多肽circ1946-109aa作为食管鳞癌预后标志物的应用

1.本发明属于食管鳞癌标志物技术领域，具体涉及一种多肽circ1946-109aa、该多肽的融合蛋白、包含circ1946-109aa的药物组合物及所述多肽作为食管鳞癌预后标志物、免疫检查点调节剂的应用。


背景技术：

2.公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
3.食道鳞癌是病理类型为鳞状细胞的恶性肿瘤，属于消化系统常见的恶性肿瘤之一，占食道癌发病人群的90％。食道鳞癌最常见的临床症状是进行性加重的吞咽困难，并且随着病情的进展，患者还会出现转移灶的相关临床症状，严重时会威及生命。目前针对食管鳞癌发生发展的分子机制研究相对滞后，尚无有效的筛查方法。
4.circrna具有组织特异性、疾病特异性、时序特异性及高稳定性等特征，现有研究证实了circrna在生物的生长发育、胁迫应答、疾病的发生发展方面密切相关，circrna作为在食管鳞癌的标志物已具有相关报道。目前对circrna生物学功能仍存在较大未知部分，通常认为circrna可能通过mirna"海绵"、调控rna结合蛋白或rna聚合酶的方式调控蛋白转录。随着circrna编码潜能的验证和功能的探究，部分circrna编码产物也被证实发挥了一定的生理活性。目前，可编码circrna及其编码产物在胶质瘤等肿瘤中的作用已有初步探索，circrna编码产物可干扰肿瘤细胞的增殖、转移等生物学行为，影响肿瘤的发生发展。然而，来自于circrna的编码产物在食管鳞癌中的作用尚未有文献报道。
5.b7-h3，又称cd276，是一个重要的免疫检查点，可使肿瘤细胞免受人体t细胞的攻击和杀伤作用，已成为免疫治疗的新型靶点，但其在食管鳞癌中的作用有待进一步研究。另外，以往研究重点关注b7-h3的t细胞抑制功能及下游调节机制，b7-h3的上游调节机制这一层面上的工作在国内外都相对匮乏。


技术实现要素：

6.本发明研究发现，hsa_circ_0001946能够编码得到一段长度为109aa的多肽序列，本发明通过质谱检测、western blot、核糖体关联分析等实验方法验证了其真实存在。由于hsa_circ_0001946与免疫检查点分子b7-h3表达相关，本发明针对上述多肽与b7-h3的相关性进行研究，证实了该多肽能够降低b7-h3在rna水平的表达从而调控食管鳞癌免疫逃逸，另一方面，通过细胞划痕、transwell实验发现，过表达上述多肽有利于抑制食管鳞癌的转移，可作为潜在的治疗靶点。
7.基于上述研究成果，本发明提供如下的技术方案：
8.第一方面，提供具有如下序列的多肽：
9.(1)具有如seq id no:1所示氨基酸序列的多肽；
10.(2)与seq id no:1所示氨基酸序列进行一个或多个氨基酸的添加、取代或缺失所形成的衍生多肽，所述衍生多肽与上述多肽仍具有相同或基本相同的功能。
11.在本发明验证的一种实施方式中，hsa_circ_0001946编码的多肽，其氨基酸序列如seq id no:1所示，命名为circ1946-109aa；经验证，circ1946-109aa在食管鳞癌患者中为低表达，可作为食管鳞癌的预后标志物。进一步的，本发明还发现，circ1946-109aa能够抑制免疫检查点b7-h3的表达。b7-h3表达于癌细胞和骨髓细胞，包括t细胞和b细胞、单核细胞/巨噬细胞和树突状细胞，作为共刺激/共抑制免疫检查点分子具有双重作用，与肿瘤的生长、转移、复发和预后不良密切相关。上述发现提供了circ1946-109aa作为肿瘤免疫点抑制剂及食管鳞癌治疗活性成分的应用。
12.上述(2)方面中，所述一个或多个可以是1-50、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个或1-3个，所述添加、缺失或替换可以发生在seq id no:1所示氨基酸序列的n-末端和/或c-末端或序列中；进一步的，所述衍生多肽的序列与seq id no:1所示氨基酸序列具有90％及以上的相似性；更进一步的，所述相似性至少为91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％；所述氨基酸序列的相似性可采用本领域常用方式进行比对，例如blast方法。所述衍生多肽与circ1946-109aa仍具有相同或基本相同的功能，所述功能主要包括抑制b7-h3表达、调控食管鳞癌免疫逃逸、抑制食管鳞癌转移等功能。
13.另外，上述衍生多肽还广泛的包括circ1946-109aa经过化学或遗传修饰后形成的多肽产品；本领域常见的修饰方式包括链霉亲和素、各种分子(例如生物素、放射性同位素、荧光剂、酶、细胞毒性物质、抗肿瘤剂等)修饰等；还包括circ1946-109aa的固定化产品，如采用物理吸附、载体、树脂交联材料等对上述多肽进行固定或修饰的产品。
14.第二方面，提供一种融合蛋白，所述融合蛋白包括第一方面所示的多肽，还包括其他效应片段。
15.所述其他效应片段可能发挥的功效如延长体内半衰期、改善溶解性或提高透过生物屏障的能力；
16.进一步的，用于延长体内半衰期的片段为包括但不限于血清白蛋白或其片段、聚乙二醇、结合血清白蛋白的结构域(如抗血清白蛋白的单域抗体)、聚乙二醇-脂质体复合体中的一种。
17.进一步的，所述提高透过生物屏障能力的效应片段如穿膜肽，本领域常见的穿膜肽如为h7r8、hiv-i tat(48-60)、tat(47-57)、tat(48-57)、r9-tat中的一种。
18.其他优选的方案中，所述多肽与效应片段之间还具有连接肽，所述连接肽为丙氨酸(a)和/或丝氨酸(s)和/或甘氨酸(g)组成的柔性多肽链，连接肽的长度可以为3～30个氨基酸，进一步优选为3-9个、9-12个、12-16个、16～20个等。
19.第三方面，提供编码第一方面所述多肽、第二方面所述融合蛋白的核酸物质。
20.考虑到密码子简并性等因素，除hsa_circ_0001946外，所述核酸物质为任意能够翻译得到上述多肽及融合蛋白的编码核酸，包括dna形式及rna形式，其中，dna形式包括cdna、基因组dna或人工合成的dna，可以是单链的或是双链的，可以是编码链或非编码链。分离所述核酸物质的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，通过自动dna合成和/或重组dna技术等制备获得，也可以从适合的天然来源加以分离。
21.第四方面，提供包括第三方面所述核酸物质的构建体。
22.所述构建体的构建方法对于本领域技术人员来说是常规的，例如，通过体外重组dna技术、dna合成技术、体内重组技术等方法构建获得，更具体的，可以由所述的分离的多核苷酸插入到表达载体的多克隆位点构建而成。本发明中的表达载体通常指本领域熟知的各种市售表达载体等，例如可以是细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。
23.第五方面，提供一种药物组合物，所述组合物中包括第一方面所述多肽或第二方面所述融合蛋白，还包括药学上可接受的赋形剂。
24.所述药学上可接受的赋形剂，其剂量对于受试者而言应当是无害的，具体的种类可以是：缓冲剂、抗氧化剂、防腐剂、杀菌剂、亲水性聚合物、碳水化合物、螯合剂、张力调节剂、表面活性剂、成盐抗衡离子、金属复合物和/或非离子表面活性剂等。
25.第六方面，提供第一方面所述多肽作为食管鳞癌免疫检查点调节剂的应用。
26.上述应用的具体形式包括但不限于如下形式：
27.(1)circ1946-109aa的检测试剂在制备食管鳞癌预后判断产品中的应用；
28.(2)第一方面所述多肽、第二方面所述融合蛋白或第五方面所述药物组合物在制备b7-h3过表达疾病治疗药物中的应用；
29.(3)一种食管鳞癌的治疗方法，所述治疗方法包括向有治疗需求的对象施用治疗剂量的第一方面所述多肽、第二方面所述融合蛋白或第五方面所述药物组合物。
30.上述(1)方面中，所述食管鳞癌预后判断产品的种类包括试剂及器械，一种具体的实例如，试剂盒。
31.上述(2)方面中，所述b7-h3过表达疾病为肿瘤，为包括但不限于黑色素瘤、白血病、乳腺癌、前列腺癌、消化道癌中的一种，本发明验证的一种实例如，食管鳞癌。
32.以上一个或多个技术方案的有益效果在于：
33.目前，本领域对于circrna编码功能的研究仍较为空白，circrna编码产物与circrna活性的关联性还存在许多未知的部分，circrna编码产物的鉴定仍较为困难。本发明验证首先证实了hsa_circ_0001946能够编码新型蛋白circ1946-109aa，该研究成果仍具有较高的创新性。上述发现进一步丰富了circrna编码功能及疾病调控作用的研究资料，提供了一种可行的食道鳞癌治疗活性成分，具有重要的应用前景。
附图说明
34.构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
35.图1为实施例1中所述hsa_circ_0001946中编码蛋白的orf示意图；
36.图2为实施例1中所述质谱检测结果；
37.图3为实施例1中所述载体表达的circ1946-109aa电泳条带；
38.图4为实施例2中所述总体生存曲线分析结果；
39.图5为实施例2中所述细胞增殖实验结果；
40.图5a为转染t0及t1质粒的k30细胞增殖结果；
41.图5b为转染t3及t4质粒的k30细胞增殖结果；
42.图5c为转染t0及t1质粒的k510细胞增殖结果；
43.图5d为转染t3及t4质粒的k510细胞增殖结果；
44.图6为实施例2中所述细胞划痕实验结果；
45.图6a为分别转染t0、t1、t3、t4质粒的k30细胞划痕实验结果；
46.图6b为分别转染t0、t1、t3、t4质粒的k510细胞划痕实验结果；
47.图7为实施例2中所述transwell检测结果；
48.图7a为分别转染t0、t1、t3、t4质粒的k30细胞侵袭实验结果；
49.图7b为分别转染t0、t1、t3、t4质粒的k510细胞侵袭实验结果；
50.图8为实施例3中所述circ1946-109aa与b7-h3相关性结果。
具体实施方式
51.应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
52.需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
53.为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
54.实施例1circ1946-109aa蛋白验证
55.1.circ1946-109aa蛋白真实性存在的验证
56.hsa_circ_0001946的序列中包含开放阅读框(orf)，本实施例推测可能具备蛋白编码能力(如图1所示)，为了验证hsa_circ_0001946的编码产物是否存在，本实施例根据该orf序列翻译得到相应的多肽，长度为109个氨基酸：mssnnfkvfhqiqifqlihvfqknlclppnpslpvnlvlpeksrsssqsvssrkk srsssqsvssrkksrsssqsvssrkiyvfhqiqvfqsihifrkksrsssqymss，如seq id no:1所示，命名为circ1946-109aa，该新型蛋白的具体信息如下表所示：
[0057][0058]
为验证这种circ1946-109aa是否真实存在，本实施例首先对食管鳞癌细胞系(k30、k140、k150、k180、k510、k200、te1、colo680n、ec8712、te10)进行tmt标记定量蛋白质组测序和小肽类非标蛋白质组测序，并通过pfind软件搜索上述蛋白序列。质谱所产生的原始数据使用pfind 3.2.0处理，数据库使用目标蛋白序列进行检索。搜索参数设置：前体质量容错20ppm，二级碎片质量容错0.02da。氧化(甲硫氨酸)(+15.9949da)和乙酰化(蛋白n端)(+42.0106da)作为可变修饰，脲基(半胱氨酸)(+57.0215da)作为固定修饰，以及允许三个胰蛋白酶错过的切割。单个肽段只考虑长度至少为6个氨基酸的肽段，使其误发现率(fdr)控制在1％以内，鉴定蛋白时至少需要一条特异性的肽段，检测结果如图2所示。
[0059]
然后，构建hsa_circ_0001946相关的t系列载体(circ1946过表达质粒空载体(t0)、circ1946过表达质粒(t1)、circ1946-3*flag标签质粒(t2)、circ1946-orf过表达质
粒空载体(t3)、circ1946-orf过表达质粒(t4))，通过western blot(wb)检测flag标签蛋白，确定circ1946-109aa的真实性存在。
[0060]
上述过表达质粒构建及鉴定流程如下：
[0061]
t1构建方式如下：
[0062]
以pcr扩增hsa_circ_0001946(序列来源，circbank id:hsa_circcdr1_001)全长1485bp序列，以ecori和bamhi双酶切连接到plc5-cir中，筛选阳性克隆，加入测序引物，测序峰图正常，无杂峰或叠带，序列对比吻合，表明hsa_circ_0001946成功插入plc5-cir中，过表达载体构建成功。
[0063]
引物序列如下表：
[0064][0065]
t2构建方式如下：
[0066]
以pcr扩增hsa_circ_0001946_011-3xflag|1563nt全长1563bp序列，in-fusion克隆连接到plc5-cir。t2构建载体pll2212:hsa_circ_0001946_011插入3xflag表达载体。测序峰图正常，无杂峰或叠带，序列对比吻合，表明目的序列成功插入plc5-cir中，载体构建成功。
[0067]
引物序列如下：
[0068][0069]
t4构建方式如下：
[0070]
将circ1946-109aa结合3xflag标签作为目标序列，在atg前添加kozak序列(gccacc)，全长序列414bp，无缝克隆到pcdh-cmv-mcs-ef1a-gfp-puro载体，测序峰图正常，无杂峰或叠带，序列对比吻合，表明目的序列成功插入pcdh-cmv-mcs-ef1a-gfp-puro中，载体构建成功。
[0071]
引物序列如下：
[0072][0073]
表1.t系列载体及pcr、wb检测结果
[0074][0075]
注：circ1946为hsa_circ_0001946，109aa为circ1946-109aa，orf为编码circ1946-109aa的orf；“+”表示内源性表达，
“‑”
表示内源性不表达，
“↑”
表示高表达。
[0076]
t0为空载体，与t1的构建方法不同之处在于t0未插入目的序列。同样的，t3作为空载体，相比t4的构建，t3未插入目的序列。基于表1结果可以看出，circ1946-109aa作为hsa_circ_0001946的编码产物切实存在。上述结果表明，circ1946-109aa在食管鳞癌细胞系中切实具有相应的表达。
[0077]
2、制备circ1946-109aa特异性抗体
[0078]
使用重组蛋白作为抗原，可制备circ1946-109aa特异性抗体，制备流程如下：
[0079]
通过全基因合成的方式将orf序列构建到pet-28a-sumo载体表达蛋白,并测序鉴定正确。自动诱导培养16小时后，破菌纯化鉴定，获得蛋白。分离获取该重组蛋白免疫2只实验级日本大耳白兔，取三免血清，获得亲和纯化后的抗体。
[0080]
实施例2circ1946-109aa与食管鳞癌相关性验证
[0081]
1、kaplan-meier(k-m)生存曲线分析
[0082]
收集113例食管鳞癌肿瘤组织，制备微阵列组织芯片，使用免疫组化染色方法，对circ1946-109aa进行染色、阅片，对染色后的组织片在荧光显微镜下观察并分析。
[0083]
kaplan-meier(k-m)曲线用于进行总体生存(overall survival，os)分析。r语言为主要作图和统计工具。结果如图4所示，circ1946-109aa在食管鳞癌患者中为低表达，总体生存期更短，证实了circ1946-109aa作为食管鳞癌预后标志物的能力。
[0084]
2、细胞增殖、划痕、transwell实验
[0085]
使用细胞增殖、划痕、transwell实验对circ1946-109aa对食管鳞癌细胞系(k30和k510)活性、迁移和侵袭能力的影响进行评价，具体操作步骤如下：
[0086]
(1)细胞增殖实验：
[0087]
细胞计数试剂盒-8(cck-8)用于测定细胞活力。在96孔板中接种k30和k510的t系列质粒(表1)稳转细胞悬液，培养24、48、72小时，向板中每孔加入cck8溶液并孵育，用酶标仪测量450nm处的吸光度，结果如图5。
[0088]
(2)细胞划痕实验：
[0089]
划痕试验用以评估细胞的迁移能力。在6孔板中铺入适当数量的t系列质粒(表1)稳转细胞过夜培养，待细胞长满孔板，垂直于细胞平面进行划痕。划痕结束后计为实验的0点，然后分别在24、48小时取出拍照。结果如图6，t4质粒转染的细胞系中，划线处细胞数量显著少于其他实验组，证明,过表达circ1946-109aa能够抑制肿瘤细胞的迁移能力。
[0090]
(3)transwell实验：
[0091]
transwell模型用以评估细胞的侵袭能力。将适当数量的t系列质粒(表1)稳转细胞悬液铺入transwell上室中，24孔板下室加入500ul的含20％血清的培养基，下层培养液和上室之间千万不要有气泡。将培养板放入培养箱继续培养12-48h，吸弃上室下室培养液，pbs洗涤两次，将其下表面浸泡在甲醇溶液中固定，用结晶紫或台盼蓝染色，镜检，并计算pet膜下表面的细胞数，计算中间和四周5个视野，取平均值，结果如图7，过表达circ1946-109aa的食管鳞癌细胞侵袭能力降低。
[0092]
根据上述图5、图6及图7显示，circ1946-109aa过表达能够抑制食管鳞癌细胞的增殖、迁移及侵袭。
[0093]
实施例3circ1946-109aa与免疫检查点分子b7-h3表达相关性验证
[0094]
对食管鳞癌细胞系(k30、k510、te-1)转染circ1946-109aa过表达质粒，使用空载体转染细胞作为对照，提取细胞rna，使用qrt-pcr技术检测b7-h3表达量的变化，具体操作步骤如下：
[0095]
(1)rna提取
[0096]
收集食管鳞癌细胞加trizol后，室温放置5min，使其充分裂解；按200ul氯仿/ml trizol加入氯仿，剧烈振荡15s，室温静置5min；4℃、12,000
×
g离心15min；吸取上层水相，移至另一离心管中；按0.5ml异丙醇/ml trizol加入异丙醇混匀，室温放置10min；4℃、12,000
×
g离心10min，弃上清；按1ml 75％乙醇/ml trizol加入75％乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀；4℃、7,500
×
g离心5min，尽量弃上清；室温晾干5～10min，加入20μl depc水溶解沉淀。
[0097]
(2)rna质量和完整性检测
[0098]
测od值定量rna，记录a
260/280
比值和rna浓度。1％琼脂糖凝胶电泳，电泳完毕后，在紫外灯下观察，拍照保存。
[0099]
(3)逆转录
[0100]
①
配制第一链cdna合成反应液
[0101][0102]
注：用移液器轻轻吹打混匀。
[0103]
②
按下列条件进行第一链cdna合成反应
[0104][0105]
*如果模板具有复杂二级结构或高gc区域，可将反应温度提高至55℃，有助于提高
产量。
[0106]
(4)qpcr实验
[0107]
①
qpcr反应体系配制
[0108]
cdna(1:10稀释)2μl
[0109]
上游引物(10μm)0.4μl
[0110]
下游引物(10μm)0.4μl2
×
sybr green pcr master mix 10μl
[0111]
ddh2o up to 20μl
[0112]
②
qpcr反应程序设置
[0113][0114]
(5)qpcr引物
[0115][0116]
检测结果如图8所示，circ1946-109aa过表达组中b7-h3(即图8中cd276)的含量降低，意味着circ1946-109aa能够抑制免疫检查点b7-h3的表达。
[0117]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种多肽，其特征在于，所述多肽具有如seq id no:1所示氨基酸序列。2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽还广泛的包括seq id no:1所示序列的多肽经过化学或遗传修饰后形成的多肽产品；修饰方式包括链霉亲和素、生物素、放射性同位素、荧光剂、酶、细胞毒性物质、抗肿瘤剂修饰；还包括所述多肽的固定化产品，包括采用物理吸附、载体、树脂交联材料对上述多肽进行固定或修饰的产品。3.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括权利要求1-3任一项所示的多肽，还包括其他效应片段；所述其他效应片段发挥的功效包括延长体内半衰期、改善溶解性或提高透过生物屏障的能力；用于延长体内半衰期的片段为包括但不限于血清白蛋白或其片段、聚乙二醇、结合血清白蛋白的结构域、聚乙二醇-脂质体复合体中的一种；所述提高透过生物屏障能力的效应片段为穿膜肽，选自h7r8、hiv-i tat(48-60)、tat(47-57)、tat(48-57)、r9-tat中的一种。4.编码权利要求1或2所述多肽、权利要求3所述融合蛋白的核酸物质。5.包括权利要求4所述核酸物质的构建体。6.一种药物组合物，其特征在于，所述组合物中包括权利要求1或2所述多肽、权利要求3所述融合蛋白，还包括药学上可接受的赋形剂。7.权利要求1或2所述多肽作为食管鳞癌免疫检查点调节剂的应用。8.权利要求1或2所述多肽的检测试剂在制备食管鳞癌预后判断产品中的应用。9.权利要求1或2所述多肽、权利要求3所述融合蛋白或权利要求6所述药物组合物在制备b7-h3过表达疾病治疗药物中的应用。10.如权利要求9所述多肽、融合蛋白或药物组合物在制备b7-h3过表达疾病治疗药物中的应用，其特征在于，所述疾病为食管鳞癌。

技术总结
本发明涉及多肽circ1946-109aa作为食管鳞癌预后标志物的应用。本发明研究发现hsa_circ_0001946能够编码长度为109aa的多肽，命名circ1946-109aa。该多肽可作为食管鳞癌患者预后的标志物。同时，过表达circ1946-109aa后显降低了食管鳞癌细胞表面免疫检查点分子B7-H3的表达，以及细胞系的增殖和迁移能力，因此circ1946-109aa具有应用于临床中食管鳞癌RNA免疫疗法的潜能。免疫疗法的潜能。免疫疗法的潜能。


技术研发人员：范丽媛 田辉 孙亮 李冕 徐晓英
受保护的技术使用者：山东大学齐鲁医院
技术研发日：2023.06.07
技术公布日：2023/8/24