一种生物催化生成C-糖苷的方法

一种生物催化生成c-糖苷的方法
技术领域
1.本发明涉及一种生物催化生成c-糖苷的方法，属于生物工程技术领域。


背景技术：

2.糖苷是一类广泛存在于自然界的化合物，具有多样化的结构和广泛的生理活性。该类化合物的生物活性在很大程度由结构中的糖基基团所决定，因此开发能高效催化对应苷元糖基化的方法，是有机化学家和药物化学家所关注的热点。天然产物生物合成中的糖基化反应是由糖基转移酶(gts；ec2.4.)负责催化完成，该类酶催化糖分子从活化的糖基供体转移到底物受体，以一种简单的方式一步法直接构建糖基化产物，避免了化学法中冗长的保护-脱保护步骤，因此这一类酶作为强有力的糖基化工具受到了科学家的普遍认可。
3.大多数糖苷类天然产物为o-糖基化修饰产物，除此之外糖苷类化合物还包括c-、n-、s-糖基化产物。从化学的角度出发，c-糖苷由于对自发、酸和酶催化水解具有显著的抗性，这一特性赋予了相应的糖基化产物具有更长的体内半衰期。然而，自然界中存在的具备催化c-糖苷键形成活性的gts相对较少，且所识别的底物范围相对较窄，催化效率大多相对较低，这些缺陷限制了它们的实际应用范围。


技术实现要素：

4.本发明旨在通过蛋白质工程手段改造印度芒果(mangiferaindica)来源的糖基转移酶micgt，提高产能和化学选择性。本发明提供了利用糖基转移酶突变体qdp(e152q/v190d/s122p)进行的生物催化合成不同c-糖苷的方法。该方法具有条件温和，环境友好，催化合成了不同化学选择性的糖基化产物等优点。
5.本发明的第一个目的是提供一种糖基转移酶micgt突变体qdp，将seq id no.1所示的氨基酸序列的第152位突变谷氨酸为谷氨酰胺，第190位缬氨酸突变为天冬氨酸，并将第122位丝氨酸突变为脯氨酸。
6.在本发明的一种实施方式中，编码所述糖基转移酶的核苷酸序列如seq id no.2所示。
7.本发明的第二个目的是提供编码上述糖基转移酶micgt突变体qdp的基因。
8.本发明的第三个目的是提供含有所述基因的表达载体。
9.在本发明的一种实施方式中，所述表达载体包括但不限于pet系列载体、prsf系列载体或pcdf系列载体。
10.本发明的第四个目的是提供表达所述突变体的基因工程菌。
11.在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌的宿主细胞包括但不限于大肠杆菌。
12.在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌的构建，具体包括如下步骤：以pet28a为载体，将编码所述突变体的基因与载体连接，在大肠杆菌e.colibl21(de3)中重组表达所述的糖基转移酶突变体。
13.本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基的成分：tb培养基，诱导剂为4-6g/lα-乳糖一水合物,优选温度为18～25℃，转速160～200rpm，表达时长为18-20h。
14.本发明的一个实施方式中，接种时加入约0.05％葡萄糖。
15.本发明的一个实施方式中，所述基因工程菌的蛋白纯化，具体包括如下步骤：用预冷的离心机收集表达菌体，缓冲溶液洗两次，加入少量溶菌酶，液氮速冻，冰水浴解冻，超声破碎，高速离心，采用his-镍柱亲和纯化及脱盐柱脱盐。
16.本发明的第五个目的是提供应用本发明的糖基转移酶micgt突变体qdp合成多种c-糖苷的方法。
17.本发明的一种实施方式中，所述方法是于40-60mmnah2po
4-na2hpo4缓冲体系中，投入酶量为40-100μg/100μl或者对应的全细胞(od
600nm
＝40-60)，ph＝7.0～8.0，30-40℃条件下，受体底物浓度为0.1-5mm，udp-葡萄糖浓度0.1-10mm或者2％的葡萄糖，反应转速为800-1200rpm，反应时间为2-6h。
18.本发明的第六个目的是提供所述突变体，或所述基因，或所述载体，或所述基因工程菌，或所述制备突变体的方法，或所述合成c-糖苷的方法在食品、制药等领域的应用。
19.有益效果：
20.本发明是使用来源于印度芒果(mangiferaindica)的糖基转移酶micgt生产芒果苷的基础上进行蛋白质工程改造，获得的突变体qdp(e152q/v190d/s122p)作为生物催化剂，催化bp-2，2,4-二羟基苯丙酮，根皮素或2-苯基-2',4',6'-三羟基苯乙酮生成对应的c-葡萄糖苷修饰产物。
21.(1)与野生酶micgt相比，以bp-2作为底物，突变体qdp(e152q/v190d/s122p)可得到高化学选择性的c-葡萄糖苷修饰产物，转化率从近3％提高到99％以上，ton从136提高到10375，比酶活从135.8u/mg提高到939.4u/mg，并在1.5l的反应体系中实现了高化学选择性的c-葡萄糖苷修饰产物的克级制备(1.2g)。
22.(2)以2,4-二羟基苯丙酮作为底物，可得到高化学选择性的c-葡萄糖苷修饰产物，转化率从《3％提高到54％；以根皮素作为底物，可得到高化学选择性的c-葡萄糖苷修饰产物，转化率从17％提高到99％以上；以2-苯基-2',4',6'-三羟基苯乙酮作为底物，可得到高化学选择性的c-葡萄糖苷修饰产物，转化率从11％提高到99％以上。
附图说明
23.图1：bp-2与糖基转移酶micgt的突变体qdp和野生型的反应混合液的hplc色谱图(a)和柱形图(b)。
24.图2：bp-2与突变体qdp反应产生的产物1a和1b的一级质谱和二级质谱图；a)1a的ms；b)1a的ms2；c)1b的ms；d)1b的ms2。
25.图3：2,4-二羟基苯丙酮与糖基转移酶micgt的突变体qdp和野生型的反应混合液的hplc色谱图(a)和柱形图(b)。
26.图4：2,4-二羟基苯丙酮与突变体qdp反应产生的反应产生的产物2a和2b的一级质谱和二级质谱图；a)2a的ms；b)2a的ms2；c)2b的ms；d)2b的ms2。
27.图5：根皮素与糖基转移酶micgt的突变体qdp和野生型的反应混合液的hplc色谱图(a)和柱形图(b)。
28.图6：根皮素与突变体qdp反应产生的产物3a和3b的一级质谱和二级质谱图；a)3a的ms；b)3a的ms2；c)3b的ms；d)3b的ms2。
29.图7：2-苯基-2',4',6'-三羟基苯乙酮与糖基转移酶micgt的突变体qdp和野生型的反应混合液的hplc色谱图(a)和柱形图(b)。
30.图8：2-苯基-2',4',6'-三羟基苯乙酮与突变体qdp反应产生的产物4a和4b的一级质谱和二级质谱图；a)4a的ms；b)4a的ms2；c)4b的ms；d)4b的ms2。
具体实施方式
31.本发明中所采用的化学药品，均以商业途径购买获得。
32.实施例里采用的培养基配方如下：
33.固体培养基配方(1l)：酵母提取物5g、蛋白胨10g、氯化钠10g、琼脂15g，用去离子水定容，高压蒸汽灭菌。
34.lb培养基配方(1l)：酵母提取粉5g、蛋白胨10g、氯化钠10g，用去离子水定容，高压蒸汽灭菌。
35.tb培养基配方(1l)：酵母提取物24g、蛋白胨12g、甘油4ml。加入900ml去离子水，使溶解后高压蒸汽灭菌，再加入100ml经同样灭菌操作后的0.17mkh2po4/0.72mk2hpo4的溶液。(注：氯化钠购自阿拉丁，其余均购自生工生物有限公司)
36.产物分析方法：高效液相色谱及质谱分析。其相应液相检测方法为5-μmc18柱，pda检测器，流动相为：a相(h2o含0.1％甲酸)与b相(甲醇含0.1％甲酸)。梯度洗脱程序为：10-50％b8min，50％-85％b2min，85％b3min，80％-10％b7min。
37.转化数(turnovernumber，ton)定义：表示在一定温度、压力、反应物比例和一定的反应程度下，单位时间内、单位活性位点上发生催化反应的次数或生成目标产物的数目或消耗反应物的数目。
38.转化数(turnovernumber，ton)计算：在50mmnah2po
4-na2hpo4(ph8.0)中，分别加入3/4/5mm的底物和不同浓度的纯化好的micgt的突变体qdp，分别为0.1μm，0.2μm，0.5μm，1μm，2μm，3μm在40℃反应24h，总体积为100μl。加入300μl的冰甲醇终止反应，通过液相色谱检测。计算ton，计算方法为转化的底物的量/酶的量。
39.糖基转移酶的酶活测定：在200μl反应缓冲液中进行糖基转移酶的活性测定，其中包括6mmudp-葡萄糖，50mmnah2po
4-na2hpo4(ph8.0)和约1μg的突变体纯化酶。在50℃孵育5分钟，然后通过添加相同体积的甲醇终止反应，通过hplc分析。一个单位的酶活性定义为1min消耗1μmol受体底物或生成1μmol产物的酶量。
40.蛋白质含量检测：使用nano-300微量分光光度计测定280nm处蛋白的吸收。
41.比酶活计算：比活＝1u
·
(mg蛋白质)-1
＝1μmol
·
(min
·
mg蛋白质)-1
。
42.转化率的计算：转化率＝已转化的原料的量/原料的总量*100％。
43.实施例1：糖基转移酶micgt蛋白质工程改造
44.(1)突变体的设计和制备：
45.以序列如seq id no.2所示的基因为模板，设计引物，对位点s122，e152和v190突变，获得qdp(e152q/v190d/s122p)突变体的编码基因。
46.表1qdp突变引物
na2hpo4(ph8.0)，dmso(v/v,5％)，生物催化剂为含突变体qdp的全细胞，催化剂终浓度为od
600
＝40，在30℃反应24h。随后，样品在4,000g下离心5分钟，收集上清。用20mlddh2o洗涤细胞，离心2次。上清液经过滤，用大孔树脂柱层析初步纯化和浓缩，再利用硅胶柱层析进一步纯化，分离得到1.2gc-糖苷产物。
57.实施例4：糖基转移酶micgt及其突变体qdp催化2,4-二羟基苯丙酮合成c-葡萄糖苷
58.在100μl反应体系中，udp-葡萄糖的浓度为4mm，底物2,4-二羟基苯丙酮浓度为3mm，50mmnah2po
4-na2hpo4(ph8.0)，dmso(v/v,5％)，生物催化剂纯酶突变体qdp的终浓度为54μg，以野生酶为对照，30℃下反应2h得到相应糖基化产物。加3倍体积冰甲醇终止反应，高效液相色谱及质谱分析。
59.由图3和图4可以看出，突变体qdp催化2,4-二羟基苯丙酮可以得到c-葡萄糖苷产物，转化率54％。而野生酶得到较为混杂的糖苷产物，转化率《3％。突变体较野生酶化学选择性更高的同时，转化率大幅度提高。
60.实施例5：糖基转移酶micgt及其突变体qdp催化4-氟-2',4'-二羟基二苯甲酮合成c-葡萄糖苷
61.在100μl反应体系中，udp-葡萄糖的浓度为4mm，底物根皮素(4-氟-2',4'-二羟基二苯甲酮)浓度为3mm，50mmnah2po
4-na2hpo4(ph8.0)，dmso(v/v,5％)，生物催化剂纯酶突变体qdp的终浓度为54μg，以野生酶为对照，30℃下反应2h得到相应糖基化产物。加3倍体积冰甲醇终止反应，高效液相色谱及质谱分析。
62.由图5和图6可以看出，突变体qdp催化4-氟-2',4'-二羟基二苯甲酮可以得到c-葡萄糖苷产物，转化率》99％。而野生酶虽可以得到c-葡萄糖苷产物，但转化率仅17％。突变体较野生酶可以得到化学选择性不同的产物，且转化率大幅度提高。
63.实施例6：糖基转移酶micgt及其突变体qdp催化4'-羟基苯庚酮合成c-葡萄糖苷
64.在100μl反应体系中，udp-葡萄糖的浓度为4mm，底物4'-羟基苯庚酮浓度为3mm，50mmnah2po
4-na2hpo4(ph8.0)，dmso(v/v,5％)，生物催化剂纯酶突变体qdp的终浓度为54μg，30℃下反应2h得到相应糖基化产物。加3倍体积冰甲醇终止反应，高效液相色谱及质谱分析。
65.由图7和图8可以看出，突变体qdp催化4'-羟基苯庚酮可以得到c-葡萄糖苷产物，转化率》99％。而野生酶虽可以得到c-葡萄糖苷产物，但转化率仅11％。突变体较野生酶可以得到化学选择性不同的产物，且转化率大幅度提高。
66.虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

技术特征：
1.一种糖基转移酶micgt的突变体，其特征在于，将seq id no.1所示的氨基酸序列的第152位谷氨酸突变为谷氨酰胺，并将第190位缬氨酸突变为天冬氨酸，并将第122位丝氨酸突变为脯氨酸。2.编码权利要求1所述突变体的基因。3.含有权利要求2所述基因的表达载体，其特征在于，所述表达载体包括pet系列载体、prsf系列载体或pcdf系列载体。4.表达权利要求1所述突变体的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌的宿主细胞包括大肠杆菌。5.制备权利要求1所述突变体的方法，其特征在于，将权利要求4所述的基因工程菌发酵。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，发酵过程中添加诱导剂，所述诱导剂为4-α-乳糖或iptg。7.一种合成c-糖苷的方法，其特征在于，以udp-葡萄糖或者葡萄糖为糖基供体，以权利要求1所述的突变体或者权利要求4所述的基因工程菌作为生物催化剂，以bp-2、2,4-二羟基苯丙酮、根皮素或2-苯基-2',4',6'-三羟基苯乙酮为受体进行反应。8.权利要求1所述突变体，或权利要求2所述基因，或权利要求3所述表达载体，或权利要求4所述基因工程菌，或权利要求5或6所述方法，或权利要求7所述方法在食品、制药等领域的应用。

技术总结
本发明公开了一种生物催化生成C-糖苷的方法，属于生物工程技术领域。通过蛋白质工程改造糖基转移酶以获得更高产率与区域选择性的突变体，所得的突变体QDP作为生物催化剂，以BP-2、2,4-二羟基苯丙酮、4-氟-2',4'-二羟基二苯甲酮或者4'-羟基苯庚酮作为受体底物，UDP-葡萄糖作为供体底物，催化合成对应的C-葡萄糖苷修饰产物，在糖苷类化合物的合成方面具有应用价值。用价值。用价值。


技术研发人员：王健博 李敏
受保护的技术使用者：湖南师范大学
技术研发日：2023.06.27
技术公布日：2023/8/24