FBXW7在制备防治肌肉减少症和糖尿病的药物中的应用

fbxw7在制备防治肌肉减少症和糖尿病的药物中的应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种fbxw7在制备防治肌肉减少症和糖尿病的药物中的应用。


背景技术：

2.肌肉减少症由rosenberg于1988年首次提出，定义为年龄相关的骨骼肌质量和功能下降
1.。随着人们寿命的延长，老年性疾病—肌肉减少症已经成为一个越来越严重的健康问题。最近一项纳入了全球35篇文章和58404例受试者数据的meta分析提出，全球60岁以上的男性和女性肌肉减少症的患病率高达60％
2.。肌肉减少症是老年人的主要健康问题之一，增加残疾、跌倒、骨折风险、住院死亡率，给医疗及社会服务带来沉重负担
3.。
3.肌肉减少症是由蛋白合成和降解不平衡引起的，其机制包括缺乏运动、老年、恶性消耗性疾病以及慢性疾病，如肥胖和2型糖尿病
4.。2型糖尿病以胰岛素抵抗、氧化应激增加、促进炎症因子为特征，可能导致骨骼肌质量、力量、功能、代谢的损害
5.。而骨骼肌作为人体最大的胰岛素作用器官，其对葡萄糖的摄取占全身总量的80％，在葡萄糖的代谢中起着非常重要的作用
[6,7]
。骨骼肌质量和功能的下降，引起肌肉葡萄糖摄取减少，与2型糖尿病的发生显著相关
[8]
。
[0004]
泛素蛋白酶体途径介导的蛋白质降解，是机体调节细胞内蛋白质含量与功能的重要机制，在这一过程中，泛素连接酶发挥着关键的作用
[9,10]
。研究表明，泛素连接酶foxo32和trim63通过泛素化介导肌肉降解代谢，是肌肉萎缩非常重要的标志物
[11]
。肌肉特异性分布的泛素化连接酶mg53同时调控胰岛素受体和胰岛素受体底物的泛素化降解，从而调节骨骼肌糖代谢
[12]
。以上研究提示，泛素连接酶在肌肉质量维持和肌肉糖代谢稳态调控的发生中都起着非常重要的作用。
[0005]
fbxw7属于泛素化连接酶ring家族中scfs复合物的重要组成部分，于2001年首次被发现，它能够调节细胞周期蛋白cyclin e水平，并且在肿瘤细胞中发生突变
[13,14]
。后陆续有文献报道：fbxw7通过调节c-myc、notch1、cyclin e、src-3、mtor水平，在多个肿瘤的发生发展中，扮演着抑癌基因的重要角色
[15,16]
。fbxw7不仅参与肿瘤调控，还与代谢性疾病密切相关。目前的研究也发现，肥胖小鼠肝脏fbxw7的表达水平显著下降，并且fbxw7通过调节肝细胞因子fetuin a的蛋白稳定性，促进其降解，从而改善胰岛素抵抗及糖代谢紊乱
[17]
。骨骼肌与肝脏同为重要的糖代谢器官，然而泛素连接酶fbxw7对骨骼肌质量、功能的影响，以及对骨骼肌糖代谢的作用，目前尚无任何报道。
[0006]
参考文献：
[0007]
[1]traub j,bergheim i,eibisberger m,et al.sarcopenia and liver cirrhosis-comparison of the european working group on sarcopenia criteria 2010and 2019[j].nutrients,2020,12(2):
[0008]
[2]shafiee g,keshtkar a,soltani a,et al.prevalence of sarcopenia in the world:asystematic review and meta-analysis of general population studies
glucose homeostasis through degradation of fetuin-a[j].diabetes,2018,67(5):818-30.


技术实现要素：

[0024]
针对现有技术中的不足，本发明的目的是提供fbxw7在制备防治肌肉减少症及糖尿病的药物中的应用。
[0025]
为达到上述目的，本发明的解决方案是：
[0026]
在本发明的第一方面，提供fbxw7在制备预防及治疗肌肉减少症及糖尿病的药物中的应用。
[0027]
在一个优选例中，肌肉减少症包括2型糖尿病、老年或恶病质等原因所引起的骨骼肌减少。
[0028]
在本发明的另一方面，提供治疗肌肉减少症及糖尿病的药物组合物，药物组合物以fbxw7为活性成分，并进一步包含药学上可接受的载体。
[0029]
在一个优选例中，药物组合物的剂型为胶囊剂、颗粒剂、片剂、丸剂、口服液或注射液。
[0030]
由于采用上述方案，本发明的有益效果是：
[0031]
本发明通过构建fbxw7骨骼肌特异敲除小鼠动物模型，发现fbxw7骨骼肌敲除小鼠肌肉质量下降，出现肌肉萎缩，并伴有全身糖脂代谢紊乱。基于此，提供了fbxw7参与肌肉萎缩和糖尿病的发生发展这一观点，更为深入理解肌肉参与机体糖代谢紊乱的机制提供了新思路。故fbxw7或可作为一个全新的靶点，用于上述代谢性疾病的预防及治疗。
附图说明
[0032]
图1为本发明的实施例1中骨骼肌中fbxw7缺失影响骨骼肌质量的维持示意图((a)普通饮食喂养的对照小鼠和fbxw7骨骼肌敲除小鼠肌肉拍照；(b-f)两组小鼠肌肉组织/体重比)。
[0033]
图2为本发明的实施例2中fbxw7调节肌纤维大小和功能示意图((a)两组小鼠胫骨前肌(ta)切片行h&e染色和wga凝集素染色，比例尺：50μm；(b)两组肌纤维截面面积(csa)定量分析；(c)两组小鼠在跑步机上运动至力竭的跑步时间、最大跑步距离、小鼠抓力)。
[0034]
图3为本发明的实施例3中fbxw7骨骼肌敲除小鼠糖代谢受损示意图(a)普通饮食喂养对照小鼠(图示flox/flox)和fbxw7骨骼肌敲除小鼠(图示mko)的体重；(b)flox/flox和mko组小鼠拍照；(c-d)flox/flox和mko组小鼠的体成分分析；(e)flox/flox和mko组小鼠在喂食状态、禁食24h或禁食随后再饲喂2h的血糖水平)。
[0035]
图4为本发明的实施例4中fbxw7骨骼肌敲除加剧了肥胖小鼠的代谢紊乱示意图((a)高脂饮食的flox/flox和mko组小鼠体重曲线；(b)高脂饮食23周的flox/flox和mko组小鼠体成分分析；(c-d)分别对高脂饮食的flox/flox和mko组小鼠进行葡萄糖和胰岛素耐量试验；(e-g)小鼠血清甘油三酯水平(e)、游离脂肪酸水平(f)和肝脏甘油三酯含量(g)；(h)肝脏切片he染色)。
具体实施方式
[0036]
本发明提供了一种fbxw7在制备防治肌肉减少症和糖尿病的药物中的应用。
[0037]
本发明通过fbxw7骨骼肌特异性敲除动物模型，阐明了fbxw7在骨骼肌质量维持中的重要作用，并对全身糖代谢产生影响。故fbxw7或可作为靶标用于制备以下药物的应用中：(1)肌肉减少症的预防及治疗；(2)通过改善肌肉减少症或增加肌肉含量预防和治疗糖尿病。下面将结合附图和实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0038]
fbxw7
[0039]
在本发明中，所用的fbxw7蛋白可以是天然存在的，比如其可被分离或纯化自哺乳动物。此外，该fbxw7蛋白也可以是人工制备的，比如可以根据常规的基因工程重组技术来生产重组fbxw7蛋白。优选的，本发明可采用重组的fbxw7蛋白。任何适合的fbxw7蛋白均可用于本发明。该fbxw7蛋白包括全长的fbxw7蛋白或其生物活性片段。优选的，该fbxw7蛋白的氨基酸序列可以与genbank登录号nm_001177773.1、nm_001177774.1、nm_080428.3所示的序列基本上相同。
[0040]
经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的fbxw7蛋白的氨基酸序列也包括在本发明中。fbxw7蛋白或其生物活性片段包括一部分保守氨基酸的替代序列，经氨基酸替换的序列并不影响其活性或保留了其部分的活性。适当替换氨基酸是本领域公知的技术，该技术可以很容易地被实施并且确保不改变所得分子的生物活性。这些技术使本领域人员认识到，一般来说，在一种多肽的非必要区域改变单个氨基酸基本上不会改变生物活性。
[0041]
任何一种fbxw7蛋白的生物活性片段都可以应用到本发明中。在这里，fbxw7蛋白的生物活性片段的含义是指作为一种多肽，其仍然能保持全长的fbxw7蛋白的全部或部分功能。优选的，该生物活性片段至少保持50％的全长fbxw7蛋白的活性。在更优选的条件下，该活性片段能够保持全长fbxw7蛋白的60％、70％、80％、90％、95％、99％、或100％的活性。
[0042]
本发明也可采用经修饰或改良的fbxw7蛋白，比如，可采用为了促进其半衰期、有效性、代谢、和/或蛋白的效力而加以修饰或改良的fbxw7蛋白。经过修饰或改良的fbxw7蛋白可以是一种fbxw7蛋白的共轭物，或其可包含被取代的或人工的氨基酸。
[0043]
用途
[0044]
本发明提供fbxw7在制备治疗以下药物的应用中：(1)肌肉减少症的预防及治疗；(2)通过改善肌肉减少症或增加肌肉含量预防和治疗糖尿病。
[0045]
药物组合物
[0046]
本发明的药物组合物可含有活性试剂和药学上可接受的载体。药学上可接受的载体通常是安全、无毒的，且广义上可包括制药产业中用于制备药物组合物的任何已知物质，如填充剂、稀释剂、凝结剂、黏合剂、润滑剂、助流剂、稳定剂、着色剂、润湿剂、崩解剂等。在选择适用于投递合成肽的赋形剂时，主要需考虑此药物组合物的给药方式，本领域技术人员熟知此项技术。可根据不同的治疗用途确定本发明药物中活性试剂的含量。
[0047]
治疗方法
[0048]
本发明提供一种治疗肌肉减少症和糖尿病的方法，该方法包括给予需要的对象fbxw7。给予的量为治疗有效量，可根据个体的年龄、体重、性别、疾病种类和严重程度加以确定。对象可以是哺乳动物，尤其是人、鼠、兔子、猪、羊和狗等。给药方法是本领域常规的方法，例如口服、注射等，并可针对不同的试剂进行调整。如采取注射的给药方式，还可根据个体的症状施加于个体的特定部位，如眼、臀、股、膝、小腿、足、肩、臂、肘、前臂、手、头部等。
[0049]
实施例1：fbxw7缺失影响骨骼肌质量的维持
[0050]
方法：
[0051]
1.为研究fbxw7在肌肉中的作用，构建了fbxw7骨骼肌特异性敲除小鼠。将fbxw7flox/flox小鼠(购自美国jackson实验室，编号：017563)与肌酸激酶(mck)启动子连接的cre酶小鼠杂交，从而得到了fbxw7骨骼肌特异性敲除小鼠(mko)和同窝对照(flox/flox)。实验中所有小鼠均在spf级动物房饲养。饲养环境如下：温度为21
±
1℃，湿度为55
±
10％，昼夜节律为12h-12h。
[0052]
2.将8周龄以上的雄性小鼠处死，并分离肌肉组织。对不同的肌肉组织进行拍照及称重。
[0053]
结果：
[0054]
fbxw7骨骼肌特异性敲除小鼠(mko组)股四头肌(quad)、腓肠肌(gas)、胫骨前肌(ta)和趾长伸肌(edl)等多个肌肉质量降低(图1中的a图-f图)。
[0055]
实施例2：fbxw7调节肌纤维大小和功能
[0056]
方法：
[0057]
1.肌肉切片he染色
[0058]
(1)制作石蜡切片：4％多聚甲醛固定ta，经过上行梯度脱水、二甲苯透明处理以后，浸蜡，包埋。(2)用切片机连续切片，片厚5μm，裱于防脱片剂预处理过的载玻片上，37-40℃烤片过夜，切片4℃保存。(3)he染色：经过烤片、脱蜡、水化等步骤后，苏木精染色5min后流水冲洗。5％乙酸分化1min，流水冲洗。伊红染色1min，流水冲洗。再次梯度脱水，透明处理，晾干后中性树胶封片。
[0059]
2.肌肉切片wga染色
[0060]
(1)包埋：在冰冻切片包埋模具中装入光学相干断层扫描oct，注意避免有气泡，且oct深度必须大于ta长度。分离小鼠胫骨前肌(ta)，竖直放入oct中，注意ta在oct内尽量保持直立，且上端不露出。用镊子夹住模具，置于液氮中，放置液面下，轻晃30s左右捞出。速冻完成将包埋组织放在干冰上，待所有样品包埋完成后，转移至-80℃冰箱保存。(2)切片：将ta样品从-80℃冰箱取出，转移至-20℃冰箱放置30min。切片机调好角度，使肌肉组织切面为肌纤维横切面，切片厚度为10μm。(3)wga染色：1mg/ml wga-fitc溶液(sigma cat.l4895)用pbs稀释100倍，得到wga染液。将冰冻切片在室温复温10-30min后，使用pbs洗3遍，每遍5min。4％多聚甲醛固定15min，再次使用pbs洗3遍，每遍5min。切片上加入配好的wga染液，室温避光孵育20min。再次pbs洗3遍，5min，最后用50％甘油与指甲油封片。(4)荧光显微镜下拍照，并通过image j软件统计肌纤维面积。
[0061]
3.小鼠抓力测定、跑步耐量试验：
[0062]
(1)抓力测定:使用yls-大小鼠抓力测定仪(济南益延科技发展有限公司，中国)测定。正式测定小鼠抓力前，训练小鼠熟悉抓力测定仪。将小鼠放置于测定仪上，让其四肢抓
住仪器上的金属拉杆，向后拉拽小鼠，当时其力量释放时，记录为峰值张力。每只老鼠测试3-5次，其间休息30s。统计时取中位数。(2)跑步耐量试验使用zh-pt动物实验跑台(安徽正华仪器设备有限公司，中国)测定。正式跑步实验前，让小鼠在适应平板跑步机，每天跑1次，1次约20min，适应过程约3天。最大速度测定：将小鼠跑步起始速度设置为10m/min，持续10min。跑完10min预热后，每2min加速一次，每次加速2m/min，直到小鼠力竭，测得小鼠最大跑步速度。耐力测定：将小鼠跑步起始速度设置为10m/min，持续10min。跑完10min预热后，每5min加速一次，每次加速1m/min，直到小鼠力竭，测得小鼠最大跑步距离和跑步时间。
[0063]
结果：
[0064]
小鼠胫骨前肌切片行h&e及麦胚凝集素(wga)染色，结果显示，fbxw7敲除小鼠肌纤维横截面积(cross sectional area,csa)减少(图2中的a图-b图)。与之相应的，敲除小鼠出现运动能力下降。与对照组相比，mko组小鼠在平板跑步耐力试验中，表现出力竭时间提前、跑步距离缩短；且伴有抓力下降(图2中的c图)。
[0065]
实施例3：fbxw7骨骼肌敲除小鼠全身糖代谢受损
[0066]
方法：
[0067]
1.使用普通饲料喂养fbxw7骨骼肌特异性敲除小鼠(mko)和同窝对照(flox/flox)，并记录体重等表型。空腹血糖为小鼠饥饿6-16h测得；再进食血糖为小鼠饥饿6-16h后在给予喂食2h测得。在测量小鼠血糖的过程中，尽量保持小鼠在非激惹状态，动作轻柔。剪短小鼠尾尖1-2mm，挤出血滴，用强生公司血糖仪和试纸检测。
[0068]
2.体脂检测使用echomri-100小动物体脂分析仪(汇佳生物)进行小鼠体成分分析。
[0069]
结果：
[0070]
对照组和mko组小鼠体重在年轻时无明显差异，然而随着年龄的增加，fbxw7敲除小鼠的体重较对照组逐渐下降(图3中的a图)，体型较对照组略小(图3中的b图)。两组小鼠的早期(4周、6周)体重构成成分无显著差异。到16周时，两组小鼠脂肪成分(fat mass)虽无明显差异，而mko组小鼠脂肪外体重成分(lean mass)降低(图3中的c图-d图)。由此推断mko组小鼠体重的下降主要是肌肉萎缩导致。在普通饮食条件下，与对照组相比，mko组小鼠随机血糖、空腹血糖无明显差异，但饥饿再进食后2h血糖却明显高于对照组(图3中的e图)。
[0071]
实施例4：fbxw7骨骼肌敲除加剧了肥胖小鼠的代谢紊乱
[0072]
方法：
[0073]
1.为了进一步探究fbxw7骨骼肌敲除对于糖代谢的影响，给予两组小鼠高脂饮食24周。高脂饮食动物模型构建：小鼠分笼后，使用普通饲料喂养8到10周龄，然后换用高脂饲料喂养。
[0074]
2.糖代谢表型观察：(1)腹腔注射葡萄糖耐量试验(gtt)：小鼠饥饿16h后，按照2g/kg(小鼠体重)，腹腔注射葡萄糖，于0min、30min、60min、90min、120min尾静脉采血，测定血糖浓度。(2)胰岛素耐量试验(itt)：小鼠饥饿6h后，按照0.75-1.25iu/kg(小鼠体重)，腹腔内生理盐水配制的人胰岛素(商品名：诺和灵r)，0min、15min、30min、60min、90min、120min后尾静脉采血，测定血糖浓度。
[0075]
3.采用triglyceride quantification kit(bio vision公司)检测，具体操作步骤可见官网。简要概括如下：(1)配置标准液：去40μl的tg标准品用160μl assay buffer稀
释，得到0.2mm的tg标准品。在96孔酶标仪板上依次加入0.2mm的tg标准品0μl、10μl、20μl、30μl、40μl、50μl，体积差用assay buffer补齐。建立标准浓度梯度，即0nmol/孔、2nmol/孔、4nmol/孔、6nmol/孔、8nmol/孔、10nmol/孔。(2)上样：在96孔酶标仪板上依次加入待测样品50μl，必要时可将样品用assay buffer稀释。(3)根据triglyceride quantification kit说明书，依次加入lipase、酶与探针的混合物进行反应。在570nm波长处读取吸光光度，根据标准曲线，计算各个样品的浓度。
[0076]
结果：
[0077]
两组小鼠体重虽无明显差异(图4中的a图)，然而mko组小鼠非脂肪含量即肌肉(lean mass)较对照偏低(图4中的b图)。通过葡萄糖耐量试验和胰岛素耐量试验证实，mko组小鼠出现糖耐量受损、胰岛素抵抗(图4中的c图-d图)。高脂饮食后的mko组小鼠不仅出现糖代谢紊乱，而且也出现了脂代谢受损。相比对照组，实验组小鼠血清中甘油三酯(tg)虽无明显变化，而游离脂肪酸(ffa)浓度升高，肝脏甘油脂质沉积增加，并出现典型的气球样变(图4中的e图-h图)。可见fbxw7骨骼肌特异敲除小鼠在高脂饮食的诱导下，表现为更明显的全身的糖代谢受损，并伴有脂代谢的紊乱。
[0078]
上述对实施例的描述是为了便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用本发明。熟悉本领域技术人员显然可以容易的对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中，而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例。本领域技术人员根据本发明的原理，不脱离本发明的范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.fbxw7在制备预防及治疗肌肉减少症的药物中的应用。2.fbxw7在制备防治糖尿病的药物中的应用。3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述fbxw7为fbxw7蛋白或经修饰或改良的fbxw7蛋白片段。4.一种治疗肌肉减少症和糖尿病的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物以fbxw7为活性成分，并进一步包含药学上可接受的载体。5.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的剂型为胶囊剂、颗粒剂、片剂、丸剂、口服液或注射液。

技术总结
本发明提供了一种FBXW7在制备防治肌肉减少症和糖尿病的药物中的应用，通过构建泛素连接酶FBXW7骨骼肌特异敲除小鼠动物模型，发现FBXW7骨骼肌敲除小鼠肌肉质量下降，并伴随全身糖代谢紊乱。揭示了FBXW7可能作为肌肉减少症及糖尿病的潜在治疗靶点，或可作为肌肉萎缩的检测指标。其一，FBXW7在调节肌肉质量中发挥重要作用，其在肌肉中的表达下调可引起肌肉萎缩，若补充FBXW7可能用于肌肉减少症的治疗。其二，FBXW7骨骼肌敲除小鼠伴随全身糖脂代谢紊乱，用于代谢性疾病的机制探索及治疗，也为糖尿病的治疗和预防提供了新思路。尿病的治疗和预防提供了新思路。尿病的治疗和预防提供了新思路。


技术研发人员：汪娥 赵洁洁 李小英
受保护的技术使用者：复旦大学附属中山医院
技术研发日：2023.07.05
技术公布日：2023/8/24