CHRDL1基因敲入小鼠模型及其构建方法

chrdl1基因敲入小鼠模型及其构建方法
技术领域
1.本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及一种chrdl1基因敲入小鼠模型及其构建方法。


背景技术：

2.鸡脊索生成素样蛋白1(chordin-like 1，chrdl1)是一种具有重复半胱氨酸丰富结构域的分泌糖蛋白，可与骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins,bmps)家族配体竞争性结合，抑制其与受体结合发挥功能。chrdl1在人体内多个器官广泛分布，主要存在于中枢神经系统、视网膜、甲状腺、心脏、肺部、结直肠、生殖器等的多种细胞类型中。chrdl1蛋白是一种多功能蛋白质，具有促进神经元发育，调节体内免疫反应、促进血管生成、调控骨软骨生成、调控癌症发生等作用。因此chrdl1在运动系统疾病、免疫系统疾病、癌症治疗等多个方面有着广阔的应用前景。
3.chrdl1在国内外的研究还比较有限，暂时还没有人研究过生产chrdl1蛋白的方法。先前人们常用哺乳动物细胞、昆虫细胞培养或微生物发酵等传统方法来表达某种蛋白，但这类方法一般存在蛋白表达量较低、生产成本较高或纯化过程复杂等缺点，很难实现大规模的工业化生产。
4.因此，为了日后能够实现大规模生产，有必要开发一种利用crispr/cas9制备高表达人chrdl1蛋白转基因鼠及其方法。


技术实现要素：

5.本发明目的是提供一种chrdl1基因敲入小鼠模型及其构建方法，该方法基因编辑效率高、该转基因鼠可高表达人chrdl1蛋白。
6.在本发明的第一方面，提供了chrdl1基因敲入小鼠的打靶载体，所述打靶载体的核苷酸序列如seq id no.1所示。
7.进一步地，所述打靶载体包含核苷酸序列如seq id no.2所示的dna片段结构cag pr-loxp-stop-loxp-ege-zk-037cds-wpre-pa，其中，所述cag为启动子，所述pr-loxp-stop-loxp为调控元件；ege-zk-037cds-wpre-pa为表达元件，且包含zk-037cds的5’端和3’端的同源臂。
8.在本发明的第二方面，提供了一种chrdl1基因敲入小鼠模型的构建方法，所述方法包括：
9.将sgrna12体外转录成mrna，获得活性的sgrna12，所述sgrna12的核苷酸序列如seq id no.3所示；
10.获得有活性的cas9 mrna，所述cas9核苷酸序列如seq id no.4所示；
11.将所述有活性的sgrna12、cas9 mrna和核苷酸序列如seq id no.1所示的打靶载体混合后显微注射到小鼠受精卵中，获得f0代小鼠；
12.选择f0代小鼠基因型鉴定结果中的f0代阳性小鼠，使其与野生型小鼠进行交配，
从而获得具有稳定基因型的f1代小鼠；后筛选出发生正确重组的基因打靶小鼠，即获得chrdl1基因敲入模式小鼠。
13.在本发明的第三方面，提供了一种用于构建人源性chrdl1转基因小鼠模型的成套核酸分子，所述成套核酸分子包括：
14.(a)编码grna的核苷酸序列，如seq id no.3所示；
15.(b)编码cas9的核苷酸序列，如seq id no.4所示；
16.(c)核苷酸序列如seq id no.1所示的打靶载体。
17.在本发明的第四方面，提供了采用所述的方法获得的chrdl1基因敲入小鼠模型。
18.在本发明的第五方面，提供了所述的chrdl1基因敲入小鼠模型在制备过表达人源性chrdl1蛋白或者筛选药物中的应用。
19.本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
20.本发明制备得到的小鼠模型，可将基因敲进效率提高近20倍、且快速、便捷，提高了成功率，节约了成本，缩短了周期，更有利于工业化及大规模的商业应用。经检测chrdl1在chrdl1基因敲入小鼠模型的视网膜中成功过表达。
附图说明
21.为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
22.图1为chrdl1(ege-zk-037)基因；
23.图2为打靶载体示意图；
24.图3为southern blot筛选策略；
25.图4为pcs(puro)载体图谱；
26.图5为sg12 rna电泳图；左边的泳道为阴性对照组，右边的泳道为sg12 rna；
27.图6为cas9/sgrna活性检测结果；其中con为阴性对照组，pc为阳性质粒对照组，sg1-sg18分别代表设计的18条sgrna，blank为空白对照组；
28.图7为打靶载体图谱；
29.图8为打靶载体酶切鉴定图；
30.图9为f0代小鼠鼠尾基因型鉴定部分结果电泳图；
31.图10为f1代小鼠基因型鉴定结果；其中图10a的引物为“rosa-gt-new-l-f2/rosa-gt-new-l-r2”；图10b的引物为“wpre-f1/rosa-gt-new-r-r1”；其中，图10c的引物为“rosa-gt-f/rosa-gt-r”；图10d的引物为“rosa-gt-f/rosa26-test(l)-r3”；图10e为鉴定原理；
32.图11为f1代阳性同源重组小鼠southern blot检测结果；
33.图12为实施例2的结果，其中图12a为pcr扩增技术及凝胶电泳技术鉴定小鼠基因型结果，12b为qrt-pcr检测两组小鼠视网膜的chrdl1 mrna含量的结果。
具体实施方式
34.下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果
将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
35.在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
36.除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买获得或者可通过现有方法获得。
37.术语解释
38.wild type allele(wt)：即野生型小鼠；
39.targeted allele：即通过受精卵注射得到阳性小鼠，或者f0代阳性小鼠与野生型小鼠交配获得的f1代阳性杂合子小鼠。
40.1ek37-15：指小鼠的编号，编号原则为：1，指f1代；ek37，指本课题编号的缩写；-15，指剪尾编号
41.为解决上述技术问题，本发明技术方案的总体思路如下：
42.rosa26-cag-lsl-ege-zy-037基因敲进小鼠模型的设计方案
43.1、chrdl1(ege-zk-037)基因在x染色体反向链上，全长122.2kb。gene id((ncbi)：91851，ege-zk-037基因有5个转录本。
44.2、根据rosa26基因的特点，我们选择在chrdl1基因的rosa26位点插入cag pr-loxp-stop-loxp-ege-zk-037cds-wpre-pa(如图2所示)。sgrna被设计在插入位置周围。
45.rosa26基因敲入的打靶载体主要包括以下功能元件：cag启动子；loxp-stop-loxp调控原件；ege-zk-037cds-wpre-pa表达元件；5’端和3’端的同源臂均约为2kb；
46.3、southern blot鉴定策略：为了验证f1小鼠重组的正确性，我们采用southern blot，并同时利用5’probe-2和wpre(3')probe进行验证。具体设计如下：5’probe-2用于检测基因重组的发生。若发生正确重组，将会出现野生型和突变型两个条带；若未正确重组，将只会出现野生型条带。wpre(3')probe用于检测是否含有随机插入，若发生正确重组，将只会出现目的条带；若存在随机插入，将会出现多条带。
47.下面将结合实施例及实验数据对本技术的一种人源性chrdl1转基因小鼠模型的构建方法进行详细说明。
48.实施例1、chrdl1基因敲入小鼠模型的构建
49.1、靶序列的测序确认；
50.不同品系，靶基因序列可能有所差异。为了保证所设计的sgrna的效率，首先需要对c57bl/6n小鼠尾靶位点序列进行pcr扩增并测序验证，以确认sgrna识别序列与c57bl/6n鼠尾dna序列完全一致。pcr引物的核苷酸序列如表1所示：
51.表1
52.53.对c57bl/6n鼠尾dna进行pcr扩增及测序验证，结果证明c57bl/6n鼠尾靶序列与genebank和ensembl所给序列完全一致。
54.2、cas9/sgrna质粒的设计及构建；
55.2.1、cas9/sgrna质粒的设计；
56.基于sgrna的设计原则，在靶位点区域共设计18条sgrna，即sgrna1～sgrna18。该18条sgrna对应的oligo序列如表2所示：
57.表2
[0058]5’
guidescore序列(5
’‑3’
)guide#185actggagttgcagatcacgagggguide#281ggcaggcttaaaggctaacctggguide#381gtcctgcaggggaattgaacaggguide#472aagatgggcgggagtcttctgggguide#571gtgtgtgggcgttgtcctgcaggguide#671tgggcgggagtcttctgggcaggguide#767cgcccatcttctagaaagactggguide#864caggacaacgcccacacaccaggguide#962gttgcagatcacgagggaagaggguide#1062tctgaggaccgccctgggcctggguide#1161cagggcggtcctcagaagccaggguide#1288aaggccgcacccttctccggaggguide#1376acccttctccggaggggggagggguide#1473gagctgcagtggagtaggcggggguide#1589gctctgagttgttatcagtaaggguide#1689cctcgatggaaaatactccgguide#1777tgggaggataggtagtcatctggguide#1871cgacaaaaccgaaaatctgtggg
[0059]
2.2、cas9/sgrna质粒的构建；
[0060]
按照上述已设计的18条sgrna序列合成相应引物，退火聚合后通过gibson assembly的方式分别连入如图4所示的pcs(puro)载体，连接产物分别转化后送样测序验证正确，从而构建出18个cas9/sgrna质粒。
[0061]
3、cas9/sgrna的活性检测采用一种自主研发的crispr/cas9活性检测方法-ucatm方式进行。其具有无物种限制，高通量，适应性广，灵敏度高，简便性等优点。综合选择sgrna12进行下一步实验，检测结果如图5和表3所示。
[0062]
表3
[0063]
[0064][0065]
对18个构建好的cas9/sgrna质粒进行活性检测后，得出如图9所示的检测结果。从图5中可以看出，第12个的cas9/sgrna质粒的的活性和特异性明显优于其他17个cas9/sgrna质粒的活性和特异性，因此综合选择这个cas9/sgrna质粒所对应的sgrna12进行下一个步骤；
[0066]
4、sgrna的显微注射rna的制备
[0067]
先将sgrna12的序列连入带t7启动子的pt7-4g质粒载体上，然后将质粒测序验证正确后，使用通用扩增引物进行扩增t7启动子及sgrna核苷酸序列，最后以该pcr产物为模板进行体外转录，得到sgrna112的显微注射rna；
[0068]
并且其制备时反应条件为65℃下反应5min，rna电泳图如图6所示，图6表示sgrna12在所需浓度下成功转录。
[0069]
5、打靶载体的构建；
[0070]
首先根据设计好的打靶方案，设计引物，构建打靶载体，所述打靶载体的图谱如图7所示，构建方法具体为：
[0071]
确认靶序列，设计引物(序列见表1)。
[0072]
将seq id no.2所示的dna片段结构连入ege载体(购自百奥赛图)中，得到打靶载体，所述打靶载体的核苷酸序列如seq id no.1所示。
[0073]
所述打靶载体包含核苷酸序列如seq id no.2所示的dna片段结构cag pr-loxp-stop-loxp-ege-zk-037cds-wpre-pa，其中，所述cag为启动子，所述pr-loxp-stop-loxp为调控元件；ege-zk-037cds-wpre-pa 为表达元件，且包含zk-037cds的5’端和3’端的同源臂，同时wpre包含12bp的酶切位点序列，wpre和pa之间有17bp的酶切位点序列，酶切位点用于后续的southern blot鉴定；
[0074]
然后将得到的打靶载体再通过酶切鉴定和测序，从而确认打靶载体构建完成；打靶载体酶切鉴定和测序的结果如图8所示，表明打靶载体构建成功。
[0075]
6、f0代小鼠的制备；
[0076]
将cas9、sgrna的显微注射rna及打靶载体显微注射到小鼠受精卵中，注射后出生小鼠记为f0代。
[0077]
7、f0代小鼠基因型检测：
[0078]
本发明采用cas9/sgrna注射受精卵的方法构建基因敲入小鼠；由于胚胎早期卵裂速度很快，因此得到的f0代小鼠为嵌合体；故以f0代小鼠鼠尾进行鉴定得到的f0基因型仅供参考，不能代表其一定为可遗传的基因突变型，可遗传的基因型需待f1代小鼠鼠尾检测后确定。
[0079]
7.1、按照如图4所示的pcr引物设计原则，设计f0代小鼠基因型鉴定引物。其pcr引物的核苷酸序列如表4所示：
[0080]
7.2、对f0代小鼠鼠尾基因型进行鉴定，部分鉴定结果如图9所示。
[0081]
结论：通过pcr产物和测序表明，ek37-3，ek37-5和ek37-39为阳性f0代小鼠。
[0082]
8、f1代小鼠的制备；
[0083]
选择f0代小鼠鼠尾基因型鉴定结果中阳性小鼠与c57bl/6n野生型小鼠交配获得具有稳定基因型的f1代小鼠，交配方案表4所示：
[0084]
表4
[0085][0086]
9、f1代小鼠基因型及southern blot鉴定；
[0087]
9.1、f1代小鼠基因型鉴定；
[0088]
其pcr引物设计原则、pcr引物信息以及pcr条件与f0代小鼠基因型鉴定的条件相同。部分鉴定结果如图10所示。
[0089]
结论：通过pcr鉴定和点突变位点测序结果表明，1ek37-15，1ek37-17，1ek37-20，1ek37-22和1ek37-23为f1代pcr阳性小鼠。
[0090]
9.2、f1代阳性同源重组小鼠southern blot检测；
[0091]
提取上述pcr鉴定为阳性的f1代小鼠鼠尾dna进行southern blot检测及测序，检测结果如图11所示。检测结果表明：1ek37-15，1ek37-17，1ek37-20，1ek37-22和1ek37-23为正确重组，且没有随机插入。
[0092]
实施例2、实施例1所得的chrdl1基因敲入小鼠模型在制备过表达人源性chrdl1蛋白中的应用。
[0093]
1、实施例1制备得到在视网膜过表达chrdl1的转基因小鼠(loxp为278bp，six3-cre为480bp，野生型gt为469bp)，gt引物序列为
[0094]
rosa-gt-f:agtcgctctgagttgttatcag；
[0095]
rosa-gt-r:tgagcatgtctttaatctacctcgatg；
[0096]
使用pcr扩增技术及凝胶电泳技术鉴定小鼠基因型(图12a)；突变型等位基因由于chrdl1过表达序列插入在gt引物对应位点之间，gt无法扩增出条带，因此引物gt用于鉴定野生型等位基因的存在。
[0097]
结果如图12a所示，图中contorl代表未敲入的小鼠，chrdl1six3-ki代表chrdl1基因敲入纯合小鼠，chrdl1s3-ki(+/-)代表chrdl1基因敲入杂合小鼠，结果显示电泳条带符合预期。
[0098]
2、在p0.5天和p90天分别取同窝不同基因型的小鼠(实施例1所得的chrdl1基因敲入小鼠简称chrdl1
six3-ki
小鼠，对照组为未敲入的小鼠)的视网膜组织裂解及基因组rna，反转录为cdna进行qrt-pcr检测两组小鼠视网膜的chrdl1 mrna含量，qrt-pcr所用的引物序列为：
[0099]
rosa-gt-new-l-f2：gagctctgggcgaaaaatgagttgc；
[0100]
rosa-gt-new-l-r2：tgggctatgaactaatgaccccgta；
[0101]
实验结果如图12b所示，可知与对照组相比，chrdl1
six3-ki
小鼠chrdl1的含量显著
上调，即chrdl1在视网膜成功过表达(图12b)。
[0102]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
[0103]
最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
[0104]
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
[0105]
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

技术特征：
1.chrdl1基因敲入小鼠的打靶载体，其特征在于，所述打靶载体的核苷酸序列如seq id no.1所示。2.根据权利要求1所述的chrdl1基因敲入小鼠的打靶载体，其特征在于，所述打靶载体包含核苷酸序列如seq id no.2所示的dna片段结构cag pr-loxp-stop-loxp-ege-zk-037cds-wpre-pa，其中，所述cag为启动子，所述pr-loxp-stop-loxp为调控元件；ege-zk-037cds-wpre-pa为表达元件，且包含zk-037cds的5’端和3’端的同源臂。3.一种chrdl1基因敲入小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述方法包括：将sgrna12体外转录成mrna，获得活性的sgrna12，所述sgrna12的核苷酸序列如seq id no.3所示；获得有活性的cas9 mrna，所述cas9核苷酸序列如seq id no.4所示；将所述有活性的sgrna12、cas9 mrna和核苷酸序列如seq id no.1所示的打靶载体混合后显微注射到小鼠受精卵中，获得f0代小鼠；选择f0代小鼠基因型鉴定结果中的f0代阳性小鼠，使其与野生型小鼠进行交配，从而获得具有稳定基因型的f1代小鼠；后筛选出发生正确重组的基因打靶小鼠，即获得chrdl1基因敲入模式小鼠。4.一种采用权利要求3所述的方法获得的chrdl1基因敲入小鼠模型。5.权利要求4所述的chrdl1基因敲入小鼠模型在制备过表达人源性chrdl1蛋白或者筛选药物中的应用。6.一种用于构建chrdl1基因敲入小鼠模型的成套核酸分子，其特征在于，所述成套核酸分子包括：(a)编码grna的核苷酸序列，如seq id no.3所示；(b)编码cas9的核苷酸序列，如seq id no.4所示；(c)权利要求1所述的打靶载体。

技术总结
本发明提供了一种CHRDL1基因敲入小鼠模型及其构建方法，所述方法包括：获得活性的sgRNA12，所述sgRNA12的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；获得有活性的Cas9mRNA，所述Cas9核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；将所述有活性的sgRNA12、Cas9mRNA和核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的打靶载体混合后显微注射到小鼠受精卵中，获得F0代小鼠；选择F0代阳性小鼠与野生型小鼠进行交配，从而获得具有稳定基因型的F1代小鼠；后筛选获得CHRDL1基因敲入模式小鼠。该方法基因编辑效率高、该转基因鼠可高表达人CHRDL1蛋白。CHRDL1蛋白。CHRDL1蛋白。


技术研发人员：沈吟 刘冬梅
受保护的技术使用者：武汉大学
技术研发日：2023.05.15
技术公布日：2023/9/5