基于后修饰法，对于带负电荷的靶分子难以高效地获得dna适体。
14.另一方面，平尾等在任职于理化学研究所期间开发了能以高准确度进行pcr的高脂溶性的人工碱基对(ds-px)(日本专利第5424414号；nucleic acids research,2009(37),e14)，仅将数个ds(7-(2-噻吩基)-3h-咪唑并[4,5-b]-吡啶-3-基)导入selex中使用的文库进行适体的选择，对于数种蛋白质成功获得了具有以kd值计达到数pm的极高亲和性的适体(日本专利第6307675号；michiko kimoto等,nature biotechnology,2013(31),453-457)。该方法的特征之一是不需要后修饰，因此可短时间内低成本地获得dna适体。另一方面，并未能够扩展可获得dna适体的靶蛋白的多样性。作为其理由，ds与天然碱基相比，脂溶性高，但是结构上缺乏柔软性，被认为无法实现足以克服电荷影响而结合的与靶分子的充分的相互作用。
[0015]
本发明是鉴于这样的情况而完成，目的是克服上述的现有方法中的dna适体获得的问题，即，与靶分子的相互作用的多样化的欠缺、基于后修饰的适体获得的成本增加、电荷导致的靶分子种类的限制等问题，提供尽可能低成本地获得高活性适体的技术。
[0016]
用于解决课题的方法
[0017]
为了解决上述课题，本发明的可用于dna适体筛选的新型人工碱基及含有其的核酸具有以下的构成。
[0018]
本发明的第一种形态是一种具有下述式i的结构作为碱基的脱氧核糖核苷或脱氧核糖核苷酸；
[0019]
[化1]
[0020]
[0021]
式i中，r1为取代c
1-c3烷基、取代或无取代c
4-c9烷基、取代或无取代芳基、取代或无取代环烷基、取代或无取代芳烷基、取代或无取代杂芳基。
[0022]
所述第一种形态中，所述式i中，r1可以为苯基、4-吡啶基、萘基、异丙基、环戊基。
[0023]
本发明的所述第一种形态中，可以是5'-羟基具有三磷酸的脱氧核糖核苷酸。
[0024]
本发明的所述第一种形态中，可以是5'-羟基具有保护基、3'-羟基具有亚磷酰胺基或h-膦酸酯基的脱氧核糖核苷。
[0025]
本发明的第二种形态是一种寡聚核酸合成用试剂，其中，包含所述第一种形态的脱氧核糖核苷或脱氧核糖核苷酸。
[0026]
本发明的第三种形态是一种医药品，其中，包含所述第一种形态的核苷或核苷酸。
[0027]
本发明的第四种形态是一种所述第一种形态的脱氧核糖核苷的合成方法，其中，包括进行2-溴噻吩衍生物与2-氨基-3-硝基-4-氯吡啶或7-氯-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶衍生物的偶联反应的工序。
[0028]
所述第四种形态中，在铃木偶联反应条件下进行所述偶联反应。
[0029]
本发明的第五种形态是一种寡聚脱氧核糖核酸，其中，内含所述第一种形态的具有碱基的脱氧核糖核苷。所述寡聚脱氧核糖核酸可以为dna适体。
[0030]
本发明的第六种形态是一种寡聚核酸或其衍生物，其中，包含所述第五种形态的寡聚脱氧核糖核酸作为部分结构。
[0031]
本发明的第七种形态是一种修饰体，其中，它是使独立的任意的分子种结合于所述第五种形态的寡聚脱氧核糖核酸、或者所述第六种形态的寡聚核酸或其衍生物而得的修饰体。
[0032]
本发明的第八种形态是一种人或动物用医药品、该医药品的原料、健康食品的添加物、或者诊断试剂，其中，含有所述第五种形态的寡聚脱氧核糖核酸、所述第六种形态的寡聚核酸或其衍生物、或者所述第七种形态的修饰体。
[0033]
本发明的第九种形态是一种以疾病治疗、救生、症状的维持管理或全身状态的维持管理为目的的医药用品，其中，含有所述第五种形态的寡聚脱氧核糖核酸、所述第六种形态的寡聚核酸或其衍生物、或者所述第七种形态的修饰体。该医药用品可以为医疗用材料、医疗用器材、医疗仪器或医疗用制品。
[0034]
本发明的第十种形态是一种用于亲和柱层析的载体、具备该载体的柱、或者具备该载体的物质分离用仪器或医疗仪器，其中，含有所述第五种形态的寡聚脱氧核糖核酸、所述第六种形态的寡聚核酸或其衍生物、或者所述第七种形态的修饰体。
[0035]
发明的效果
[0036]
本发明所涉及的具有人工碱基的核苷通过包括进行2-溴噻吩衍生物与2-氨基-3-硝基-4-氯吡啶的偶联反应的工序的合成方法合成，从而可以在不使用广泛采用的含锡中间体的情况下进行偶联反应。由此，不会排放含锡的废弃物，因此可实现减小了环境负荷的合成方法。此外，合成核苷时，可实现更大规模的合成。
[0037]
通过将本发明所涉及的具有人工碱基的脱氧核糖核苷事先导入dna适体，通过人工碱基部分所具有的官能团，可使dna适体与靶分子的相互作用的能力提高。此外，内含本发明的具有人工碱基的脱氧核糖核苷的dna可实现高准确度的pcr，所以可从选择的阶段引入人工碱基所具有的官能团，不需要后修饰。由此，dna适体获得的工序减少，能够以更低成
本获得。此外，通过将包含具有在生理条件下带正电荷的官能团的杂环的具有人工碱基的核苷导入selex用单链dna文库，还可实现以往被认为困难的与带负电荷的部分结构的相互作用。
[0038]
内含本发明所涉及的具有碱基的脱氧核糖核苷的寡聚脱氧核糖核酸可更柔性地，与更广范围的靶蛋白发生适当的相互作用。
附图说明
[0039]
图1是表示使用ddsbn体池对vegf165实施筛选而得的dna池的显示对目标蛋白质的亲和性的emsa的结果的图。
[0040]
图2是表示ddsbn体候选序列的显示对vegf165的结合亲和性的emsa的结果的图。
[0041]
图3是表示使用ddsbn体池对sil-6r实施筛选而得的dna池的显示对目标蛋白质的亲和性的emsa的结果的图。
[0042]
图4是表示ddsbn体候选序列的显示对sil-6r的结合亲和性的emsa的结果的图。
[0043]
图5是表示使用ddscp体池对vegf165实施筛选而得的dna池的显示对目标蛋白质的亲和性的emsa的结果的图。
[0044]
图6是表示ddscp体候选序列的显示对vegf165的结合亲和性的emsa的结果的图。
[0045]
图7是表示使用ddscp体池对sil-6r实施筛选而得的dna池的显示对目标蛋白质的亲和性的emsa的结果的图。
[0046]
图8是表示ddscp体候选序列的显示对sil-6r的结合亲和性的emsa的结果的图。
具体实施方式
[0047]
本发明人鉴于上述的现有技术的问题，认为提供可在selex法中使用，即，整合的dna可高准确度地实现pcr，可与靶分子更柔性地相互作用的人工碱基能够成为用于解决课题的手段，具体来说，以开发满足以下条件的人工碱基为目的进行了认真研究：
[0048]
(1)可作为dna或寡聚核酸的单元在化学合成中使用；
[0049]
(2)可通过pcr扩增；
[0050]
(3)具有可与靶分子柔性地发生适当的相互作用的部分结构；
[0051]
(4)具有在与靶分子相互作用的条件下带正电荷的部分结构。
[0052]
本发明人通过对于已知可用pcr扩增且也能用于selex法的ds(7-(2-噻吩基)-3h-咪唑并[4,5-b]-吡啶-3-基)引入脂溶性取代基或具有阳离子性的部分结构的取代基进行改造，从而完成了本实施方式所涉及的发明。
[0053]
通过脂溶性取代基的引入，可期待如下的效果：
[0054]
·
因形成与靶分子的更有效的疏水性相互作用而亲和性提高；
[0055]
·
由于水溶性因分子整体的脂溶性提高而下降，促进水中的与靶分子的复合物的形成。
[0056]
此外，通过具有阳离子性的部分结构的取代基的引入，可期待如下的效果：
[0057]
·
对于以往一直被认为dna适体难以结合的带负电荷的靶分子，也可期待适当的相互作用，获得适体的可能性提升；
[0058]
·
对于以往一直被认为难以获得适体的糖链，获得适体的可能性提升。
[0059]
以下，对本实施方式所涉及的具有人工碱基的脱氧核糖核苷或脱氧核糖核苷酸、及含有其的寡聚脱氧核糖核酸的实施方式进行说明。
[0060]
1.具有人工碱基的核苷和核苷酸
[0061]
本发明所涉及的人工碱基可通过包括进行与2-氨基-3-硝基-4-氯吡啶的偶联反应的工序的方法合成。通过以铃木偶联反应条件进行该偶联反应，可在不使用广泛采用的含锡中间体的情况下进行偶联反应。由此，不会排放含锡的废弃物，因此与使用含锡中间体的以往方法相比，可实现减小了环境负荷的合成方法。此外，可实现更大规模的合成。
[0062]
本说明书中，“人工碱基”是指具有与存在于自然界的天然型核苷的碱基部分类似的性质的以人工方式形成的核酸碱基近似物。本实施方式所涉及的人工碱基具有选择性且特异性地形成碱基对的互补人工碱基。在人工碱基对间，不仅限于用于天然型碱基间的碱基对形成的氢键，可形成基于人工碱基的结构或形状的物理键合或者基于如π-π相互作用等堆积相互作用、具有正电荷或负电荷的部位的静电键合。本说明书中，“ds”是指作为人工碱基之一的7-(2-噻吩基)-3h-咪唑并[4,5-b]-吡啶-3-基。
[0063]
本说明书中，“核苷”是指碱基部分与糖通过糖苷键结合而得的化合物。此外，本说明书中，术语“核苷酸”是指核苷的5'-或3'-羟基与磷酸结合而形成了磷酸酯的化合物。
[0064]
本说明书中，“脂溶性取代基”表示仅由碳、氢、卤素原子构成的取代基。此外，本说明书中，“阳离子性取代基”表示作为含氮原子构成的取代基，在ph4～8的范围内，氮原子被质子化带上正电荷而形成阳离子的取代基。此外，本说明书中，“人工碱基的衍生物”是指人工碱基的一部分被取代为上述的脂溶性取代基或阳离子性取代基、或者其他官能团的碱基类似物。
[0065]
对于本实施方式的具有人工碱基的核苷，还可用作医药品。例如，本实施方式的人工碱基的结构与腺苷衍生物类似，所以可考虑用作腺苷受体的调节剂(dilip k tosh等,j.med.chem.,2012(55),4847-4860)。
[0066]
2.具有人工碱基的核苷亚磷酰胺和核苷三磷酸
[0067]
将本实施方式的具有人工碱基的核苷的5'-羟基用适当的保护基进行了保护的3'-亚磷酰胺可在与天然碱基同样的条件下通过固相合成法，作为dna或寡聚核酸的构成要素用于dna的化学合成。具体来说，可将本实施方式所涉及的具有人工碱基的核苷的5'-羟基保护-3'-亚磷酰胺与天然型或修饰核苷亚磷酰胺组合，通过通用的dna的化学合成装置合成具有所需链长的dna。
[0068]
亚磷酰胺部分可以是广泛采用的2-氰基乙基-n,n'-二异丙基亚磷酰胺，也可以2-氰基乙基为其他的磷酸保护基，n,n'-二异丙基亚磷酰胺为其他合适的氨基。此外，还可以是n-o间结合的环状酰胺。
[0069]
本实施方式的具有人工碱基的核苷的5'-三磷酸可通过通用的化学合成法合成。
[0070]
3.含有具有人工碱基的核苷的核酸
[0071]
本实施方式的具有人工碱基的核苷酸可与互补人工碱基px形成碱基对，因此能够在pcr中发挥作用。即，通过向pcr溶液中与本实施方式的具有人工碱基的核苷的5'-三磷酸一起事先添加具有px的核苷的5'-三磷酸，本实施方式的人工碱基与px形成碱基对而得的双链dna通过pcr被扩增。因此，可用于基于需要pcr的selex法的适体筛选。采用pcr扩增的dna合成时的人工碱基的引入数在1个dna中适当为1～5个，较好是3个以下。此外，1个dna中
包含多个人工碱基的情况下，1个dna中所含的人工碱基可相同，也可包含形成其他碱基对的人工碱基。此外，可在同一条链中形成碱基对，形成二级结构和三级结构。
[0072]“适体”一般是指与特定的分子结合的中分子尺寸(10个～100个碱基)的寡聚核酸或肽、或者其衍生物或修饰体。包含本实施方式的人工碱基并与某一特定分子结合的寡聚核酸或dna被分类至dna适体的类别。
[0073]
dna适体也可作为适体本身使用，但还可作为在5'末端或3'末端附加了具有针对酶解或光、热等物理刺激导致的分解而对自身的一级结构和二级、三级结构进行保护、使其稳定等其他功能的寡聚核酸的附加体、实施了peg(聚乙二醇)化或糖基化的修饰体、与药物的复合物、如抗体-适体复合物等修饰体、如二价适体(bivalent)等纯合多价适体、如双特异性适体(bispecific)等异多价适体使用。
[0074]
引入本实施方式的人工碱基而制成的dna适体可用作人或动物用的医药品或其原料、医疗用材料、用于药物递送的工具、例如亲和柱层析等用于特定的物质或细胞分离纯化的工具或模块、用于检测特定物质的传感器、健康食品的添加物、诊断试剂。用于亲和柱层析的情况下，通过使dna适体结合于载体，将样品供于具备该载体的柱层析，可分离与dna适体选择性结合的物质。作为将亲和柱层析应用于医疗材料或医疗仪器的具体例子，有析离(apheresis)。
[0075]
本说明书中，“核酸”、“寡聚核酸”或“核酸分子”是指多个核苷酸介以磷酸二酯键连结而得的生物高分子。此外，本说明书中，“dna”是指脱氧核糖核苷酸介以磷酸二酯键连结而得的生物高分子。根据情况，使核苷酸间结合的磷酸二酯部分的一部分可以是像硫代磷酸酯这样经修饰的磷酸酯。本说明书中的“核酸”、“寡聚核酸”或“核酸分子”中包括单链或双链的dna。根据情况，本说明书中的“核酸”、“寡聚核酸”或“核酸分子”可形成三链、四链，还可根据情况为dna与rna的嵌合分子。根据情况，本说明书中的“核酸”、“寡聚核酸”或“核酸分子”中，形成核苷的脱氧核糖或核糖的2'-位可以被氟、甲氧基等进行了修饰。
[0076]
实施例
[0077]
〔实施例1〕
[0078]
7-(5-苄基噻吩-2-基)-3-(2-脱氧-1-β-d-呋喃核糖基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶(化合物1)的合成
[0079]
＜工序1:2-溴-5-苄基噻吩的合成＞
[0080]
[化2]
[0081][0082]
在氩气气氛下，将2-溴噻吩(50.0g，307mmol)溶解于四氢呋喃(700ml)，用干冰/丙酮浴冷却(内温-60℃)。加入四甲基乙二胺(55.5ml，368mmol)，在将内温保持在-55℃以下的同时，滴加二异丙基氨基锂的1.1m正己烷/四氢呋喃溶液(355ml，368mmol)，就这样搅拌1小时。向反应液中加入溴化苄(43.6ml，368mol)，升温至室温，搅拌20小时。确认原料消失后，向反应液中添加饱和氯化铵(1l)，用庚烷/乙酸乙酯＝1/1溶液萃取2次。合并有机层并用饱和食盐水清洗后，分液，用无水硫酸钠干燥。滤去无水硫酸钠，将滤液在减压下浓缩。将浓缩残渣用硅胶层析(展开溶剂:庚烷)纯化，作为白色固体获得2-溴-5-苄基噻吩(29.1g)。
[0083]1h-nmr(cdcl3,400mhz)δ(ppm):4.06(s,2h),6.54-6.55(m,1h),6.85(d,j＝3.7hz,1h),7.21-7.25(m,3h),7.28-7.33(m,2h).
[0084]
＜工序2:5-苄基噻吩-2-基硼酸频哪醇酯的合成＞
[0085]
[化3]
[0086][0087]
将2-溴-5-苄基噻吩(20.2g，80mmol)溶解于1,4-二噁烷(200ml)，在氩气气氛下，加入联硼酸频那醇酯(40.5g，160mmol)、二氯化[1,1'-双(二苯基膦)二茂铁]钯(ii)二氯甲烷加成物(4.89g，5.98mmol)、乙酸钾(23.5g，239mmol)，在90℃搅拌2小时。确认原料消失后，向反应液中加入水和庚烷/乙酸乙酯＝1/1溶液的混合溶液，搅拌后，分液。将水层用庚烷:乙酸乙酯＝1:1的溶液萃取1次。合并有机层后，用饱和食盐水清洗，用无水硫酸钠干燥，过滤。将滤液在减压下浓缩，残渣用硅胶层析(中性硅胶，展开溶剂:庚烷/乙酸乙酯＝1/0
→
9/1)纯化，作为黄色固体获得5-苄基噻吩-2-基硼酸频哪醇酯(12.3g)。
[0088]1h-nmr(cdcl3,400mhz)δ(ppm):1.31(s,12h),4.18(s,2h),6.87-6.89(m,1h),7.19-7.31(m,5h),7.47(2.3hz,1h).
[0089]
＜工序3:2-氨基-3-硝基-4-(5-苄基噻吩-2-基)吡啶的合成＞
[0090]
[化4]
[0091][0092]
将5-苄基噻吩-2-基硼酸频哪醇酯(12.3g)、2-氨基-3-硝基-4-氯吡啶(5.69g，32.8mmol)溶解于1,4-二噁烷/水＝10/1(242ml)后，脱气，在氩气气氛下，加入碳酸铯(21.4g，65.6mmol)、四(三苯基膦)钯(0)(1.89g，1.64mmol)，在90℃搅拌2小时30分钟。确认原料消失后，向反应液中加入水和乙酸乙酯的混合溶液，搅拌，分液。将水层用乙酸乙酯萃取1次，合并有机层后，用无水硫酸钠干燥，过滤，在减压下浓缩。将浓缩残渣用硅胶层析(中性硅胶，展开溶剂:庚烷/乙酸乙酯＝1/0
→
7/3)纯化，作为橙色固体获得2-氨基-3-硝基-4-(5-苄基噻吩-2-基)吡啶(9.20g)。
[0093]1h-nmr(cdcl3,400mhz)δ(ppm):4.16(s,2h),5.63(bs,2h),6.72(d,j＝5.0hz,1h),6.76-6.78(m,1h),6.97(d,j＝3.7hz)7.26-7.35(m,5h),8.12(d,j＝5.5hz,2h).
[0094]
＜工序4:2,3-二氨基-4-(5-苄基噻吩-2-基)吡啶的合成＞
[0095]
[化5]
[0096][0097]
将2-氨基-3-硝基-4-(5-苄基噻吩-2-基)吡啶(9.80g)溶解于四氢呋喃(100ml)。加入钯碳(ne-chemcat k型，湿重50％，1.3g)，进行氢气置换3次后，装上氢气球，在室温下搅拌24小时。
[0098]
确认原料消失，进行ar置换后，进行硅藻土过滤，将残渣用甲醇冲洗。将滤液在减压下浓缩，从而作为黑褐色油状物质获得2,3-二氨基-4-(5-苄基噻吩-2-基)吡啶(10.1g)。
[0099]1h-nmr(cdcl3,400mhz)δ(ppm):3.79(bs,2h),4.16(s,2h),4.42(bs,2h),6.68(d,j＝5.0hz,1h),6.81-6.83(m,1h),7.05(d,j＝3.7hz,1h),7.23-7.35(m,5h),7.57(d,j＝5.5hz,1h).
[0100]
＜工序5:7-(5-苄基噻吩-2-基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶的合成＞
[0101]
[化6]
[0102][0103]
将2,3-二氨基-4-(5-苄基噻吩-2-基)吡啶(10.1g)溶解于原甲酸三乙酯(157ml，945mmol)，缓缓加入35％盐酸(6.01ml，69.3mmol)，在室温下搅拌4小时。确认原料消失后，过滤反应液，将过滤物用乙酸乙酯清洗。将过滤物加入饱和碳酸氢钠水溶液和氯仿/甲醇＝9/1溶液的混合溶液中并使其溶解，分液。将水层用氯仿/甲醇＝9/1溶液进一步萃取1次。合并有机层后，用无水硫酸钠干燥，过滤，在减压下浓缩滤液。将浓缩残渣用乙腈悬浮清洗2次，从而作为淡褐色固体获得7-(5-苄基噻吩-2-基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶(6.12g)。
[0104]1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ(ppm):4.23(s,2h),7.04(d,j＝4.1hz,1h),7.23-7.26(m,1h),7.32-7.37(m,4h),7.45(d,j＝5.0hz,1h),8.09(d,j＝3.7hz,1h),8.27(d,j＝5.0hz,1h),8.43(s,1h).
[0105]
＜工序6:7-(5-苄基噻吩-2-基)-3-[3,5-二-o-(对甲苯酰基)-2-脱氧-1-β-d-呋喃核糖基]-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶的合成＞
[0106]
[化7]
[0107][0108]
在氩气气氛下，将7-(5-苄基噻吩-2-基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶(5.50g，18.9mmol)溶解于乙腈(88ml)，冰浴下，加入氢氧化钠(60wt％，0.75g，18.9mmol)，然后升温至室温，搅拌1小时30分钟。搅拌后，在冰浴下向反应液中加入2-脱氧-3,5-二-o-(对甲苯酰基)-α-d-赤藓戊呋喃糖基氯化物(6.12g，15.7mmol)，在室温下搅拌2小时30分钟。确认原料消失后，向反应液中加入饱和氯化铵水溶液和乙酸乙酯的混合溶液，搅拌后，分液。水层再用乙酸乙酯萃取1次，合并有机层后，用无水硫酸钠干燥，过滤，在减压下浓缩。将浓缩残渣用硅胶层析(中性硅胶，展开溶剂:庚烷/乙酸乙酯＝1/0
→
1/1)纯化，作为黄色非晶状固体获得7-(5-苄基噻吩-2-基)-3-[3,5-二-o-(对甲苯酰基)-2-脱氧-1-β-d-呋喃核糖基]-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶(4.61g)。
[0109]1h-nmr(cdcl3,400mhz)δ(ppm):2.38(s,3h),2.44(s,3h),2.85(ddd,j＝14.2hz,5.5hz,1.8hz,1h),3.16-3.19(m,1h),4.21(s,1h),4.64-4.77(m,3h),5.83(d,j＝5.9hz,1h),6.68(dd,j＝8.5hz,5.7hz,1h),6.89(d,j＝3.7hz,1h),7.19-7.34(m,9h),7.38(d,j＝5.0hz,1h),7.90(d,j＝8.2hz,2h),7.98-7.99(m,3h),8.25(s,1h),8.29(d,j＝5.0hz,1h).
[0110]
＜工序7:7-(5-苄基噻吩-2-基)-3-(2-脱氧-1-β-d-呋喃核糖基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶(化合物1)的合成＞
[0111]
[化8]
[0112][0113]
将7-(5-苄基噻吩-2-基)-3-[3,5-二-o-(对甲苯酰基)-2-脱氧-1-β-d-呋喃核糖基]-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶(4.61g，7.16mmol)添加至氨(7m甲醇溶液，410ml，2.86mol)中，在室温下搅拌48小时。确认原料消失，将反应液在减压下浓缩。将浓缩残渣用硅胶层析(展开溶剂:庚烷/乙酸乙酯＝1/1
→
0/1
→
氯仿/甲醇＝1/0
→
9/1)纯化，作为白色非晶状固体获得化合物1(2.74g)。
[0114]1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ(ppm):2.34(ddd,j＝13.2hz,6.0hz,3.0hz,1h),2.75-2.82(m,1h),3.52-3.57(m,1h),3.63-3.66(m,1h),3.91(dd,j＝7.3hz,4.6hz,1h),4.23(s,2h),4.44-4.46(m,1h),5.12(t,j＝5.7hz),5.34(d,j＝3.7hz),6.52(t,j＝7.3hz,1h),7.05(d,j＝3.7hz,1h),7.24-7.26(m,1h),7.32-7.37(m,4h),7.54(d,j＝5.5hz),8.12(d,j＝3.7hz),8.30(d,j＝5.0hz,1h),8.70(s,1h).
[0115]
上述实施例1中，合成了包含ds的噻吩的5位具有苄基的碱基的脱氧核苷(化合物1)，但可通过与化合物1的合成同样的方法，合成ds的噻吩的5位具有其他官能团的脱氧核苷。
[0116]
〔实施例2〕
[0117]
7-(5-苄基噻吩-2-基)-3-[2-脱氧-5-o-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-1-β-d-呋喃核糖基]-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶2-氰基乙基-n,n'-二异丙基亚磷酰胺(化合物2)的合成
[0118]
＜工序1:7-(5-苄基噻吩-2-基)-3-[2-脱氧-5-o-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-1-β-d-呋喃核糖基]-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶的合成＞
[0119]
[化9]
[0120][0121]
将实施例1中制造的化合物1(0.5g，1.23mmol)进行吡啶共沸3次后，溶解于吡啶(5ml)。冰冷下，加入dmtrcl(0.46g，1.35mmol)，在室温下搅拌一晚。冰冷下，加入甲醇(1ml)终止反应，在减压下馏去溶剂，将残渣用硅胶柱层析(含1％三乙胺的二氯甲烷和甲醇混合液，甲醇浓度0
→
3％)纯化，获得7-(5-苄基噻吩-2-基)-3-[2-脱氧-5-o-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-1-β-d-呋喃核糖基]-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶(0.64g)。
[0122]
质谱:esi(-)708.28
[0123]
＜工序2:7-(5-苄基噻吩-2-基)-3-[2-脱氧-5-o-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-1-β-d-呋喃核糖基]-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶2-氰基乙基-n,n'-二异丙基亚磷酰胺(化合物2)的合成＞
[0124]
[化10]
[0125][0126]
将7-(5-苄基噻吩-2-基)-3-[2-脱氧-5-o-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-1-β-d-呋喃核糖基]-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶进行乙腈共沸3次后，溶解于乙腈(10ml)。冰冷下，加入1h-四唑(82mg，1.02mmol)和2-氰基乙基-四异丙基亚磷酰胺(0.32ml，1.02mmol)，在室温下搅拌2小时后，用30ml乙酸乙酯稀释，用nahco3水溶液、食盐水清洗。将有机层用无水硫酸钠干燥后，过滤，在减压下馏去溶剂。将残渣用硅胶柱层析(含1％三乙胺的己烷和乙酸乙酯混合液，乙酸乙酯浓度5％
→
30％
→
50％)纯化，获得7-(5-苄基噻吩-2-基)-3-[2-脱氧-5-o-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-1-β-d-呋喃核糖基]-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶2-氰基乙基-n,n'-二异丙基亚磷酰胺(0.66g)。
[0127]
上述实施例2中，合成了包含ds的噻吩的5位具有苄基的碱基的脱氧核苷的3'-亚
磷酰胺，但可通过同样的方法，合成ds的噻吩的5位具有其他官能团的脱氧核苷的3'-亚磷酰胺。
[0128]
〔实施例3〕
[0129]
7-(5-苄基噻吩-2-基)-3-(2-脱氧-1-β-d-呋喃核糖基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶5'-三磷酸酯的合成
[0130]
[化11]
[0131][0132]
将实施例2的工序1中得到的7-(5-苄基噻吩-2-基)-3-[2-脱氧-5-o-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-1-β-d-呋喃核糖基]-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶(0.63g，0.89mmol)溶解于吡啶(9ml)。加入乙酸酐(0.17ml，1.78mmol)，在室温下搅拌一晚。在减压下馏去溶剂后，用乙酸乙酯稀释，用碳酸氢钠水溶液、食盐水清洗。有机层用无水硫酸钠干燥后，过滤，在减压下馏去溶剂。向残渣中加入甲苯共沸3次后，溶解于二氯甲烷(90ml)。冰冷下，加入二氯乙酸(0.9ml)，搅拌25分钟。在减压下馏去溶剂后，用二氯甲烷稀释，用碳酸氢钠水溶液、食盐水清洗。将有机层用无水硫酸钠干燥，过滤后，在减压下馏去溶剂。将残渣用硅胶柱层析(二氯甲烷-甲醇，乙酸乙酯甲醇浓度0％
→
3％)纯化，作为中间体获得7-(5-苄基噻吩-2-基)-3-[2-脱氧-5-o-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-1-β-d-呋喃核糖基]-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶的3'-o-乙酰基体。向该化合物(90mg，0.2mmol)中加入吡啶共沸3次，溶解于吡啶(0.2ml)和1,4-二噁烷(0.8ml)。加入1m的2-氯-4-h-1,3,2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮的1,4-二噁烷溶液(0.3ml)，在室温下搅拌15分钟。加入正丁胺(0.2ml)和0.5m的焦磷酸三丁基铵的dmf溶液(0.8ml)，在室温下搅拌15分钟后，加入4ml的1％碘/吡啶-水(49:1)，在室温下搅拌15分钟。加入5％亚硫酸氢钠(0.3ml)，在室温下搅拌2分钟后，在减压下浓缩至约1ml。向残渣中加入水(10ml)，在室温下搅拌30分钟后，加入28％氨水(40ml)，在室温下搅拌3.5小时，在减压下浓缩至约5ml。将残渣用deae柱层析(缓冲液a:50mm乙酸三乙基铵溶液，缓冲液b:2m乙酸三乙基铵溶液，线性梯度)粗纯化。再用反相hplc(缓冲液a:5％乙腈、50mm乙酸三乙基铵溶液，缓冲液b:乙腈，缓冲液b/20％
→
85％，13分钟)纯化。将所得的组分浓缩，与水共沸多次后，冷冻干燥。将残渣重新溶解于水，作为33.7mm水溶液(0.5ml)获得目标物7-(5-苄基噻吩-2-基)-3-(2-脱氧-1-β-d-呋喃核糖基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶5'-三磷酸酯。
[0133]
质谱:esi(-)646.21
[0134]
上述实施例3中，合成了包含ds的噻吩的5位具有苄基的碱基的脱氧核苷的5'-三磷酸。可通过同样的方法，合成ds的噻吩的5位具有其他官能团的脱氧核苷的5'-三磷酸。
[0135]
〔实施例4〕
[0136]
7-(5-环戊基甲基噻吩-2-基)-3-(2-脱氧-1-β-d-呋喃核糖基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶(化合物3)的合成
[0137]
＜工序1:2-溴-5-(环戊亚基甲基)噻吩的合成＞
[0138]
[化12]
[0139][0140]
在氩气气氛下，向溴环戊烷(78.0g，523mmol)中加入三苯膦(123.57g，471mmol)，加热至135～140℃，就这样搅拌4.5小时。冷却至40℃后，加入甲苯(100ml)过滤固体，用甲苯清洗过滤固体，减压干燥，获得溴化环戊基三苯基鏻(135.9g，82wt％，收率:57.5％)。
[0141]
在氩气气氛下，将2-溴-4-甲酰基噻吩(40.0g，209mmol)溶解于thf(1l)，加入溴化环戊基三苯基鏻(126g，251mmol)的thf(1l)溶液。将反应悬浮液加热至60℃，以15分钟的间隔添加25次nah(1.26g，26.2mmol，60wt％品)(合计添加量31.5g，655mmol)。所有的nah添加结束后搅拌15分钟，然后将反应悬浮液冷却至30℃，注入冰水(4l)中，用乙酸乙酯(2l)萃取2次，有机层用20％食盐水清洗后，减压浓缩。向浓缩残渣中加入庚烷(500ml)使其悬浮(超声波)，过滤悬浮物。将过滤物用庚烷清洗，将滤液减压浓缩。将浓缩残渣用柱层析(硅胶，1kg，庚烷)纯化，获得2-溴-5-(环戊亚基甲基)噻吩(34.2g，67.3％)。
[0142]1h-nmr(cdcl3,400mhz)δ(ppm):1.65-1.72(m,2h),1.80-1.87(m,2h),2.40-2.46(m,4h),6.47-6.48(m,1h),6.61(d,j＝3.7hz,1h),6.93(d,j＝4.1hz,1h)
[0143]
＜工序2:2-[5-(环戊亚基甲基)-2-噻吩基]-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷的合成＞
[0144]
[化13]
[0145][0146]
将2-溴-5-(环戊亚基甲基)噻吩(29.0g，119mmol)溶解于二噁烷(287ml)。加入联硼酸频那醇酯(60.6g，239mmol)、乙酸钾(35.1g，358mmol)，在氩气气氛下，再加入pd(dppf)cl2·
dcm(0.970g，1.19mmol)，将反应化合物加热至90℃，就这样搅拌2小时40分钟。追加pd(dppf)cl2·
dcm(0.1g，0.122mmol)，再进行加热搅拌1小时10分钟。然后，冷却反应混合物，注入水(500ml)-庚烷(300ml)-乙酸乙酯(300ml)的混合溶剂中，过滤不溶物。将有机层分液，水层用庚烷(200ml)-乙酸乙酯(200ml)再次萃取。将有机层用饱和食盐水(400ml)清洗，用硫酸钠干燥，进行减压浓缩，获得粗生成物(82.9g)。加入庚烷(300ml)，再次进行减压浓缩。向浓缩残渣中加入庚烷(80ml)使其悬浮，过滤悬浮物，过滤物用庚烷清洗。将滤液用柱层析(硅胶300g，庚烷溶出)纯化，获得2-[5-(环戊亚基甲基)-2-噻吩基]-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷(60.5g，100％，作为残渣含有联硼酸频那醇酯)。
[0147]1h-nmr(cdcl3,400mhz)δ(ppm):1.34(s,12h),1.65-1.72(m,2h),1.80-1.86(m,2h),2.46-2.55(m,4h),6.64(m,1h),6.94(d,j＝3.7hz,1h),7.53(d,j＝3.7hz,1h)
[0148]
＜工序3:4-[5-(环戊亚基甲基)-2-噻吩基]-3-硝基-吡啶-2-胺的合成＞
[0149]
[化14]
[0150][0151]
将2-氨基-4-氯-3-硝基吡啶(9.60g，55.3mmol)、2-[5-(环戊亚基甲基)-2-噻吩基]-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷(55.7g，192mmol)溶解于二噁烷(173ml)。加入水(17.3ml)、碳酸铯(36.0g，111mmol)，进行体系内的氩气置换。加入pd(pph3)4(3.20g，2.77mmol)，将体系内再次用氩气置换。将反应混合物加热至约90℃，就这样搅拌1小时。将反应混合物恢复至室温，注入水(500ml)-乙酸乙酯(500ml)中，硅藻土过滤不溶物。将有机层分液，水层用乙酸乙酯(500ml)再次萃取。将有机层用饱和食盐水(300ml)清洗(再次也进行不溶物过滤)，用硫酸钠干燥，进行减压浓缩，获得粗生成物(44.3g)。将粗生成物用柱层析(硅胶500g，乙酸乙酯:庚烷＝10:90
→
15:85
→
25:75
→
30:70)纯化，获得4-[5-(环戊亚基甲基)-2-噻吩基]-3-硝基-吡啶-2-胺(11.5g，含杂质)。将得到的4-[5-(环戊亚基甲基)-2-噻吩基]-3-硝基-吡啶-2-胺(含杂质)分成2份，分别再次用柱层析(硅胶200g，氯仿:乙酸乙酯＝100:0
→
90:10)进行纯化，获得4-[5-(环戊亚基甲基)-2-噻吩基]-3-硝基-吡啶-2-胺(5.07g，30.4％，与2-氨基-4-氯-3-硝基吡啶的混合物)。
[0152]
＜工序4:4-[5-(环戊亚基甲基)-噻吩基]吡啶-2,3-二胺的合成＞
[0153]
[化15]
[0154][0155]
将4-[5-(环戊亚基甲基)-2-噻吩基]-3-硝基-吡啶-2-胺(4.3g，14.27mmol)溶解于thf(43ml)，在氩气气氛下加入10％-pd/c(50％湿重，0.56g，2.63mmol)，再将体系内用氢气置换(24
→
22℃)，在氢气气氛下于室温搅拌20小时(氢气球，内温25～26℃)。将体系内用氩气置换后，反应混合物进行硅藻土过滤，用thf清洗。将滤液减压浓缩，获得粗生成物(4.83g)。将粗生成物用柱层析(nh硅胶100g，chcl3:庚烷＝50:50
→
85:15)纯化，将含杂质的部分再次用柱层析(nh硅胶600g，chcl3:庚烷＝30:0
→
65:35)纯化，从而获得4-[5-(环戊亚基甲基)-噻吩基]吡啶-2,3-二胺(1.81g，46.8％)。
[0156]1h-nmr(cdcl3,400mhz)δ(ppm):1.68-1.75(m,2h),1.82-1.89(m,2h),2.48-2.55(m,4h),3.77(bs,2h),4.25(bs,2h),6.59(t,j＝2.3hz,1h),6.77(d,j＝5.5hz,1h),6.91(d,j＝3.7hz,1h),7.15(d,j＝3.7hz,1h),7.65(d,j＝5.0hz,1h)
[0157]
＜工序5:4-[5-(环戊基甲基)-噻吩基]吡啶-2,3-二胺的合成＞
[0158]
[化16]
[0159][0160]
在高压釜反应装置中将4-[5-(环戊亚基甲基)-噻吩基]吡啶-2,3-二胺(1.81g，6.67mmol)溶解于thf(20.1ml)，进行体系内的氩气置换。加入10％-pd/c(50％湿重，0.26g，1.228mmol)，对体系内用0.6mpa的氢气加压，在室温下搅拌6.5小时(下降至0.38mpa)。再次进行0.6mpa的氢气加压，在室温下搅拌64小时(下降至0.23mpa)。将体系内恢复至常压并进行氩气置换，进行反应混合物的硅藻土过滤。将硅藻土用thf清洗，将滤液减压浓缩。加入甲醇、甲苯，再次减压浓缩，获得4-[5-(环戊基甲基)-噻吩基]吡啶-2,3-二胺(1.82g，100％)。
[0161]
＜工序6:7-(5-环戊基甲基噻吩-2-基)-3-(2-脱氧-1-β-d-呋喃核糖基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶(化合物3)的合成＞
[0162]
[化17]
[0163][0164]
以4-[5-(环戊基甲基)-噻吩基]吡啶-2,3-二胺(1.8g)为原料，通过与实施例1的工序4～7同样的方法获得555mg 7-(5-环戊基甲基噻吩-2-基)-3-(2-脱氧-1-β-d-呋喃核糖基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶(化合物3)。
[0165]1h-nmr(cdcl3,400mhz)δ(ppm):1.22-1.31(m,2h),1.52-1.60(m,2h),1.62-1.70(m,2h),1.77-1.87(m,2h),2.15-2.26(m,2h),2.31(dd,j＝5.7,13.5hz,1h),2.88(d,j＝7.3hz,2h),3.20-3.27(m,1h),3.81(t,j＝12.3hz,1h),4.00(d,j＝12.8,1h),4.26(s,1h),4.83(d,j＝4.1hz,1h),6.43(dd,j＝5.5,9.6hz,1h),6.80(d,j＝11.4hz,1h),6.89(d,j＝3.7hz,1h),7.44(d,j＝5.5hz,1h),8.00(d,j＝3.7hz,1h),8.12(s,1h),8.25(d,j＝5.5hz,1h)
[0166]
〔实施例5〕
[0167]
化合物3的亚磷酰胺体的合成
[0168]
[化18]
[0169][0170]
以实施例4中得到的7-(5-环戊基甲基噻吩-2-基)-3-(2-脱氧-1-β-d-呋喃核糖基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶(化合物3)为原料，通过与实施例2同样的方法进行制造，获得7-(5-环戊基甲基噻吩-2-基)-3-[2-脱氧-5-o-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-1-β-d-呋喃核糖基]-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶2-氰基乙基-n,n'-二异丙基亚磷酰胺(0.66g)。
[0171]
〔实施例6〕
[0172]
化合物3的三磷酸酯体的合成
[0173]
[化19]
[0174][0175]
使用实施例5中得到的作为中间体的7-(5-环戊基甲基噻吩-2-基)-3-[2-脱氧-5-o-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-1-β-d-呋喃核糖基]-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶作为原料，通过与实施例3同样的方法制造，获得7-(5-环戊基甲基噻吩-2-基)-3-[2-脱氧-5-o-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-1-β-d-呋喃核糖基]-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶5'-三磷酸酯。
[0176]
质谱:esi(-)638.10
[0177]
〔实施例7〕
[0178]
7-(2-萘基甲基噻吩-2-基)-3-(2-脱氧-1-β-d-呋喃核糖基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶(化合物4)的合成
[0179]
＜工序1:2-溴-5-(2-萘基甲基)噻吩的合成＞
[0180]
[化20]
[0181][0182]
在氩气气氛下，在1l四口烧瓶中将2-溴噻吩(7.35g，45.1mmol)溶于四氢呋喃(103ml)，加入四甲基乙二胺(8.16ml，54.1mmol，1.2eq)后，用干冰/丙酮浴冷却(内温-60℃
以下)。接着，用20分钟滴加二异丙基氨基锂(1.08m，正己烷/四氢呋喃溶液，50.0ml，54.1mmol，1.2eq.)，在该温度下搅拌30分钟。滴加2-溴甲基萘(12.0g，54.1mmol，1.2eq.)的四氢呋喃(20ml)溶液后，从干冰/丙酮浴提起，使其升温至室温后，搅拌19小时。
[0183]
确认原料消失后，加入饱和氯化铵水溶液(100ml)和乙酸乙酯(100ml)分液，将水层用乙酸乙酯(100ml)再次萃取。合并有机层，用饱和食盐水(100ml)清洗后，用无水硫酸钠干燥，过滤。将滤液在减压下浓缩，从而获得褐色固体(21.0g)。用硅胶柱层析(富士硅化学株式会社(fuji silysia chemical ltd.)，si50，尺寸200
×
4；正庚烷)纯化，将目标物的组分在减压下浓缩，作为白色固体获得2-溴-5-(2-萘基甲基)噻吩(4.27g，收率31％)。
[0184]1h-nmr(cdcl3,400mhz)δ(ppm):4.23(s,2h),6.59-6.61(m,1h),6.88(d,j＝3.6hz,1h),7.35(dd,j＝1.8,8.2hz,1h),7.43-7.49(m,2h),7.67(s,1h),7.78-7.83(m,3h)
[0185]
＜工序2:4,4,5,5-四甲基-2-[5-(2-萘基甲基)-2-噻吩基]-1,3,2-二氧杂硼烷的合成＞
[0186]
[化21]
[0187][0188]
在氩气气氛下，于100ml四口烧瓶中将2-溴-5-(2-萘基甲基)噻吩(4.27g，14.1mmol)、联硼酸频那醇酯(3.75g，14.8mmol，1.05eq.)溶解于二噁烷(35.3ml)。加入乙酸钾(4.15g，42.2mmol，3.0eq.)后，将烧瓶内置于氩气气氛下，加入pdcl2(dppf)(860mg，1.06mmol，0.075eq.)后，在内温90℃搅拌24小时。确认原料消失后，将反应液冷却至室温，硅藻土过滤。向滤液中加入水(50ml)和乙酸乙酯(100ml)，分液。将有机层用饱和食盐水(200ml)清洗后，用无水硫酸钠干燥，过滤。将滤液在减压下浓缩，残渣用硅胶柱层析(展开溶剂正庚烷:乙酸乙酯＝100:0
→
90:10)纯化，将目标物的组分在减压下浓缩，从而获得4,4,5,5-四甲基-2-[5-(2-萘基甲基)-2-噻吩基]-1,3,2-二氧杂硼烷(2.61g，收率53％)。
[0189]1h-nmr(cdcl3,400mhz)δ(ppm):1.31(s,12h),4.34(s,2h),6.92-6.93(m,1h),7.37(dd,j＝1.8,8.6hz,1h),7.42-7.49(m,3h),7.69(s,1h),7.76-7.81(m,3h)
[0190]
＜工序3:[(2r)-5-(7-氯咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基)-3-(4-甲基苯甲酰)氧基-四氢呋喃-2-基]甲基4-甲基苯甲酸酯的合成＞
[0191]
[化22]
[0192][0193]
在氩气气氛下，向1l四口烧瓶中于冰冷下加入7-氯-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶(2.00g，13.2mmol)、nah(60％，630mg，15.6mmol，1.20eq.)、乙腈(429ml)，搅拌。加入[(2r,5r)-5-氯-3-(4-甲基苯甲酰)氧基-四氢呋喃-2-基]甲基4-甲基苯甲酸酯(6.85g，17.6mmol，1.35eq.)后，在室温下搅拌1小时(无色透明溶液)。确认原料消失后，向反应液中加入饱和氯化铵水溶液(100ml)和乙酸乙酯(100ml)，分液。然后，用乙酸乙酯(100ml)萃取2次。将有机层用饱和食盐水(200ml)清洗后，用无水硫酸钠干燥，过滤。将滤液在减压下浓缩，从而获得黄色固体(10.0g)。用硅胶柱层析(展开溶剂正庚烷:乙酸乙酯＝100:0
→
50:50)纯化，将目标物的组分在减压下浓缩，将所得的残渣再次用硅胶柱层析(展开溶剂氯仿:甲醇＝100:0
→
20:1)纯化，将目标物的组分在减压下浓缩，从而作为白色固体获得[(2r)-5-(7-氯咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基)-3-(4-甲基苯甲酰)氧基-四氢呋喃-2-基]甲基4-甲基苯甲酸酯(3.31g，收率50％)。
[0194]1h-nmr(cdcl3,400mhz)δ(ppm):2.41(s,3h),2.45(s,3h),2.85(ddd,j＝2.2,5.6,14.1hz,1h),3.08-3.19(m,1h),4.63-4.92(m,3h),5.83(dt,j＝1.8,6.0hz,1h),6.65(dd,j＝5.8,8.0hz,1h),7.18-7.30(m,5h),7.90(d,j＝8.0hz,2h),7.98(d,j＝8.0hz,2h),8.26-8.27(m,2h)
[0195]
＜工序4:[(2r)-3-(4-甲基苯甲酰)氧基-5-[7-[5-(2-萘基甲基)-2-噻吩基]咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基]四氢呋喃-2-基]甲基4-甲基苯甲酸酯的合成＞
[0196]
[化23]
[0197][0198]
在氩气气氛下，于200ml四口烧瓶中将4,4,5,5-四甲基-2-[5-(2-萘基甲基)-2-噻吩基]-1,3,2-二氧杂硼烷(830mg，1.58mmol)、[(2r)-5-(7-氯咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基)-3-(4-甲基苯甲酰)氧基-四氢呋喃-2-基]甲基4-甲基苯甲酸酯(831mg，2.37mmol，1.5eq.)溶解于二噁烷(8.00ml)，搅拌。加入碳酸铯(2.50g，3.16mmol，3eq.)/水(4.00ml)的水溶液
后，将反应容器内氩气置换，加入xphos pd g2(0.05g，0.0320mmol，0.05eq.)后，在90℃搅拌1小时。确认原料消失后，向反应液中加入水(40ml)和乙酸乙酯(40ml)，分液。然后，用乙酸乙酯(40ml)萃取2次。将有机层用饱和食盐水(200ml)清洗后，用无水硫酸钠干燥，过滤。将滤液在减压下浓缩，从而获得黄色固体(2.01g)。用硅胶柱层析(展开溶剂正庚烷:乙酸乙酯＝85:15
→
70:30)纯化，将目标物的组分在减压下浓缩，从而作为白色固体获得[(2r)-3-(4-甲基苯甲酰)氧基-5-[7-[5-(2-萘基甲基)-2-噻吩基]咪唑并[4,5b]吡啶-3-基]四氢呋喃-2-基]甲基4-甲基苯甲酸酯(789mg，收率76％)。
[0199]1h-nmr(cdcl3,400mhz)δ(ppm):2.38(s,3h),2.44(s,3h),2.85(ddd,j＝2.2,5.6,14.1hz,1h),3.14-3.21(m,1h),4.38(s,2h),4.66-4.76(m,3h),5.83(dt,j＝1.8,6.0hz,1h),6.68(dd,j＝5.8,8.2hz,1h),6.94(d,j＝4.0hz,1h),7.20(d,j＝8.4hz,2h),7.28(d,j＝8.4hz,2h),7.38-7.49(m,4h),7.74-7.83(m,4h),7.91(d,j＝8.4hz,2h),7.98(d,j＝8.0hz,2h),8.01(d,j＝4.0hz,1h),8.25(s,1h),8.29(d,j＝5.2hz,1h)
[0200]
＜工序5:7-(2-萘基甲基噻吩-2-基)-3-(2-脱氧-1-β-d-呋喃核糖基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶(化合物4)的合成＞
[0201]
[化24]
[0202][0203]
同与实施例1工序7同样的方法，由工序4中制造的[(2r)-3-(4-甲基苯甲酰)氧基-5-[7-[5-(2-萘基甲基)-2-噻吩基]咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基]四氢呋喃-2-基]甲基4-甲基苯甲酸酯(0.959g)获得7-(2-萘基甲基噻吩-2-基)-3-(2-脱氧-1-β-d-呋喃核糖基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶(化合物4)(620mg，99％)。
[0204]1h-nmr(cdcl3,400mhz)δ(ppm):1.89(s,1h),2.31(dd,j＝5.2,14.1hz,1h),3.20-3.27(m,1h),3.78-3.84(m,1h),3.98-4.01(m,1h),4.25(s,1h),4.38(s,2h),4.83(t,j＝4.0hz,1h),6.42(dd,j＝5.6,10.0hz,1h),6.69-6.72(m,1h),6.94-6.96(m,1h),7.40-7.49(m,4h),7.75(s,1h),7.79-7.83(m,3h),8.03(d,j＝3.6hz,1h),8.10(s,1h),8.24(d,j＝5.2hz,1h)
[0205]
〔实施例8〕
[0206]
使用具有人工碱基的核苷的3'-亚酰胺的dna合成
[0207]
以化合物2为一例的本实施方式的具有人工碱基的核苷3'-亚酰胺在一般采用的固相合成法中，可在与天然碱基的核苷3'-亚酰胺同等的条件下用于寡聚核酸的合成。将化合物2适用于固相合成法，将所得的dna链用聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化。对经纯化的dna链的质量用ms质谱进行了分析，结果分子量为31850.2(理论值:31852.9)，确认获得了作为目标的含dsbn的dna。
[0208]
〔实施例9〕
[0209]
具有人工碱基的核苷5'-三磷酸在pcr中的应用
[0210]
为了确认在碱基部分具有作为人工碱基的7-(5-苄基-2-噻吩基)-3h-咪唑并[4,5-b]-吡啶-3-基的核苷(以下称为ddsbn)通过dna聚合酶被整合入dna链，且扩增，对通过pcr得到的dna片段用lc/ms进行了分析。
[0211]
将实施例8中制备的含ddsbn的单链dna用作以下的pcr的模板。
[0212]
pcr用accuprime pfx dna聚合酶(赛默飞世尔科技公司制)进行。pcr用溶液的组成是1
×
accuprime pfx reaction mix(包含dntp 0.3mm、1.0mm mgso4)、0.5mm mgso4、0.1mm dntp、0.5μm正向引物(序列参照下文)、0.5μm反向引物(序列参照下文)、0.05mm ddsbntp、0.05mm diol1-dpxtp(1-(2-脱氧-β-d-呋喃核糖基)-4-[(4-戊炔-1,2-二醇)-1-丙炔基]-2-硝基吡咯-5
’‑
三磷酸酯)、0.05单位/μl accuprime pfx dna聚合酶。向该组成的反应液中添加4.8
×
109分子单链dna(t-00198，序列参照下文)，以94℃、2分钟-(94℃、15秒-65℃、210秒)
×
20循环制备pcr产物。所得的pcr产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化，分离相当于模板dna的单链dna片段。使用分离纯化的单链dna，以上述的pcr条件反复进行dna片段的扩增和纯化，制成进行了总计100次循环的单链dna。
[0213]
[表1]
[0214][0215]
对于按照上述工序以总计20、40、60循环制成的单链dna中的ddsbn的整合，使用lc/ms系统(沃特世公司制，acquity sqd)进行了评价。分析使用c18反相柱(acquity uplc beh c
18
1.7μm，2.1
×
50mm)，溶液使用流动相(100mm 1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇，8mm三乙胺)、流动相b(乙腈)。使流动相以0.2ml/分钟流动，让流动相b在10分钟内形成自10％至50％的梯度进行分析。此时的柱温为60℃，以260nm的波长(acquity uplc pda)检测。反卷积(deconvolution)使用promass进行了分析。
[0216]
首先，作为lc/ms分析的对照，实施了以化学合成进行合成的在pcr中用作模板dna的单链dna的分析。其结果是，单链dna的保留时间为4.42秒，实测值的分子量为31850.2，与理论值(31852.9)的质量误差(mass error)为-2.7da(-0.008％)(表2)。接着，对于pcr产物以同样的条件用lc/ms进行了分析。20循环pcr产物的主要成分的保留时间为4.45秒，实测值的分子量为31861.8。40循环pcr产物的主要成分的保留时间为4.46秒，实测值的分子量为31859.7。60循环pcr产物的主要成分的保留时间为4.44秒，实测值的分子量为31836.2。
数据示于表1。由20、40、60循环得到的各自的dna产物所含的主要成分的保留时间与对照基本一致，实测值的分子量与理论值的分子量的误差在0.05％以内。由此可知，本实施方式的ddsbn被dna聚合酶识别，通过pcr被整合入复制的dna片段。
[0217]
[表2]
[0218][0219]
〔实施例10〕
[0220]
使用包含具有人工碱基的核苷的单链dna文库的筛选
[0221]
＜针对vegf165的dna适体的获得＞
[0222]
筛选中使用的含ddsbn的单链dna文库通过化学合成法进行合成，将所得的dna用聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化。
[0223]
将在随机区域中含ddsbn的单链dna文库溶解于pbs溶液，为了使其形成三级结构而实施了折叠操作(95℃、5分钟
→
室温、20分钟
→
冰上、5分钟)。然后，加入含np-40的pbs溶液，制成溶液组成含0.005％np-40的pbs溶液(结合溶液)。然后，加入目标蛋白质vegf
165
，在室温下反转混合30分钟。为了使目标蛋白质附加生物素标签，加入ez-link sulfo-nhs-lc-生物素(赛默飞世尔科技公司制)室温下反应15分钟，添加甘氨酸以终止反应。然后，为了除去未反应的试剂而用amicon ultra filter cup-0.5 50k(默克公司制)实施了溶液置换。
[0224]
从进行了溶液置换的试样，使用链霉亲和素磁珠(新英格兰生物实验室公司制)回收生物素化的目标蛋白质，从而取出结合了的单链dna池。直接用结合溶液清洗磁珠，从而除去结合亲和性低的单链dna。从磁珠回收即使清洗也与目标蛋白质结合的单链dna池。
[0225]
为了扩增回收的单链dna池，用accuprime pfx dna聚合酶实施了pcr。pcr反应液的组成是1
×
accuprime pfx reaction mix(包含dntp 0.3mm、1.0mm mgso4)、0.5mm mgso4、0.1mm dntp、0.5μm选择用正向引物(序列参照下文)、0.5μm选择用反向引物(序列参照下文)、0.05mm ddsbntp、0.05mm diol1-dpxtp、0.05单位/μl accuprime pfx dna聚合酶。pcr循环条件为94℃、2分钟-(94℃、15秒-65℃、210秒)
×
n循环。循环数的n在各轮中不同，实施扩增至可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化的量所需的次数。
[0226]
自扩增的dna片段的单链dna池的纯化用含7m尿素的10％聚丙烯酰胺凝胶电泳实施，从含dna片段的凝胶片提取dna片段，为了脱盐而进行乙醇沉淀，纯化与目标蛋白质结合的单链dna池。
[0227]
对于该操作，改变单链dna池与目标蛋白质的浓度或清洗工序的条件反复实施，从而促进与目标蛋白质结合的序列的富集。第2轮以后，为了排除与链霉亲和素磁珠非特异性
结合的单链dna池，向折叠操作后的池中加入磁珠，在室温下颠倒混合30分钟，向除去了磁珠的池溶液加入目标蛋白质进行反应。
[0228]
[表3]
[0229][0230]
＜通过筛选而得的dna池的对目标蛋白质的亲和性评价＞
[0231]
通过使用与目标蛋白质结合的单链dna的富集的池，实施与目标蛋白质的emsa(电泳迁移率位移测定，electrophoretic mobility shift assay)，确认了是否包含结合的序列。
[0232]
以单链dna池在结合溶液中达到0.2μm的条件制备，进行折叠操作(95℃、5分钟
→
(-0.1℃/秒)
→
25℃)，使其形成三级结构。将目标蛋白质用结合溶液稀释至规定的浓度，与经折叠的dna溶液混合，在37℃保温30分钟。将保温后的试样用10％未改性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。电泳后的凝胶用sybr gold染色，检测dna(图1)。其结果是，最终轮的池中，随着vegf165的浓度升高，明确的位移条带强度增加，游离的dna条带变淡，由此确认存在与目标蛋白质结合的序列。
[0233]
＜候选序列的鉴定＞
[0234]
使用新一代测序仪(ion pgm系统，赛默飞世尔科技公司制)，对筛选得到的dna池所含的序列进行了分析。选择用正向引物与选择用反向引物间的插入碱基长度没有变化，进一步对残存人工碱基ddsbn的序列组进行了聚类，结果单一序列占约80％左右。
[0235]
＜用emsa评价候选序列对目标蛋白质的结合亲和性＞
[0236]
通过emsa对经鉴定的候选序列是否与目标蛋白质结合进行了分析。
[0237]
首先，通过化学合成法合成与候选序列相应的低聚物，用opc(纯化柱)进行纯化。
[0238]
以经纯化的候选序列的低聚物(t-00199，序列参照下文)在结合溶液中达到0.2μm的条件制备，进行折叠操作(95℃、5分钟
→
(-0.1℃/秒)
→
25℃)，使其形成三级结构。然后，将vegf165用结合溶液稀释至0.2μm，与经折叠的dna溶液混合，在37℃保温30分钟。将保温后的试样用10％未改性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，对能否检出dna-蛋白质复合物的条带进行了分析。dna用sybr gold染色，以470nm的蓝光检测。其结果是，vegf165存在下，检出新的条带(图2左侧的2条泳道)，由此可知，通过本筛选鉴定的序列为与vegf165结合的适体。
[0239]
接着，为了确认新型人工碱基ddsbn是否参与和vegf165的结合，使用将ddsbn置换为dds和da的低聚物(dds置换体:t-00200，da置换体:t-00201，序列参照下文)进行了评价。低聚物通过化学合成法合成，用opc(纯化柱)实施纯化。emsa如上所述进行折叠操作和反应，进行了采用未改性聚丙烯酰胺的分析(图2的dds:中央的2条泳道，da:右侧的2条泳道)。其结果是，通过将ddsbn置换为dds和da，来源于与蛋白质的复合物的位移条带消失了。由此可证明，本实验中鉴定的含ddsbn的dna适体与目标蛋白质结合时，ddsbn对于与vegf165的结合发挥重要作用。
[0240]
[表4]
[0241][0242]
＜针对sil-6r的dna适体的获得＞
[0243]
使用与上述的vegf165同样的含dsbn的dna文库，筛选方法也按同样的步骤进行，进行了与sil-6r结合的dna序列的富集。
[0244]
＜通过筛选而得的dna池的对目标蛋白质的亲和性评价＞
[0245]
通过emsa对于进行筛选而得的dna池中是否包含与sil-6r结合的dna序列进行了评价。
[0246]
为了使其形成立体结构而实施折叠操作，将目标蛋白质sil-6r用结合溶液稀释至规定的浓度。结合反应在室温下保温30分钟，用8％未改性聚丙烯酰胺凝胶进行了分析(图3)。其结果是，最终轮的dna池中，随着sil-6r的浓度升高，位移条带变浓，由此可知，该dna池中富集有与sil-6r结合的dna序列。
[0247]
＜候选序列的鉴定＞
[0248]
使用新一代测序仪(ion pgm系统)，对筛选得到的dna池所含的序列进行了分析。选择用正向引物与选择用反向引物间的插入碱基长度没有变化，进一步对残存人工碱基ddsbn的序列组进行了聚类，结果存在最多的单一序列为约8％左右。
[0249]
＜用emsa评价候选序列对目标蛋白质的结合亲和性＞
[0250]
通过emsa对富集最多的候选序列是否与目标蛋白质结合进行了分析。
[0251]
首先，通过化学合成法合成与候选序列相应的低聚物(t-00202，序列参照下文)，用opc(纯化柱)进行纯化。
[0252]
以经纯化的候选序列的低聚物在结合溶液中达到0.2μm的条件制备，进行折叠操作(95℃、5分钟
→
(-0.1℃/秒)
→
25℃)，使其形成三级结构。然后，将sil-6r用结合溶液稀释至0.2μm，与经折叠的dna溶液混合，在室温下保温30分钟。将保温后的试样用8％未改性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，对能否检出dna-蛋白质复合物的条带进行了分析。dna用sybr gold染色，以470nm的蓝光检测(图4左侧的2条泳道)。其结果是，sil-6r存在下，检出新的条带，由此可知，通过本筛选鉴定的序列为与sil-6r的适体。
[0253]
接着，为了确认新型人工碱基ddsbn是否参与和sil-6r的结合，使用将ddsbn置换为dds和da的低聚物(dds置换体:t-00203，da置换体:t-00204，序列参照下文)进行了评价。低聚物通过化学合成合成，用opc(纯化柱)实施纯化。emsa如上所述进行折叠操作、反应、采用未改性聚丙烯酰胺的分析(图4)。其结果是，通过将ddsbn置换为dds和da，来源于与蛋白质的复合物的位移条带消失了。由此可证明，本实验中鉴定的含ddsbn的dna适体与目标蛋白质结合时，ddsbn对于与sil-6r的结合发挥重要作用。
[0254]
[表5]
[0255][0256]
〔实施例11〕
[0257]
使用具有人工碱基的核苷的3'-亚酰胺的dna合成
[0258]
以化合物3为一例的本实施方式的具有人工碱基的核苷3'-亚酰胺在一般采用的固相合成法中，可在与天然碱基的核苷3'-亚酰胺同等的条件下用于寡聚核酸的合成。将化合物3应用于固相合成法，将所得的dna链(t-00243，序列参照下文)用聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化。使用新一代测序仪(ion pgm系统)，对合成的dna链是否包含ddscp进行了分析。
[0259]
[表6]
[0260][0261]
〔实施例12〕
[0262]
具有人工碱基的核苷5'-三磷酸在pcr中的应用
[0263]
为了确认在碱基部分具有作为人工碱基的7-(5-环戊基甲基噻吩-2-基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基(dscp)的核苷(以下称为ddscp)通过dna聚合酶被整合入dna链，且扩增，对通过pcr得到的dna片段用新一代测序仪进行了分析。
[0264]
将实施例11中制备的含ddscp的单链dna(t-00243)用作以下的pcr反应的模板dna。
[0265]
pcr用accuprime pfx dna聚合酶进行。pcr用溶液的组成是1
×
accuprime pfx reaction mix(包含dntp 0.3mm、1.0mm mgso4)、0.5mm mgso4、0.1mm dntp、0.5μm正向引物、0.5μm反向引物、0.05mm ddscptp、0.05mm diol1-dpxtp、0.05单位/μl accuprime pfx dna聚合酶。向该组成的反应液中添加4.8
×
109分子单链dna(t-00243)，以94℃、2分钟-(94℃、15秒-65℃、210秒)
×
20循环制备pcr产物。所得的pcr产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化，分离相当于模板dna的单链dna片段。使用分离纯化的单链dna，以上述的pcr条件反复进行dna片段的扩增和纯化，制成进行了总计60循环的单链dna。
[0266]
使用新一代测序仪(ion pgm系统)，对按照上述工序以总计60循环制备的单链dna中是否整合有ddscp进行了分析。其结果是，可确认总计60循环的pcr产物在规定的位置存在ddscp。由此可知，ddscp被dna聚合酶识别，被整合入复制的dna片段。
[0267]
〔实施例13〕
[0268]
使用包含具有人工碱基ddscp的核苷的单链dna文库的筛选
[0269]
＜针对vegf165的dna适体的获得＞
[0270]
筛选中使用的含ddscp的单链dna文库通过化学合成法进行合成，将所得的dna用聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化。该单链dna文库与实施例10中使用的引物的组合不同，使用选择用正向引物2、反向引物2(序列参照下文)。
[0271]
使用在随机区域含ddscp的单链dna文库，按照与实施例6所示的筛选方法同样的
步骤实施了针对vegf165的结合序列的富集工序。
[0272]
[表7]
[0273][0274]
＜通过筛选而得的dna池的对目标蛋白质的亲和性评价＞
[0275]
通过emsa对于筛选工序中得到的dna池中是否包含与vegf165结合的dna序列进行了评价。为了使其形成立体结构而实施折叠操作，vegf165用结合溶液稀释至规定的浓度。分别混合，在37℃保温30分钟，用8％未改性聚丙烯酰胺凝胶进行了分析(图5)。其结果是，最终轮的dna池中，检出与vegf165结合的明确的位移条带，由此可知，通过筛选得到的dna池中富集有与vegf165结合的dna序列。
[0276]
＜候选序列的鉴定＞
[0277]
使用新一代测序仪(ion pgm系统)，对筛选得到的dna池所含的序列进行了分析。选择用正向引物2与选择用反向引物2间的插入碱基长度没有变化，进一步对残存人工碱基ddscp的序列组进行了聚类，结果存在最多的单一序列为约30％左右。
[0278]
＜用emsa评价候选序列对目标蛋白质的结合亲和性＞
[0279]
通过emsa对富集最多的候选序列是否与目标蛋白质结合进行了分析。首先，通过化学合成法合成与候选序列相应的低聚物(t-00244，序列参照下文)，用opc(纯化柱)进行纯化。以经纯化的候选序列的低聚物在结合溶液中达到0.2μm的条件制备，进行折叠操作(95℃、5分钟
→
(-0.1℃/秒)
→
25℃)，使其形成三级结构。然后，将vegf165用结合溶液稀释至0.2μm，与经折叠的dna溶液混合，在37℃保温30分钟。将保温后的试样用8％未改性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，对能否检出dna-蛋白质复合物的条带进行了分析。dna用sybr gold染色，以470nm的蓝光检测。其结果是，在vegf165存在下，检出新的条带(图6左侧的2条泳道)，由此可知，通过本筛选鉴定的序列为与vegf165结合的适体。
[0280]
接着，为了确认新型人工碱基ddscp是否参与和vegf165的结合，使用将ddscp置换为dds和da的低聚物(dds置换体:t-00245，da置换体:t-00246，序列参照下文)进行了评价。低聚物通过化学合成来合成，用opc(纯化柱)实施纯化。emsa如上所述进行折叠操作、反应、采用未改性聚丙烯酰胺的分析(图6)。其结果是，通过将ddscp置换为dds和da，来源于与蛋白质的复合物的位移条带消失了。由此可证明，本实验中鉴定的dna适体与vegf165结合时，ddscp发挥重要作用。
[0281]
[表8]
[0282]
[0283]
＜针对sil-6r的dna适体的获得＞
[0284]
使用在随机区域含ddscp的单链dna文库，按照与实施例10所示的筛选方法同样的步骤实施了针对sil-6r的结合序列的富集工序。
[0285]
＜通过筛选而得的dna池的对目标蛋白质的亲和性评价＞
[0286]
通过emsa对于筛选工序中得到的dna池中是否包含与sil-6r结合的dna序列进行了评价。为了使其形成立体结构而实施折叠操作，sil-6r用结合溶液稀释至规定的浓度。分别混合，在室温下保温30分钟，用8％未改性聚丙烯酰胺凝胶进行了分析(图7)。其结果是，最终轮的dna池中，随着sil-6r的浓度升高，检出了结合了的明确的位移条带，由此可知，通过筛选得到的dna池中富集有与sil-6r结合的dna序列。
[0287]
＜候选序列的鉴定＞
[0288]
使用新一代测序仪(ion pgm系统)，对筛选得到的dna池所含的序列进行了分析。选择用正向引物2与选择用反向引物2间的插入碱基长度没有变化，进一步对残存人工碱基ddscp的序列组进行了聚类，结果鉴定了存在比例高达约22％的单一序列。
[0289]
＜用emsa评价候选序列对目标蛋白质的结合亲和性＞
[0290]
通过emsa对富集最多的候选序列是否与目标蛋白质结合进行了分析。首先，通过化学合成法合成与候选序列相应的低聚物(t-00247，序列参照下文)，用opc(纯化柱)进行纯化。以经纯化的候选序列的低聚物在结合溶液中达到0.2μm的条件制备，进行折叠操作(95℃、5分钟
→
(-0.1℃/秒)
→
25℃)，使其形成三级结构。然后，将sil-6r用结合溶液稀释至0.6μm，与经折叠的dna溶液混合，在室温下保温30分钟。将保温后的试样用8％未改性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，对能否检出dna-蛋白质复合物的条带进行了分析。dna用sybr gold染色，以470nm的蓝光检测。其结果是，sil-6r存在下，检出新的条带(图8左侧的2条泳道)，由此可知，通过本筛选鉴定的序列为与sil-6r结合的适体。
[0291]
接着，为了确认新型人工碱基ddscp是否参与和sil-6r的结合，使用将ddscp置换为dds和da的低聚物(dds置换体:t-00248，da置换体:t-00249，序列参照下文)进行了评价。低聚物通过化学合成来合成，用opc(纯化柱)实施纯化。emsa如上所述进行折叠操作、反应、采用未改性聚丙烯酰胺的分析(图8)。其结果是，通过将ddscp置换为dds和da，来源于与蛋白质的复合物的位移条带消失了。由此可证明，本实验中鉴定的含ddscp的dna适体与sil-6r结合时，ddscp发挥重要作用。
[0292]
[表9]
[0293][0294]
本发明并不局限于上述的形态和实施例，包括本技术的权利要求所规定的本发明的范围内可包含的替换形态、变更形态。

技术特征：
1.一种具有下述式i的结构作为碱基的脱氧核糖核苷或脱氧核糖核苷酸；[化1]式i中，r1为取代c
1-c3烷基、取代或无取代c
4-c9烷基、取代或无取代芳基、取代或无取代环烷基、取代或无取代芳烷基、取代或无取代杂芳基。2.根据权利要求1所述的脱氧核糖核苷或脱氧核糖核苷酸，其中，r1为苯基、4-吡啶基、萘基、异丙基、环戊基。3.根据权利要求1或2所述的脱氧核糖核苷酸，其中，5'-羟基具有三磷酸。4.根据权利要求1或2所述的脱氧核糖核苷，其中，5'-羟基具有保护基、3'-羟基具有亚磷酰胺基或h-膦酸酯基。5.一种寡聚核酸合成用试剂，其中，包含权利要求1～4中的任一项所述的脱氧核糖核苷或脱氧核糖核苷酸。6.一种医药品，其中，包含权利要求1～4中的任一项所述的脱氧核糖核苷或脱氧核糖核苷酸。7.一种权利要求1或2所述的脱氧核糖核苷的合成方法，其中，包括进行2-溴噻吩衍生物与2-氨基-3-硝基-4-氯吡啶或7-氯-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶衍生物的偶联反应的工序。8.根据权利要求7所述的合成方法，其中，在铃木偶联反应条件下进行所述偶联反应。9.一种寡聚脱氧核糖核酸，其中，内含权利要求1或2所述的具有碱基的脱氧核糖核苷。10.一种寡聚核酸或其衍生物，其中，包含权利要求9所述的寡聚脱氧核糖核酸作为部分结构。11.一种修饰体，其中，它是使独立的任意的分子种结合于权利要求9所述的寡聚脱氧核糖核酸、或者权利要求10所述的寡聚核酸或其衍生物而得的修饰体。12.一种人或动物用医药品、该医药品的原料、健康食品的添加物、或者诊断试剂，其中，含有权利要求9所述的寡聚脱氧核糖核酸、权利要求10所述的寡聚核酸或其衍生物、或者权利要求11所述的修饰体。13.一种医疗用品，其中，含有权利要求9所述的寡聚脱氧核糖核酸、权利要求10所述的寡聚核酸或其衍生物、或者权利要求11所述的修饰体。14.根据权利要求13所述的医疗用品，其中，该医疗用品为医疗用材料、医疗用器材、医疗仪器或医疗用制品。15.一种用于亲和柱层析的载体，其中，含有权利要求9所述的寡聚脱氧核糖核酸、权利要求10所述的寡聚核酸或其衍生物、或者权利要求11所述的修饰体。
16.一种柱、物质分离用仪器或医疗仪器，其中，具备权利要求15所述的载体。

技术总结
本发明的目的是克服与靶分子的相互作用的多样化的欠缺、基于后修饰的适体获得的成本增加、电荷导致的靶分子种类的限制等现有方法中的DNA适体获得的问题，提供尽可能低成本地获得高活性适体的技术。本发明提供具有下述式I的结构作为碱基的核苷或核苷酸。下述式I中，R1为取代C


技术研发人员：武藤进 染谷龙彦 早濑要治 实崎大地
受保护的技术使用者：塔古西库斯生物株式会社
技术研发日：2021.12.16
技术公布日：2023/8/24