重组Lp（a）及其基因和制备方法、重组Lp（a）抗体与流程

重组lp(a)及其基因和制备方法、重组lp(a)抗体
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种重组lp(a)及其基因和制备方法、重组lp(a)抗体、lp(a)抗原、重组表达载体、lp(a)检测标准品、检测试剂盒。


背景技术：

2.脂蛋白(a)(lipoprotein(a)，lp(a))是由低密度脂蛋白颗粒与载脂蛋白(a)(apolipoprotein(a)，apo(a))组成。低密度脂蛋白颗粒与血浆中的ldl在脂质组成上非常相似，而且也具有载脂蛋白b100(apolipoprotein b100，apo b100)。apo(a)与低密度脂蛋白颗粒中的apo b100通过一个二硫键交链在一起。apo(a)是高度糖基化的蛋白质，由多拷贝的纤溶酶原kringle4样的重复片段、单拷贝的与纤溶酶原同源的kringle5和丝氨酸蛋白酶样区域构成。apo(a)中的kringle4有10种不同亚型(命名为k41-10)，除k42的拷贝数从3-43个不等，其他9型均含有1个拷贝，所以k42型的重复数决定了apo(a)分子的大小，它是导致lp(a)相对分子质量个体间差异较大的主要原因，lp(a)相对分子质量在(180-800)*103不等。此外不同个体间乃至同一个个体不同lp(a)中所含胆固醇量的差异也是导致lp(a)分子量个体间差异的原因之一。lp(a)的主要功能几乎都与apo(a)的存在有关。
3.脂蛋白的主要功能是参与体内脂质的转运与代谢。lp(a)有与ldl颗粒一样的致as风险，包括进入血管壁后的氧化倾向，产生高度的免疫原性和醋延性氧化型低密度脂蛋白。apo(a)的蛋白酶结构域与纤溶酶原的蛋白酶结构的氨基酸序列88％一致，但缺乏组织性纤溶酶原激活剂(t-pa)的切割位点，所以apo(a)不具有降解纤素蛋白的蛋白酶活性。但可以通过竞争机制抑制t-pa对纤维酶原的活化，同时增加内皮细胞合成纤维酶原激活抑制剂，所以lp(a)还有促进血栓形成的作用。
4.目前，用于临床血清lp(a)检测的方法主要包括放射性免疫测定法(ria)、酶联免疫吸附试验(elisa)、免疫速率散射比浊法、微球捕获酶免疫法(meia)等。这些方法中都需要用到不同或一定浓度的lp(a)抗原作为标准品制作标准曲线，从而计算样品中lp(a)的含量。但是，国内禁止买卖人血清，从国外购买lp(a)成本昂贵且来源有限，而重组表达的lp(a)具有天然蛋白结构与生物活性，可以应用到体外诊断行业中。因此，发展重组lp(a)代替人源lp(a)非常有必要。


技术实现要素：

5.本发明解决了现有lp(a)成本昂贵且来源有限的技术问题，通过重组lp(a)代替人源lp(a)，实现了降低lp(a)成本，且容易获得的技术效果。
6.为解决上述问题，本发明提供一种重组lp(a)，重组lp(a)的氨基酸序列如seq id no.1或seq id no.2或seq id no.3所示。
7.与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：根据ncbi网站公布的lp(a)的氨基酸序列以及该序列的特征，设计表达重组lp(a)，重组表达的lp(a)具有天然蛋白结构与生物活性，且生物活性高，可以应用到体外诊断行业中，能够代替人源lp(a)，进而降低
lp(a)生产成本，且容易获得，重组lp(a)能够通过酵母表达系统表达。
8.本发明还提供一种上述重组lp(a)的基因，基因的核苷酸序列如seq id no.4或seq id no.5或seq id no.6所示。
9.与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：本发明提供的重组lp(a)的基因具有上述实例的重组lp(a)所有的有益效果，在此不再赘述。。
10.本发明还提供一种重组表达载体，包含上述重组lp(a)的基因。
11.与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：本发明提供的重组表达载体具有上述实例的重组lp(a)的基因所有的有益效果，在此不再赘述。
12.本发明还提供一种lp(a)抗原，采用上述重组lp(a)制备得到。
13.与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：本发明提供的lp(a)抗原具有上述实例的重组lp(a)所有的有益效果，在此不再赘述。
14.本发明还提供一种重组lp(a)抗体，采用上述重组lp(a)制备得到。
15.与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：重组lp(a)通过免疫动物能够获得多克隆抗体，且抗体免疫效价高。本发明提供的重组lp(a)抗体具有上述实例的重组lp(a)所有的有益效果，在此不再赘述。
16.本发明还提供一种lp(a)检测标准品，包含上述重组lp(a)。
17.与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：本发明提供的lp(a)检测标准品具有上述实例的重组lp(a)所有的有益效果，在此不再赘述。。
18.本发明还提供一种检测试剂盒，包含上述重组lp(a)或上述lp(a)检测标准品。
19.与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：上述实例的重组lp(a)或lp(a)检测标准品具有天然蛋白结构与生物活性，能够适用于体外检测。本发明提供的检测试剂盒具有上述实例的重组lp(a)或lp(a)检测标准品所有的有益效果，在此不再赘述。
20.本发明还提供一种重组lp(a)的制备方法，包括以下步骤：s10：构建重组lp(a)质粒：优化lp(a)的氨基酸序列，优化后的氨基酸序列如seq id no.1或seq id no.2或seq id no.3所示，按照酵母偏好密码子，对优化后的氨基酸序列所对应的基因序列进行基因优化并合成克隆至ppiczalphaa载体，获得重组lp(a)质粒；s20：重组lp(a)质粒的转化：将重组lp(a)质粒进行线性化，将线性化后的重组lp(a)质粒转化至酵母gs115感受态细胞，获得重组酵母转化子；s30：将重组酵母转化子接种于含有g418的ypd平板上，筛选得到高拷贝转化子，获得重组高拷贝菌株；s40：将重组高拷贝菌株依次接种至bmgy培养基和bmmy培养基，经甲醇诱导表达，离心，收集上清液，得到重组蛋白溶液；s50：检测重组蛋白溶液中各单菌落的表达量，选取表达量最高的菌落进行划线接种，放大诱导表达，离心，收集上清液；s60：采用ni柱对s50得到的上清液进行纯化，得到重组lp(a)。
21.与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：本实例提供的重组lp(a)的制备方法通过酵母表达系统表达重组lp(a)，首先设计构建重组lp(a)的氨基酸序列，并按照酵母偏好密码子进行基因优化，克隆至载体上，获得重组lp(a)质粒；重组lp(a)质粒线性化后，能够以同源重组的方式与宿主菌的染色体进行整合，这样外源基因才能够稳定存在，而且同源重组一旦形成会很稳定，在通过后期的筛选排除没有整合成功的质粒和宿主菌，挑选整合成功并能够高表达的重组转化子，获得重组高拷贝菌株，通过甲醇诱导表达，筛选出表达量最高的菌落进行放大诱导表达，提高重组lp(a)的表达量。上述制备方法步骤简
单，容易操作，且最终获得的重组lp(a)活性高。
附图说明
22.图1为本发明实施例提供的重组蛋白纯化后的凝胶电泳图。
具体实施方式
23.为使本发明的上述目的、特征和优点能够更为明显易懂，下面对本发明的具体实施例做详细的说明。
24.实施例一：
25.本发明实施例提供一种重组lp(a)，重组lp(a)的氨基酸序列如seq id no.1或seq id no.2或seq id no.3所示。
26.具体的，根据ncbi网站公布的lp(a)的氨基酸序列以及该序列的特征，设计表达k42单体、k42二聚体、k4
1-2-3
异聚体，氨基酸序列分别如seq idno.1、seq id no.2和seq id no.3所示。
27.具体的，重组表达的lp(a)具有天然蛋白结构与生物活性，且生物活性高，可以应用到体外诊断行业中，能够代替人源lp(a)，进而降低lp(a)生产成本，且容易获得，重组lp(a)能够通过酵母表达系统表达。
28.实施例二：
29.本发明实施例提供一种上述实施例一的重组lp(a)的基因，基因的核苷酸序列如seq id no.4或seq id no.5或seq id no.6所示。
30.具体的，在实施例一的基础上，按照酵母偏好密码子进行基因优化并合成克隆至ppiczalphaa载体，优化后的基因的核苷酸序列如seq id no.4、seq id no.5和seq id no.6所示，且合成基因带有ecor i与not i酶切位点。本发明提供的重组lp(a)的基因具有上述实例的重组lp(a)所有的有益效果，在此不再赘述。
31.实施例三：
32.本发明实施例提供一种重组表达载体，包含上述实施例二的重组lp(a)的基因。
33.优选的，本发明提供的重组表达载体具有上述实例的重组lp(a)的基因所有的有益效果，在此不再赘述。
34.实施例四：
35.本发明实施例提供一种lp(a)抗原，采用上述实施例一的重组lp(a)制备得到。
36.优选的，本发明提供的lp(a)抗原具有上述实例的重组lp(a)所有的有益效果，在此不再赘述。
37.实施例五：
38.本发明实施例提供一种重组lp(a)抗体，采用上述实施例一的重组lp(a)制备得到。
39.优选的，重组lp(a)通过免疫动物能够获得多克隆抗体，且抗体免疫效价高。本发明提供的重组lp(a)抗体具有上述实例的重组lp(a)所有的有益效果，在此不再赘述。
40.实施例六：
41.本发明实施例提供一种lp(a)检测标准品，包含上述实施例一的重组lp(a)。
42.优选的，本发明提供的lp(a)检测标准品具有上述实例的重组lp(a)所有的有益效果，在此不再赘述。
43.实施例七：
44.本发明实施例提供一种检测试剂盒，包含上述实施例一的重组lp(a)或上述实施例六的lp(a)检测标准品。
45.优选的，上述实例的重组lp(a)或lp(a)检测标准品具有天然蛋白结构与生物活性，能够适用于体外检测。本发明提供的检测试剂盒具有上述实例的重组lp(a)或lp(a)检测标准品所有的有益效果，在此不再赘述。
46.实施例八：
47.本发明实施例提供一种重组lp(a)的制备方法，包括以下步骤：
48.s10：构建重组lp(a)质粒：优化lp(a)的氨基酸序列，优化后的氨基酸序列如seq id no.1或seq id no.2或seq id no.3所示，按照酵母偏好密码子，对优化后的氨基酸序列所对应的基因序列进行基因优化并合成克隆至ppiczalphaa载体，获得重组lp(a)质粒；
49.s20：重组lp(a)质粒的转化：将重组lp(a)质粒进行线性化，将线性化后的重组lp(a)质粒转化至酵母gs115感受态细胞，获得重组酵母转化子；
50.s30：将重组酵母转化子接种于含有g418的ypd平板上，筛选得到高拷贝转化子，获得重组高拷贝菌株；
51.s40：将重组高拷贝菌株依次接种至bmgy培养基和bmmy培养基，经甲醇诱导表达，离心，收集上清液，得到重组蛋白溶液；
52.s50：检测重组蛋白溶液中各单菌落的表达量，选取表达量最高的菌落进行划线接种，放大诱导表达，离心，收集上清液；
53.s60：采用ni柱对s50得到的上清液进行纯化，得到重组lp(a)。
54.具体的，本实例提供的重组lp(a)的制备方法通过酵母表达系统表达重组lp(a)，首先设计构建重组lp(a)的氨基酸序列，并按照酵母偏好密码子进行基因优化，克隆至载体上，获得重组lp(a)质粒；重组lp(a)质粒线性化后，能够以同源重组的方式与宿主菌的染色体进行整合，这样外源基因才能够稳定存在，而且同源重组一旦形成会很稳定，在通过后期的筛选排除没有整合成功的质粒和宿主菌，挑选整合成功并能够高表达的重组转化子，获得重组高拷贝菌株，通过甲醇诱导表达，筛选出表达量最高的菌落进行放大诱导表达，提高重组lp(a)的表达量。上述制备方法步骤简单，容易操作，且最终获得的重组lp(a)活性高。
55.实施例九：
56.在一个具体实施例中，重组lp(a)的制备方法包括以下步骤：
57.(1)重组lp(a)设计与构建：
58.根据ncbi网站公布的lp(a)的氨基酸序列以及该序列的特征，设计表达k42单体、k42二聚体、k4
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异聚体，氨基酸序列分别如seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3所示。
59.委托南京金斯瑞按照酵母偏好密码子进行基因优化并合成克隆至ppiczalphaa载体，获得重组lp(a)质粒，基因的核苷酸序列如seq id no.4、seq id no.5、seq id no.6所示，合成基因带有ecor i与not i酶切位点。
60.(2)重组lp(a)质粒转化
61.对重组lp(a)质粒进行线性化，回收线性化产物，取80μl酵母gs115感受态细胞，与10-15μg上述线性化的重组质粒混合，移入0.2cm电转化杯，冰浴5min。使用伯乐电转仪进行点击(电压1.4kv)。立即加入1ml冰浴的山梨醇，将混合物转到1.5ml无菌离心管中，30℃静置孵育1h-2h。取100-200μl转化后的菌液涂布于含md的ypd平板上，30℃静置培养2d-3d，观察转化子的生长。
62.(3)转化子的高拷贝筛选
63.准备不同浓度的g418(200ug/ml、400ug/ml、800ug/ml、1200ug/ml、1600ug/ul)ypd平板，将md板上的菌落点接种于低浓度的g418板上，于30度培养，待长出后点接于高浓度的g418平板。
64.(4)转化子表达
65.取上述高浓度的g418平板上的菌株，分别接种于10mlbmgy(ph6.0)培养基中，30℃震荡培养24h，至od600达到2.0-6.0时收集细胞。等体积(10ml)bmmy重悬细胞沉淀，30℃震荡培养，诱导表达。在诱导过程中，每24h补充甲醇至终浓度1％。连续诱导培养3-5d，每24h取1ml发酵液，离心取上清。使用宁波普瑞柏生物技术股份有限公司的lp(a)体外诊断试剂盒检测上清中重组蛋白的浓度(单位mg/ml)，检测结果参见表1。
66.表1重组蛋白的浓度检测结果
67.菌落编号k42单体k42二聚体k4
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异聚体128.838.57.6232.872.225.5320.015.09.0455.033.025.0525.353.38.3647.621.212.1735.162.511.2821.646.05.2919.019.815.41052.959.79.2
68.k42单体、k42二聚体、k4
1-2-3
异聚体各挑选10个单菌落进行表达实验，通过表1可知各单菌落的表达量，分别选取表达量最高的菌落进行划线接种与放大表达。
69.(5)高表达转化子的放大诱导表达
70.筛选出高表达的种子划线至ypd平板上30℃培养2-3d。挑取单菌落于50ml ypd中，在30℃，250rpm摇床培养过夜。以0.2％的量接种于bmgy培养基中，在28℃，250rpm摇床培养至od600为5.0-6.0左右，6000r/min离心10min收集bmgy培养基中菌体。弃去bmgy培养基，更换为bmmy培养基，使菌体od600为3.0左右。于28℃诱导表达，每24h加入1％甲醇，250r/min发酵5d。发酵结束后，6000r/min离心10min收集上清，上清使用lp(a)体外诊断试剂盒进行检测，检测结果参见表2。
71.表2转化子放大表达浓度检测结果
72.蛋白名称k42单体k42二聚体k4
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异聚体检测浓度44.250.512.7
73.通过表2可知，放大表达后各菌种表达量有所下降。
74.(6)重组lp(a)的纯化
75.使用ge ni柱对上述上清液进行纯化，平衡液为20mm pb、500mm nacl(ph 7.4)，250mm咪唑(20mm pb、500mm nacl，ph 7.4)进行洗脱，透析后分装保存于pbs(ph 7.4)中。将蛋白稀释1/2、1/4、1/8、1/16、1/32使用lp(a)体外诊断试剂盒进行活性检测，检测结果参见表3，同时进行sds-page鉴定，检测结果参见图1。
76.具体的，图1为重组蛋白纯化后的凝胶电泳图，泳道1是k4
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异聚体，泳道2是k42二聚体，泳道3是marker，泳道4是k42单体。因酵母糖基化修饰k42二聚体与k4
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异聚体主条带不清晰。
77.表3重组蛋白生物活性检测结果
78.稀释倍数k42单体k42二聚体k4
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异聚体未稀释253.5598.7202.91/2162.6335.6153.21/494.3174.2101.31/857.790.555.61/1633.142.337.41/3211.420.816.1
79.通过表3可知，3个重组蛋白中k42二聚体线性范围最广，活性最优。
80.(7)多克隆抗体的制备
81.将上述纯化的重组抗原与大肠表达系统重组表达的k42单体、k42二聚体同时各免疫5只免疫新西兰大白兔，免疫剂量为0.4mg/只，加强免疫7天后取全血。将收集的血液放置在37℃2h左右，凝固后，放置在4-8℃过夜，6000rpm/min离心10min,吸出血清。将抗血清进行protein a纯化，纯化后的抗体透析并保存在pbs(ph7.4)中。
82.(8)elisa检测抗体效价
83.将上述纯化的抗体使用tp试剂盒测浓度后，取1ml抗体使用pbs稀释至浓度为10mg/ml，进行elisa检测。
84.将宁波普瑞柏lp(a)校准品(人源蛋白)使用碳酸盐缓冲液稀释进行包被，89ng/孔，4℃过夜；
85.弃包被液，洗涤拍干，加入1％明较进行封闭，37℃反应2h；
86.弃封闭液，洗涤拍干，将10mg/ml浓度的抗体梯度稀释后纵向逐孔加入100μl/孔，37℃反应1h，稀释梯度为1:1w、1:2w、1:4w、1:8w、1:16w、1:32w、1:64w；
87.弃反应液，洗涤拍干，加入羊抗兔酶标二抗，100μl/孔，37℃反应1h；
88.弃反应液，洗涤拍干，加tmb显色液，100μl/孔，37℃避光反应10min；
89.加入终止液2mol/l硫酸，50μl/孔，od450读数，测定反应效价，检测结果参见表4。
90.表4免疫效价检测结果
91.蛋白名称k42单体k42二聚体k4
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异聚体原核k42单体原核k42二聚体1号兔效价1：2w1：32w1：1w无反应无反应2号兔效价1：2w1：32w1：1w无反应无反应3号兔效价1：2w1：16w1：1w无反应无反应
4号兔效价1：1w1：16w1：1w无反应无反应5号兔效价1：1w1：16w无反应无反应无反应
92.通过表4可知，原核重组表达的蛋白免疫动物获得的抗体与人源蛋白无反应，酵母重组表达的蛋白免疫动物获得的抗体与人源蛋白有反应，且k42二聚体免疫效价最高。
93.虽然本发明披露如上，但本发明并非限定于此。任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种更动与修改，因此本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。

技术特征：
1.一种重组lp(a)，其特征在于，所述重组lp(a)的氨基酸序列如seq id no.1或seq id no.2或seq id no.3所示。2.一种如权利要求1所述的重组lp(a)的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如seq id no.4或seq id no.5或seq id no.6所示。3.一种重组表达载体，其特征在于，包含权利要求2所述的重组lp(a)的基因。4.一种lp(a)抗原，其特征在于，采用权利要求1所述的重组lp(a)制备得到。5.一种重组lp(a)抗体，其特征在于，采用权利要求1所述的重组lp(a)制备得到。6.一种lp(a)检测标准品，其特征在于，包含权利要求1所述的重组lp(a)。7.一种检测试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的重组lp(a)或权利要求6所述的lp(a)检测标准品。8.一种重组lp(a)的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：s10：构建重组lp(a)质粒：优化lp(a)的氨基酸序列，优化后的氨基酸序列如seq id no.1或seq id no.2或seq id no.3所示，按照酵母偏好密码子，对所述优化后的氨基酸序列所对应的基因序列进行基因优化并合成克隆至ppiczalphaa载体，获得所述重组lp(a)质粒；s20：所述重组lp(a)质粒的转化：将所述重组lp(a)质粒进行线性化，将线性化后的重组lp(a)质粒转化至酵母gs115感受态细胞，获得重组酵母转化子；s30：将所述重组酵母转化子接种于含有g418的ypd平板上，筛选得到高拷贝转化子，获得重组高拷贝菌株；s40：将所述重组高拷贝菌株依次接种至bmgy培养基和bmmy培养基，经甲醇诱导表达，离心，收集上清液，得到重组蛋白溶液；s50：检测所述重组蛋白溶液中各单菌落的表达量，选取表达量最高的菌落进行划线接种，放大诱导表达，离心，收集上清液；s60：采用ni柱对所述s50得到的上清液进行纯化，得到所述重组lp(a)。

技术总结
本发明提供了一种重组Lp(a)及其基因和制备方法、重组Lp(a)抗体，重组Lp(a)的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。本发明解决了现有Lp(a)成本昂贵且来源有限的技术问题，通过重组Lp(a)代替人源Lp(a)，实现了降低Lp(a)成本，且容易获得的技术效果。效果。效果。


技术研发人员：卓越 王民燕 徐海燕 金照海
受保护的技术使用者：宁波赛珀生物技术有限公司
技术研发日：2023.05.16
技术公布日：2023/8/24