ERV及其下游信号通路蛋白作为神经元衰老标志物及其在干扰神经元衰老中的应用的制作方法

erv及其下游信号通路蛋白作为神经元衰老标志物及其在干扰神经元衰老中的应用
技术领域
1.本发明属于生物医学领域，涉及erv及其下游信号通路蛋白作为神经元衰老标志物及其在干扰神经元衰老中的应用，尤其涉及评价或辅助评价额叶神经元衰老的标志物及其在延缓额叶衰老中的应用，具体涉及以lmnb1和lmnb2作为干预靶点抑制erv或cgas通路的激活干预人类神经元衰老，还涉及反转录酶抑制剂阿巴卡韦干预灵长类神经元衰老的应用。


背景技术：

2.灵长类动物大脑的额叶(fl)进化为控制执行功能，如计划和解决问题，以及认知技能，包括注意力、记忆形成和同理心。额叶是随着年龄增长体积减少最多的脑区之一，其神经解剖学和神经生理学变化是额颞叶痴呆和阿尔茨海默病(ad)发展的基础。然而，认知老化可能在老年人神经退行性疾病诊断前几年就已经发生了，这对早期诊断和治疗发展提出了挑战。在fl的灰质中，以及嵌入白质中的数十亿个高度互连和功能多样的神经元和大量神经胶质细胞和其他非神经元细胞构成了一个巨大的异质性细胞群。此外，越来越多的研究报告称，广泛而复杂的细胞结构和功能改变与fl衰老和神经元变性有关。再加上表观遗传学、转录和翻译水平上涉及的调节因子的多样性，对fl衰老的细胞和分子驱动因素的理解仍然非常有限，尤其是在灵长类动物中。因此，深入了解与fl衰老相关的细胞和分子变化、寻找fl细胞衰老的关键因子及干预方式具有重要的科学和临床意义。


技术实现要素：

3.本发明的目的是提供erv及其下游信号通路蛋白作为神经元衰老标志物及其在干扰神经元衰老中的应用。
4.第一方面，本发明提供了检测erv激活或/和其激活的下游cgas-sting天然免疫信号通路相关蛋白表达量的物质在如下a1-a6中的应用：
5.a1)检测额叶的衰老程度；
6.a2)检测神经元的衰老程度；
7.a3)评估或预测额叶功能退行或衰老导致的相关疾病；
8.a4)制备检测额叶衰老程度的产品；
9.a5)制备检测神经元衰老程度的产品；
10.a6)制备评估或预测额叶功能退行或衰老导致的相关疾病的产品；
11.上述应用中，所述erv激活通过如下至少一种体现：erv的dna甲基化水平、erv的rna表达水平、erv-env的表达量、erv基因组dna含量和erv样颗粒(rvlp)含量；
12.所述erv激活的下游cgas-sting天然免疫信号通路相关蛋白表达量通过如下至少一种体现：cgas在细胞质erv dna上富集量、2
’3’‑
cgamp含量和p-tbk1表达量。
13.上述应用中，所述额叶或神经元来源于人或灵长类动物。在本发明的实施例中，灵
长类动物以食蟹猴为例。
14.上述额叶衰老或退行引发疾病具体如阿尔茨海默病等。
15.上述应用的检测对象可以为额叶组织或其匀浆、体外培养或长期培养的人神经元、人脑脊液或长期培养的人神经元上清液。
16.上述额叶组织可为从哺乳动物或人分离的额叶组织样本或额叶组织的石蜡切片或额叶组织的冰冻切片。
17.上文所述应用中，所述检测erv激活或/和其激活的下游cgas-sting天然免疫信号通路相关蛋白表达量的物质为如下至少一种：
18.b1、检测erv的dna甲基化水平的物质；该物质具体为wgbs建库和测序所需试剂，在本发明的实施例中包括ez-dna甲基化金试剂盒(zymo research)。
19.b2、检测erv的rna表达水平的物质；该物质具体为bulk rna-seq建库和测序所需试剂，在本发明的实施例中包括ultratm rna文库制备试剂盒(neb,usa)。
20.b3、检测erv-env的表达量的物质；该物质具体为特异结合erv-env的物质，在本发明的实施例中，具体为免疫荧光染色或酶联免疫吸附试验(简称为elisa)所需试剂，包括食蟹猴检测采用erv-env兔抗ervw-1或人检测采用鼠抗hervk-env抗体或hervk-env elisa试剂盒。
21.b4、检测erv基因组dna含量的物质；该物质具体为特异结合erv基因组的物质，在本发明的实施例中，包括用于扩增erv区域的qpcr引物，如cyerv#1。
22.b5、检测erv样颗粒(rvlp)含量的物质；该物质具体为常规电镜观察或免疫胶体金电镜所需试剂，在本发明的实施例中为透射电子显微镜，或免疫透射电镜和特异结合erv-env的物质，其中，特异结合erv-env的物质包括鼠抗hervk-env抗体。
23.b6、检测cgas在细胞质erv dna上富集量的物质；该物质具体为特异结合cgas蛋白和erv dna序列的物质；在本发明的实施例中具体为免疫共沉淀-荧光定量pcr实验所需试剂，其中特异结合cgas蛋白的物质具体为免疫共沉淀所需试剂，包括兔抗cgas(d1d3g)，特异结合erv dna序列的物质具体为qpcr的引物，为引物herv或cyerv#2。
24.b7、检测2
’3’‑
cgamp含量的物质；该物质具体为特异结合2
’3’‑
cgamp的物质，在本发明的实施例中，具体为酶联免疫吸附试验(简称为elisa)所需试剂，包括2
’3’‑
cgamp elisa试剂盒。
25.b8、检测p-tbk1表达量的物质；该物质具体为特异结合p-tbk1的物质，在本发明的实施例中，具体为免疫荧光染色所需试剂，具体为兔抗p-tbk1(兔抗phospho-tbk1/nak(ser172))。
26.第二方面，本发明提供了一种产品，其包括第一方面中所述检测erv激活或/和其激活的下游cgas-sting天然免疫信号通路相关蛋白表达量的物质；
27.所述产品具有如下至少一种功能：
28.a1)检测额叶的衰老程度；
29.a2)检测神经元的衰老程度；
30.a3)评估或预测额叶功能退行或衰老导致的相关疾病。
31.上述产品还包括记载如下至少一种方法的可读载体：
32.1)所示的方法包括如下步骤：检测待测额叶组织或体外培养神经元的erv的dna甲
基化水平，erv的dna甲基化水平低的待测额叶组织或神经元的衰老程度大于或候选大于erv的dna甲基化水平高的待测额叶组织或神经元；
33.2)所示的方法包括如下步骤：检测待测额叶组织或体外培养神经元的erv的rna表达水平，erv的rna表达水平高的待测额叶组织或神经元的衰老程度大于或候选大于erv的rna表达水平低的待测额叶组织或神经元；
34.3)所示的方法包括如下步骤：检测待测额叶组织或体外培养神经元或脑脊液或神经元培养上清液的erv-env的表达量，erv-env的表达量高的待测额叶组织或神经元的衰老程度大于或候选大于erv-env的表达量低的待测额叶组织或神经元；
35.4)所示的方法包括如下步骤：检测待测额叶组织或体外培养神经元的erv基因组dna含量，erv基因组dna含量高的待测额叶组织或神经元的衰老程度大于或候选大于erv基因组dna含量低的待测额叶组织或神经元；
36.5)所示的方法包括如下步骤：检测待测额叶组织或体外培养的神经元中rvlp含量，rvlp含量高(每个细胞中rvlp的数目或单位面积rvlp的数目高)的待测额叶组织或神经元的衰老程度大于或候选大于rvlp含量低(每个细胞中rvlp的数目或单位面积rvlp的数目低)的待测额叶组织或神经元；
37.6)所示的方法包括如下步骤：检测待测额叶或体外培养神经元细胞质erv dna上cgas的富集量，细胞质erv dna上cgas富集量高的待测额叶组织或神经元的衰老程度大于或候选大于细胞质erv dna上cgas富集量低的待测额叶组织或神经元；
38.7)所示的方法包括如下步骤：检测待测额叶匀浆、脑脊液或人神经元培养上清液中2
’3’‑
cgamp含量，2
’3’‑
cgamp含量高的待测额叶组织或神经元的衰老程度大于或候选大于2
’3’‑
cgamp含量低的待测额叶组织或神经元；
39.8)所示的方法包括如下步骤：检测待测额叶或体外培养的神经元中p-tbk1表达量，p-tbk1表达量高的待测额叶组织或神经元的衰老程度大于或候选大于p-tbk1表达量低的待测额叶组织或神经元。
40.第三方面，本发明提供了erv或/和其激活的下游cgas-sting天然免疫信号通路相关蛋白表达的抑制剂在如下至少一种中的应用：
41.c1、制备治疗额叶衰老或退行引发疾病的产品；上述中，所述额叶衰老或退行引发疾病具体如阿尔茨海默病等；
42.c2、制备延缓额叶或神经元衰老的产品；上述延缓神经元衰老具体体现在培养的人神经元的rela蛋白或其转录本表达量降低、炎症因子il6蛋白或其转录本表达水平降低、β半乳糖苷酶活性降低、β-amyloid(简称为aβ)(4g8)蛋白或其转录本表达量降低、和/或aggresome表达量降低；上述延缓额叶衰老具体体现在降低p-tbk1表达量、β-amyloid(简称为aβ)(4g8)蛋白或其转录本表达量降低和/或aggresome表达量降低。
43.c3、制备延缓神经元细胞炎症的产品；
44.c4、制备降低神经元的炎症因子表达的产物。在本发明的实施例中所述炎症因子包括il6，il8，ifng和/或il1b，具体体现在降低神经元的炎症因子l6、il8和/或ifng表达量。
45.上文所述应用中，所述抑制剂为抑制erv活性的药物或sirna，或/和抑制erv激活的下游cgas-sting天然免疫信号通路相关蛋白表达的sirna；
46.进一步地，所述抑制erv活性的药物为反转录酶抑制剂；在本发明的实施例中，所述反转录酶抑制剂具体为阿巴卡韦。
47.所述抑制erv活性的sirna如表4所示sirna-erv；
48.所述抑制erv激活的下游cgas-sting天然免疫信号通路相关蛋白表达的sirna具体为抑制cgas或sting的sirna，具体如表4所示的sirna-cgas或sirna-sting；
49.所述应用中关于在神经元中使用sirna介导的敲低实验是在lmnb1和lmnb2敲低的细胞模型中进行的，模拟erv激活。
50.所述应用中关于在神经元中补充阿巴卡韦实验是在长期培养细胞模型以及lmnb1和lmnb2敲低细胞模型中进行的，这两种细胞模型均可模拟erv激活。
51.第四方面，本发明提供了激活erv的激活剂在如下至少一种中的应用：
52.d1、制备加速额叶衰老或退行疾病的产品；上述中，所述额叶衰老或退行疾病具体如阿尔茨海默病等；
53.d2、制备加速额叶或神经元衰老的产品；上述加速额叶或神经元衰老具体体现在敲低lmnb1和lmnb2的人神经元使h3k9me3表达量降低(具体为在h3k9me3的荧光强度显著降低)、erv激活、天然免疫反应激活、β半乳糖苷酶活性显著增加、aβ(1-40)蛋白表达量或aggresome表达量增加。
54.d3、制备诱导神经元天然免疫反应激活的产品；
55.上文所述erv激活体现在erv-env的荧光强度显著增加和/或rvlp含量显著增加。
56.上文所述天然免疫反应激活具体为cgas-sting天然免疫信号通路激活。在本发明的实施例中，上述神经元天然免疫反应激活具体通过细胞质erv dna上cgas富集量增加，2
’3’‑
cgamp蛋白表达量增加，p-tbk1阳性细胞增加，rela荧光强度增加或bulk rna-seq上调基因炎症通路富集体现；
57.d4、制备增加神经元的炎症因子表达量的产品。在本发明的实施例中，体现在增加神经元的炎症因子il6表达量。
58.上述激活erv的激活剂具体为抑制lmnb1和lmnb2表达的物质，在本发明的实施例中为表4中的sirna-lmnb1和sirna-lmnb2。
59.本发明还可以提供一种鉴定或辅助鉴定待测额叶或神经元衰老程度的方法。
60.本发明提供的方法，为如下1)-8)中至少一种：
61.1)所示的方法包括如下步骤：检测待测额叶组织或体外培养神经元的erv的dna甲基化水平，erv的dna甲基化水平低的待测额叶组织或神经元的衰老程度大于或候选大于erv的dna甲基化水平高的待测额叶组织或神经元；
62.2)所示的方法包括如下步骤：检测待测额叶组织或体外培养神经元的erv的rna表达水平，erv的rna表达水平高的待测额叶组织或神经元的衰老程度大于或候选大于erv的rna表达水平低的待测额叶组织或神经元；
63.3)所示的方法包括如下步骤：检测待测额叶组织或体外培养神经元或脑脊液或神经元培养上清液的erv-env的表达量，erv-env的表达量高的待测额叶组织或神经元的衰老程度大于或候选大于erv-env的表达量低的待测额叶组织或神经元；
64.4)所示的方法包括如下步骤：检测待测额叶组织或体外培养神经元的erv基因组dna含量，erv基因组dna含量高的待测额叶组织或神经元的衰老程度大于或候选大于erv基
因组dna含量低的待测额叶组织或神经元；
65.5)所示的方法包括如下步骤：检测待测额叶组织或体外培养的神经元中rvlp含量，rvlp含量高(每个细胞中rvlp的数目或单位面积rvlp的数目高)的待测额叶组织或神经元的衰老程度大于或候选大于rvlp含量低(每个细胞中rvlp的数目或单位面积rvlp的数目低)的待测额叶组织或神经元；
66.6)所示的方法包括如下步骤：检测待测额叶或体外培养神经元细胞质erv dna上cgas的富集量，细胞质erv dna上cgas富集量高的待测额叶组织或神经元的衰老程度大于或候选大于细胞质erv dna上cgas富集量低的待测额叶组织或神经元；
67.7)所示的方法包括如下步骤：检测待测额叶匀浆、脑脊液或人神经元培养上清液中2
’3’‑
cgamp含量，2
’3’‑
cgamp含量高的待测额叶组织或神经元的衰老程度大于或候选大于2
’3’‑
cgamp含量低的待测额叶组织或神经元；
68.8)所示的方法包括如下步骤：检测待测额叶或体外培养的神经元中p-tbk1表达量，p-tbk1表达量高的待测额叶组织或神经元的衰老程度大于或候选大于p-tbk1表达量低的待测额叶组织或神经元。
69.上文中，所述大于为统计学上的大于。
70.本发明中名称解释如下：
71.erv：内源性逆转录病毒(endogenous retrovirus,erv)属于长末端重复序列逆转录转座子，在进化过程中固定在基因组中，约占人类基因组的8％。hervk人-小鼠乳腺肿瘤病毒样-2(hml-2)亚组元件是最近整合的人类erv，包括编码病毒颗粒形成所需蛋白质的开放阅读框，包括gag、pol、env和pro；而属于erv1家族的ervw元件在非人灵长类中持续存在。
72.erv-env为erv的包膜蛋白；
73.rvlp为内源性逆转录病毒erv样颗粒；
74.erv激活的cgas-sting天然免疫信号通路包括cgas、2',3'-cgamp、sting、tbk1、rela和炎症因子(具体包括il6，il8，ifng，il1b)。
75.cgas(基因id:115004，更新于2023年4月10日)：又称胞质dna传感器，当感应到细胞质中的erv dna后，它能结合erv dna，用于体现细胞质中的erv dna的增加，进一步地其激活产生内源性第二信使2',3'-cgamp，2',3'-cgamp能够进一步激活下游sting、p-tbk1、rela和炎症因子(具体包括il6，il8，ifng，il1b)。
[0076]2’3’‑
cgamp：为cgas激活产生的内源性第二信使，cgas(cyclic gmp-amp synthase)被激活并催化atp和gtp合成2
′3′‑
cgamp。2',3'-cgamp以高亲和力结合sting，是干扰素-β(ifnβ)的有效诱导物。2',3'-cgamp是在哺乳动物细胞中为响应细胞质中的dna而产生。
[0077]
p-tbk1(基因id:29110，更新于2023年5月17日)：人磷酸化tank结合激酶1是tbk1的磷酸化形式，tbk1为sting的下游。p-tbk1是调控细胞抗病毒免疫的关键激酶，并进一步磷酸化转录因子irf3，使其入核，诱导下游干扰素的产生。tbk1是固有免疫细胞抗病毒信号通路的中心节点，如果其活性不受控制，可能导致自身免疫疾病和慢性炎症等疾病。
[0078]
rela(基因id:5970，更新于2023年4月20日)，为tbk1的下游。
[0079]
炎症因子具体包括il6，il8，ifng，il1b等；
[0080]
il6(基因id:3569，更新于2023年4月23日)
[0081]
il8(基因id:3576，更新于2023年4月17日)
[0082]
ifng(基因id:3458，更新于2023年4月23日)
[0083]
il1b(基因id:3553，更新于2023年4月20日)
[0084]
sa-β-gal(senescence associatedβgalactosidase):即衰老相关β半乳糖苷酶，是细胞溶酶体中的水解酶，sa-β-gal的活性在衰老的细胞中大幅增加，而它本身可以催化底物x-gal生成蓝色沉淀而被检测到。
[0085]
β-amyloid(4g8)(基因id:102120297，更新于2020年10月26日)
[0086]
aggresome:在哺乳动物细胞中，聚集蛋白可通过微管依赖性逆行转运而浓缩聚集沉积到核周部位，称为聚集体。聚集体是当泛素-蛋白酶体机制被易于聚集的蛋白淹没时形成的包涵体。通常，聚集体是对某些细胞应激(例如高热，病毒感染或暴露于活性氧)反应而形成的。聚集体似乎可以通过隔离有毒的聚集蛋白来提供细胞保护功能，并且还可以促进它们通过自噬最终从细胞中消除。在脑组织中聚集体通过将蛋白质集中在一个位置而具有神经保护功能，从而有助于通过自噬将其去除。
[0087]
本发明的发明人通过免疫荧光检测、qpcr检测、免疫共沉淀-荧光定量pcr检测、常规电镜检测、免疫胶体金电镜检测和elisa检测，发现erv-env、erv基因组dna含量、rvlp、细胞质erv dna上cgas的富集、2
’3’‑
cgamp和p-tbk1中的至少一个可以作为标志物区分衰老额叶组织和年轻额叶组织。利用上述标志物可以评估脑衰老相关疾病，还可以检测人类脑功能等。此外本发明的发明人提供了补充反转录酶抑制剂阿巴卡韦干预神经元衰老的应用，本发明具有重要的应用价值。
附图说明
[0088]
图1为全基因组dna甲基化测序(wgbs)分析鉴定衰老额叶组织erv的dna甲基化水平。
[0089]
图2为批量-rna测序(bulk rna-seq)分析鉴定衰老额叶组织和长期培养的人神经元erv的rna表达水平。
[0090]
图3为erv-env染色鉴定衰老额叶组织和长期培养的人神经元erv-env表达情况。
[0091]
图4为elisa鉴定老年人脑脊液和长期培养的人神经元上清液中erv-env表达情况。
[0092]
图5为qpcr鉴定衰老额叶组织erv的基因组dna含量情况。
[0093]
图6为常规电镜和免疫胶体金电镜鉴定衰老额叶组织rvlp含量和定位情况。
[0094]
图7为免疫共沉淀-荧光定量pcr鉴定衰老额叶和长期培养的人神经元中细胞质erv dna上cgas的富集情况。
[0095]
图8为elisa鉴定衰老额叶匀浆和老年人脑脊液以及长期培养的人神经元上清液中2
’3’‑
cgamp表达情况。
[0096]
图9为免疫荧光染色鉴定衰老额叶组织和长期培养的人神经元p-tbk1的表达情况。
[0097]
图10为生物信息分析衰老猴额叶组织lmnb1和lmnb2的mrna表达水平,以及免疫荧光染色鉴定衰老猴额叶组织lamin b1和lamin b2的表达情况。
[0098]
图11为免疫荧光染色鉴定长期培养的人神经元lamin b1和lamin b2的表达情况。
[0099]
图12为qpcr鉴定敲低lmnb1和lmnb2的神经元lmnb1和lmnb2的mrna表达水平，以及免疫荧光染色鉴定敲低lmnb1和lmnb2的神经元lamin b1和lamin b2的表达情况。
[0100]
图13为免疫荧光染色鉴定敲低lmnb1和lmnb2的神经元h3k9me3和erv-env的表达情况,以及常规电镜鉴定敲低lmnb1和lmnb2的神经元rvlp含量，以及免疫电镜鉴定敲低lmnb1和lmnb2的神经元rvlp含量。
[0101]
图14为免疫共沉淀-荧光定量pcr鉴定敲低lmnb1和lmnb2的神经元中细胞质erv dna上cgas的富集情况,elisa鉴定敲低lmnb1和lmnb2的神经元上清液中2
’3’‑
cgamp含量，免疫荧光染色鉴定敲低lmnb1和lmnb2的神经元p-tbk1和rela表达情况,以及bulk rna-seq分析敲低lmnb1和lmnb2的神经元上调基因炎症通路富集情况。
[0102]
图15为sa-β-gal染色鉴定敲低lmnb1和lmnb2的神经元β半乳糖苷酶活性,elisa鉴定敲低lmnb1和lmnb2的神经元上清液中aβ(1-40)含量，免疫荧光染色鉴定敲低lmnb1和lmnb2的神经元aggresome的表达情况,以及elisa鉴定敲低lmnb1和lmnb2的神经元上清液中il-6浓度。
[0103]
图16为qpcr鉴定敲低lmnb1和lmnb2的神经元中敲低erv或cgas或sting后erv或cgas或sting的mrna表达水平，以及免疫荧光染色鉴定敲低lmnb1和lmnb2的神经元中敲低erv或cgas或sting后erv-env或cgas或sting的表达情况。
[0104]
图17为免疫荧光染色鉴定敲低lmnb1和lmnb2的神经元中敲低erv或cgas或sting后rela的表达情况；qpcr鉴定敲低lmnb1和lmnb2的神经元中敲低erv或cgas或sting后il-6的mrna表达情况；sa-β-gal染色鉴定敲低lmnb1和lmnb2的神经元中敲低erv或cgas或sting后β半乳糖苷酶活性；免疫荧光染色鉴定敲低lmnb1和lmnb2的神经元中敲低erv或cgas或sting后aβ(4g8)和aggresome的表达情况。
[0105]
图18为qpcr鉴定补充阿巴卡韦的人神经元erv基因组dna含量情况。
[0106]
图19为qpcr鉴定补充阿巴卡韦的人神经元炎症因子表达情况。
[0107]
图20为免疫荧光染色鉴定口服阿巴卡韦治疗的小鼠额叶神经元中p-tbk1表达的情况。
[0108]
图21为免疫荧光染色鉴定补充阿巴卡韦的人神经元和口服阿巴卡韦治疗的小鼠额叶神经元中aβ(4g8)表达情况。
[0109]
图22为免疫荧光染色鉴定补充阿巴卡韦的人神经元和口服阿巴卡韦治疗的小鼠额叶神经元中aggresome表达情况。
具体实施方式
[0110]
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
[0111]
实验模型和研究参与者详细信息
[0112]
动物
[0113]
本研究中使用的nhp组织经中国科学院动物研究所机构动物护理和使用委员会批准。食蟹猴的使用程序是根据nhp伦理治疗原则进行的。这些动物得到了实验动物护理机构
的认证，并受到当地和联邦动物研究法律的约束。所有小鼠实验均遵循《涉及动物的研究伦理审批申请格式原则》，并事先获得中国科学院动物研究所机构动物护理和使用委员会的批准。原产于东南亚的8只幼猴(4-6岁，4只雌性和4只雄性)和8只老龄猴(18-21岁，4雌性和4雄性)在北京一家经过认证的灵长类动物研究中心(喜尔新生物资源)以12小时的光/暗周期在25℃下饲养。所有动物均以正常饮食喂养，并确认没有可能影响生理衰老过程的临床或实验史。从思沛福(北京)生物科技有限公司购买的18个月龄雄性c57bl/6j小鼠在中国科学院动物研究所的动物护理设施中进行饲养，并在12小时光/暗循环下，在通风的笼子中随意喂食标准实验室食物和水。小鼠被随机分配到实验组。
[0114]
人类参与者
[0115]
人类fl活检的获取和使用得到了首都医科大学天坛医院和首都医科大学宣武医院研究与伦理委员会的批准。经北京天坛医院首都医科大学研究伦理委员会批准采集人脑脊液样本。本研究中使用的fl活检和csf样本的捐献者(或其亲属)提供了书面知情同意书。在首都医科大学北京天坛医院和首都医科大学宣武医院对脑损伤或神经胶质瘤患者进行手术期间，采集了人fl活检。尸检时的正常人fl样本取自天津医科大学总医院(中国天津)。所有死后组织都是在死亡后4小时内获得的，在死亡前没有脑损伤或先前的神经系统疾病。神经病理学家对大脑切片进行的尸检组织病理学检查证实，没有任何病理改变与神经或神经精神疾病有关。本研究共从5名年轻人(16-32岁)和6名老年人(64-77岁)中采集了11份人类fl样本。首都医科大学北京天坛医院在诊断神经系统肿瘤疾病期间采集了人脑脊液(csf)样本。本研究中使用的六份csf样本分别来自三名年轻人(9-21岁)和三名老年人(53-60岁)。
[0116]
细胞培养
[0117]
h9人胚胎干细胞(wicell research institute)用人胚胎干干细胞培养基维持在小鼠胚胎成纤维细胞饲养细胞(mef)上。胚胎干细胞培养基含有80％的dmem/f12(invitrogen)、20％的敲除血清替代物(invitogen)、1％的非必需氨基酸(neaa)(invitlogen)、1％glutamax(invit罗格恩)、1％青霉素/链霉素(ps，invitrogn)、55μmβ-巯基乙醇(invitragen)和10ng/ml的人碱性成纤维细胞生长因子(bfgf，联合蛋白中心)。所有细胞的支原体污染检测结果均为阴性。
[0118]
人神经元细胞的获得：
[0119]
人神经干细胞(hnscs)从h9人胚胎干细胞hescs分化得到，具体为：hescs首先在mef细胞上培养，当它们达到20-40％汇合时，将细胞与含有50％高级dmem/f12(invitrogen)、50％神经基底培养基(invit罗格恩)、1
×
n2补充剂(invitroen)、1倍b27补充剂(inviterogen)，2mm glutamax、10ng/ml hlif(millipore)、2μm dorsomorphin(sigma-aldrich)、3μmsb431542(selleck)的nid-1培养基一起孵育，4μm chir99021(tocris)和0.1μm化合物e(millipore)。2天后，用nid-2培养基(不含dorsomorphin的nid-1)代替培养基，并将细胞再培养5天。然后用accumax(millipore)将培养物解离成单细胞，转移到matrigel包被的平板上，并在神经祖细胞维持培养基(50％高级dmem/f12、50％神经基础培养基、1
×
n2补充物、1
×
b27补充物、2mm glutamax、10ng/ml hlif、2μm sb431542和3μm chir99021)中维持，得到hnscs。
[0120]
hnscs(24孔板每孔3
×
104个细胞，6孔板每孔1.2
×
105个细胞)在matrigel包被的
板上培养3天，然后将细胞移到如下sdnm培养基诱导培养：含有高级dmem/f12(invitrogen)、1
×
n2补充物、1
×
b27补充物、200μm抗坏血酸(sigma)、400μm dbcamp(sigma，10ng/ml gdnf(peprotech)和10ng/ml bdnf(pepro tech)；诱导培养2天，再将10mg/ml的层粘连蛋白laminin(sigma)加入培养基中以稳定神经元分化。在用于进一步的实验之前，将细胞在sdnm培养基中维持至少14天，得到人神经元细胞。对于长期培养，每3天用培养基换液一次，直到在相应的时间点收集。
[0121]
人神经元细胞的培养：将上述获得的神经元细胞在sdnm培养基中培养。
[0122]
人神经元培养上清液：收集人神经元细胞的培养后的培养液，500
×
g离心5分钟，取上清液用于实验或分装后-80℃保存。
[0123]
方法细节
[0124]
额叶组织收集
[0125]
麻醉食蟹猴并用生理盐水灌注，灌注完成且脑组织变白后，将每个脑的右半球固定在4％多聚甲醛中以进行组织学分析。根据脑区将每个脑的左半球分开，并在液氮中冷冻。在冰上小心地挑选出额叶组织，将它们按顺序分成几部分，放入冻存管中，然后将其储存在液氮中。选用8个年轻食蟹猴和8个年老食蟹猴的额叶组织作为实验对象。人类额叶活检样本取样后将组织在生理盐水中洗一遍，之后放入4％多聚甲醛(g：ml，质量体积比，溶质为磷酸氢二钠和磷酸二氢钠，溶剂为超纯水)中固定。选用5例年轻人和6例年老人的额叶活检组织作为实验对象。
[0126]
额叶组织冰冻切片制备
[0127]
固定在4％多聚甲醛(g：ml，质量体积比，溶质为磷酸氢二钠和磷酸二氢钠，溶剂为超纯水)中的额叶组织在4℃固定过夜后，将溶液换为5％蔗糖溶液(g：ml，质量体积比，溶质为蔗糖，溶剂为1xpbs溶液(ph值为7.3，pbs粉末购自中杉金桥，货号zli-9063)，并在4℃摇床上摇晃3小时。然后将溶液换为30％蔗糖溶液(g：ml，质量体积比，溶质为蔗糖，溶剂为1xpbs溶液)，并在4℃摇床上摇晃过夜，直到组织完全下沉。使用leica cm3050s冷冻切片机将oct(optimal cutting temperature compound)嵌入的脱水处理后的额叶组织冰冻切片，厚度为10μm，收集在载玻片上，并保持在
–
80℃直至使用。
[0128]
额叶组织石蜡切片的制备
[0129]
固定在4％多聚甲醛溶液(g：ml，质量体积比，溶质为磷酸氢二钠和磷酸二氢钠，溶剂为超纯水)中的额叶组织在一系列梯度酒精(70％-100％)中脱水，将组织包埋在石蜡中，使用旋转切片机切成5μm的厚度。将切片放在显微镜载玻片上，在56℃下干燥2小时，然后在室温(rt)下保存。
[0130]
sa-β-gal染色
[0131]
对于sa-β-gal染色，组织冰冻切片或玻片上的细胞在pbs中冲洗，在2％甲醛和0.2％戊二醛中固定5分钟，并在37℃下用新制备的染色溶液染色(x-gal购自amresco；所有其他试剂均购自sigma-aldrich)。使用perkinelmer vectra polaris成像系统拍摄图像，并使用imagej量化sa-β-gal阳性区域或阳性细胞比例。
[0132]
aggresome染色
[0133]
组织冰冻切片或玻片上的细胞在pbs中冲洗，用0.3％的triton x-100在pbs中透化7分钟，与aggresome染料(蛋白质聚集测定，enzo，enz-51023-kp002，pbs中
1:3000稀释液)孵育3分钟，然后在1％乙酸中稀释30分钟。接下来，切片在室温(rt)下用pbs洗涤3次(每次10分钟)，并用hoechst 33342(thermo fisher scientific)复染。蔡司lsm 900共聚焦系统用于聚集染色显微镜。
[0134]
组织和细胞免疫荧光染色
[0135]
组织冰冻切片在pbs中漂洗三次，用0.4％triton x-100在pbs中将切片透化半小时，然后再次在pbs漂洗三次。然后将切片与封闭缓冲液(10％驴血清在pbs中)在rt下孵育1小时，然后与一级抗体在4℃下孵育过夜，并与荧光标记的二级抗体在rt下温育1小时。对于玻片上的细胞，用4％pfa固定细胞15分钟，用triton x-100(0.2％在pbs)透化10分钟，在rt下与封闭缓冲液(pbs中的10％驴血清)孵育1小时，并在4℃下用一级抗体染色过夜。然后，将细胞与二级抗体在室温下孵育1小时。在将切片安装在抗褪色安装培养基(vector laboratories，h-1000)中之前，用hoechst 33342(thermo fisher scientific)对nuclei进行复染。蔡司lsm 900共聚焦系统用于免疫荧光显微镜。
[0136]
免疫组织化学染色
[0137]
额叶组织石蜡切片用二甲苯和分级乙醇进行脱蜡和再水化。通过在柠檬酸盐缓冲液中蒸5次，每次3分钟来进行抗原回收。冷却至rt后，切片在pbs中漂洗三次，用0.4％triton x-100在pbs中将切片透化1小时，然后再次在pbs漂洗三次。然后将切片与3％h2o2孵育10分钟以灭活内源性过氧化物酶。然后用pbs中的10％驴血清封闭切片1小时，并与初级抗体在4℃下孵育过夜。第二天，将切片与hrp缀合的第二抗体在rt下孵育1小时。根据制造商的说明，使用dab染色试剂盒(zsgb-bio，zli-9018)进行切片。最后，切片在一系列分级醇(50％、70％、80％、90％、100％和100％)和二甲苯中脱水，然后安装在中性树脂安装介质中。图像是用perkinelmer vectra polaris成像系统拍摄的。
[0138]
(免疫)透射电镜
[0139]
对于透射电镜，用2.5％(体积/体积)戊二醛和磷酸盐缓冲液(pb)(0.1m，ph 7.4)在rt下固定组织1小时，然后在4℃下过夜。用accumax(millipore)酶促收获培养7天和35天的神经元，并在室温下以500
×
g离心5分钟。用2.5％(vol/vol)戊二醛和磷酸盐缓冲液(pb)(0.1m，ph 7.4)在室温下固定细胞20分钟，然后在4℃下过夜。随后将样品在一系列分级乙醇中脱水，透化并包埋在lowicryl树脂hm20中。使用leica em uc7获得切片(200nm)，并使用在100kv下操作的tem spirit 120kv(fei公司)成像。
[0140]
对于免疫透射电镜，用溶解在4％甲醛中的戊二醛在室温下以0.1％的最终浓度固定组织2小时。用accumax(millipore)酶促收获神经元，并在室温下在500
×
g下离心5分钟。然后用溶于4％甲醛中、在室温下终浓度为0.1％的戊二醛固定细胞2小时。将组织或细胞颗粒在37℃下重悬于pbs中12％wt/vol的明胶中15分钟，然后在冰上放置10-20分钟以固化明胶。将组织或细胞颗粒切成小块，并在4℃下置于2.3m蔗糖中过夜。将样品块从2.3m蔗糖到铝的样品支架中取出，将其浸入液氮中冷冻。超薄切片将使用超微切片机(leica em fc7，德国)在-120℃下切割，并在网格上拾取。为了染色，用pb洗涤网格，用1％bsa孵育30分钟，然后在rt下与抗erv-env抗体孵育2小时，用含有0.1％冷新鲜明胶的pb缓冲液洗涤2分钟五次，在rt下用金标记的抗小鼠第二抗体(aurion)孵育1小时。将标记的样品置于ua/mc(乙酸铀酰/甲基纤维素，1:9)滴上5分钟，并通过循环收集，然后在那里干燥。使用在100kv下操作的透射电子显微镜(fei tacnai spirit，america)对样品进行观察。
[0141]
elisa
[0142]
额叶组织在冰上用ripa裂解缓冲液裂解，然后在4℃下以600
×
g离心20分钟。然后收集组织裂解物的上清液，并根据制造商的说明使用elisa试剂盒(cayman chemical)测量2
′3′‑
cgamp水平。使用synergy h1(biotek)在450nm下扫描平板，最后通过总蛋白浓度对数据进行归一化。
[0143]
对于培养神经元的上清液和人脑脊液，以500
×
g离心5分钟以清除碎屑。根据制造商的说明，使用elisa试剂盒测量2
′3′‑
cgamp、il6、aβ(1-40)和aβ(1-4 2)的浓度。为了检测erv-env浓度，使用浓缩管(millipore)浓缩上清液，然后根据制造商的说明使用elisa试剂盒进行检测。数据通过细胞数进行归一化。
[0144]
dna/rna的提取和分析
[0145]
按照制造商的说明，用dna提取试剂盒(tiangen)纯化基因组dna。对于rna分析，根据制造商的方案，使用trizol试剂(赛默飞世尔科学公司)提取总rna。然后使用2μg总rna作为模板，使用goscripttm逆转录系统(promega)对cdna进行逆转录。使用itaq通用sybr绿色supermix(bio-rad)在cfx384实时pcr系统(bio-rd)上进行逆转录定量pcr(qrt
–
pcr)。qrt-pcr检测使用了至少三个生物重复序列，并通过双尾student t检验分析了两组之间的差异。表4中列出了所使用的引物序列。
[0146]
chip
–
qpcr
[0147]
对于组织，将冷冻样品在1ml预冷pbs中匀浆。所得细胞悬浮液通过70μm细胞过滤器(bd falcon)过滤，然后在4℃下以2000
×
g离心5分钟。将裂解物在pbs中的1％甲醛中在rt下固定6分钟，然后用125mm甘氨酸猝灭。对于细胞，将它们在pbs中的1％甲醛中在rt下固定8分钟，然后用125mm甘氨酸猝灭。然后，通过在4℃下在转子上孵育10分钟，使用细胞质裂解溶液来富集细胞质部分。然后，收集上清液并使用covaris s220聚焦超声发生器进行超声处理。超声处理后，将上清液与预偶联有抗cgas或抗igg抗体的蛋白a dynabeads(thermo fisher scientific)在4℃下孵育过夜。随后对样品进行洗脱，并在68℃的洗脱缓冲液中在热混合器上反向交联3小时。使用苯酚-氯仿-异戊醇提取洗脱的dna，并进行进一步的qpcr检测。5srdna的qpcr分析用于检查细胞核基因组污染(数据未显示)，5s rdna原则上不存在于细胞质部分中。用于chip
–
qpcr的引物在表4中列出。
[0148]
bulk rna-seq文库的构建和测序
[0149]
使用trizol试剂(thermo fisher scientific)提取来自个体食蟹猴fl组织和hneuron的总rna。如前所述，novogene生物信息技术有限公司对每个样本进行rna质量控制、文库构建和高通量测序。简言之，测序文库是使用(美国东北大学)的ultratm rna文库制备试剂盒制备的，并单独索引。在illumina配对末端测序平台上以150bp的读取长度对所得文库进行分析。
[0150]
猴额叶单核提取和单核rna文库构建和测序
[0151]
所有程序均在冰上或4℃下进行。将核酸分离培养基1和2(nim1和nim2)以及均化缓冲液在冰上预冷。nim1在无核酸酶的水中含有250mm蔗糖、25mm kcl、5mm mgcl2和10mm tris缓冲液(ph 8.0)。除添加1μm dtt和1
×
蛋白酶抑制剂外，nim2与nim1相同。均化缓冲液包含以下试剂：nim2、0.4u/μl rnasein、0.2u/μl superasin、0.1％triton x-100、1μm碘化丙啶(pi)和10ng/ml hoechst 33342。在用均化缓冲液研磨fl组织后，通过40微米的细胞过
滤器(bd falcon)过滤样品，在4℃下以500
×
g离心8分钟，并重悬于补充有0.3％bsa(gemini)、0.4u/μl rnasein(promega)和0.2u/μl superasin(thermo fisher scientific)的pbs中。使用facs(bd influx)对hoechst 33342和pi双阳性细胞核进行分选，并使用双荧光细胞计数器(luna fltm，logos biosystems)计数。细胞核捕获采用10x基因组学单细胞3'系统进行。按照标准的10x捕获和文库制备方案(10x基因组学)，每个样本捕获约8000个细胞核，然后在novaseq 6000测序系统(illumina，20012866)中测序。
[0152]
全基因组重亚硫酸盐甲基化测序(简称wgbs)文库构建和测序
[0153]
根据制造商的方案(zymo research)，使用fl组织的基因组dna构建文库，将未甲基化的λdna(promega)掺入裂解缓冲液中，以跟踪亚硫酸氢盐转化的效率。根据方案，使用ez-dna甲基化金试剂盒(zymo research)进行接头连接的dna片段的二硫化物转化。使用kapa hifi hotstart uracil+readymix(2
×
)制备测序文库，并在hiseq x ten平台上测序。
[0154]
bulk rna-seq数据分析
[0155]
trimgalore(版本0.4.5)用于修剪原始测序读数，参数为“严格性3-配对”。对于蛋白质编码基因分析，然后用hisat2(2.0.4版)将猴子fl组织和hneuron的修剪读数映射到macaca_fascicularis_5.0和hg19基因组，参数为
“‑‑
dta”。使用htseq(版本0.11.0)生成基因计数矩阵。对于重复元素分析，使用star(版本2.5.2b)进行基因组图谱绘制，使用从ucsc基因组浏览器下载的重复元素注释使用featurecounts(版本2.0.0)对图谱绘制结果进行计数。用deseq2(版本1.22.2)进行差异表达分析。差异表达基因的鉴定截止值为|log2fc|》1，调整后的p值《0.05，差异表达重复元件的定义为|log2fc|》0.2，调整后p值《0.005。
[0156]
单核rna测序数据处理和质量控制
[0157]
cell ranger(3.0.0版)用于处理使用10x基因组学平台生成的原始测序文件，这些文件与使用macaca_fascicularis_5.0生成的前mrna参考进行映射。用cellbender(版本0.2.0)分析cell ranger生成的基因计数矩阵，以去除环境噪声，并根据cellbender教程中建议的cell rangers输出确定预期的细胞和包括的总液滴。用seurat(3.2.3)处理过滤结果，并排除线粒体基因比率》5％且检测到的基因数量《200的细胞。使用doubletfinder(2.0.2版)识别并排除了可能的双偶点。在doubletfinder分析中，每个样本的邻域大小(pk)由均方差归一化双模态系数确定，人工双偶点的数量(pn)由10x genomics建议设置。最后，共获得111698个高质量转录组用于下游分析。
[0158]
单核rna测序数据整合和聚类
[0159]
使用seurat的“sctransform”函数对每个样本的数据集进行归一化。通过“selectintegrationfeatures”功能选择了总共3000个用于整合的高度可变基因，并使用“runpca”功能进行主成分分析(pca)。然后通过修拉的rpca集成管道对所有样本进行集成。“runpca”再次应用于集成数据集，并选择前20个组件使用“runtsne”功能进行降维分析。并且使用“findneighbors”和“findclusters”功能进行聚类。用标准标记基因对细胞类型进行注释。使用“findallmarkers”功能进一步计算标记基因。
[0160]
单核rna测序数据基因集打分分析
[0161]
从gsea分子特征数据库中获得基因集(https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb).对于bulk rna-seq数据，gsea(版本4.1.0)用于统计计算两组之间一组基因的差
异。对于snrna-seq数据，通过seurat的“addmodulescore”功能进行基因集评分分析，并通过ggpubr r包(0.2.4版)和wilcoxon检验计算两组之间的统计差异。
[0162]
wgbs数据处理
[0163]
测序读数首先通过fastp(0.19.10版本)进行处理。然后通过bsmap(2.90版本)将干净读数映射到macaca_fascicularis_5.0基因组。使用bsmap的甲基化算法计算每个cpg位点的dna甲基化水平(mgc/gc)。整合了正向和反向链的甲基化水平，仅保留了深度》5的cpg位点。deeptools(2.5.4-2-5ee467f版)的computematrix函数用于计算所有蛋白质编码基因和某些重复元件的dna甲基化水平。
[0164]
量化和统计分析
[0165]
所有结果均以平均值
±
sem表示。使用双尾student t检验对数据进行统计分析，以比较假设prism软件(graphpad软件)方差相等的治疗之间的差异。p值《0.05被认为具有统计学意义。p值以适当的方式显示在所示的图中。通过spearman秩相关分析计算相关系数。
[0166]
抗体
[0167]
本技术实施例中使用的抗体为常规商业化抗体或试剂盒自带抗体，例如表1所示的抗体。
[0168]
表1
[0169]
[0170][0171]
化学试剂和重组蛋白
[0172]
本技术实施例中使用的化学试剂和重组蛋白为常规商业化化学试剂和重组蛋白，例如表2所示的化学试剂和重组蛋白。
[0173]
表2
[0174]
[0175]
[0176][0177]
试剂盒
[0178]
本技术实施例中使用的试剂盒为常规商业化试剂盒，例如表3所示的试剂盒。
[0179]
表3
[0180][0181]
引物
[0182]
本技术实施例中使用的引物序列如表4所示。
[0183]
表4
[0184]
[0185][0186]
实施例1、erv活化与灵长类额叶组织和人神经元衰老相关
[0187]
一、衰老额叶组织的wgbs分析
[0188]
针对8个年轻和8个年老的食蟹猴个体额叶进行全基因组重亚硫酸盐甲基化测序(简称wgbs)文库构建和测序。
[0189]
来自8个年轻和8个年老的非人灵长类食蟹猴个体wgbs测序结果如图1所示，wgbs测序鉴定衰老食蟹猴额叶组织erv的dna甲基化水平，结果表明，与年轻额叶组织相比，年老额叶组织中erv的dna甲基化水平显著降低。
[0190]
检测待测额叶组织erv的dna甲基化水平的物质：在本发明的实施例中，具体为
wgbs建库和测序所需试剂，包括ez-dna甲基化金试剂盒(zymo research)。
[0191]
二、衰老额叶组织和长期培养的人神经元erv的rna表达水平的检测
[0192]
非人灵长类bulk rna-seq结果来自8个年轻和8个年老的食蟹猴个体的额叶，人神经元bulk rna-seq结果来自三个独立重复孔的培养7天和培养35天的人神经元细胞样本。
[0193]
测序分析结果见图2，图2a为bulk rna-seq鉴定食蟹猴额叶组织erv的rna表达水平情况，图2b为bulk rna-seq鉴定长期培养的人神经元erv的rna表达水平情况，结果表明，与年轻额叶组织相比，年老额叶组织中erv的rna表达水平显著增加(图2a)，随着长期培养人神经元erv的rna表达水平显著增加(图2b)。
[0194]
检测待测额叶组织或人神经元中erv的rna表达水平的物质：在本发明的实施例中，具体为bulk rna-seq建库和测序所需试剂，包括ultratm rna文库制备试剂盒(neb,usa)。
[0195]
三、衰老额叶组织和长期培养的人神经元erv-env的检测
[0196]
非人灵长类额叶组织分别源于8个年轻和8个年老的食蟹猴个体，人类额叶组织分别源于5例年轻和6例年老人活检样本，人神经元来源于三个独立重复孔的培养7天，14天，21天，28天和培养35天的样本。
[0197]
非人灵长类染色结果来自8个年轻和8个年老的食蟹猴个体的额叶冰冻切片，人类染色结果来自5例年轻和6例年老人额叶冰冻切片，人神经元染色结果来自三个独立重复孔的培养7天，14天，21天，28天和培养35天的细胞样本。检测结果和定量结果见图3，图3中的涉及纵坐标为倍数均为将年轻组或7天培养细胞样荧光强度取平均数后归一化成1，然后用年老组或14天，21天，28天和培养35天的细胞样荧光强度除以平均数即为倍数；图3a为免疫荧光染色鉴定衰老食蟹猴额叶组织分子标志物erv-env的表达和定位情况，图3b为免疫荧光染色鉴定人额叶组织分子标志物erv-env的表达和定位情况，图3c为免疫荧光染色鉴定长期培养的人神经元分子标志物erv-env的表达和定位情况；结果表明，与年轻额叶组织相比，年老额叶组织中erv-env荧光强度显著增加(图3a和3b)，随着长期培养人神经元erv-env荧光强度显著增加(图3c)。
[0198]
检测待测额叶组织或人神经元的erv-env表达量的物质包括：特异结合erv-env的物质，具体为食蟹猴中采用erv-env兔抗ervw-1或人中采用鼠抗hervk-env抗体。
[0199]
四、老年人脑脊液和长期培养的人神经元上清液中erv-env表达量的检测
[0200]
1)、样本处理和试剂准备
[0201]
1.收集人脑脊液或长期培养的人神经元上清液，500
×
g离心5分钟，取上清液用于实验或分装后-80℃保存；
[0202]
2.制备标准品，用1ml样本稀释液溶解，进行倍比稀释得到一系列标准品；
[0203]
3.准备洗涤液，浓缩洗涤液按1:25用去离子水稀释，临用前配妥；
[0204]
4.准备生物素标记抗体工作液，生物素标记抗体按1：100用去生物素标记抗体稀释液稀释；
[0205]
5.准备辣根过氧化物酶标亲和工作液，辣根过氧化物酶标亲和素按1：100用辣根过氧化物酶标亲和稀释液稀释。
[0206]
2)、elisa实验
[0207]
1.每孔加入100ul标准品或样品，贴膜，37℃温育2小时；
[0208]
2.弃去液体，每孔加入100ul生物素标记抗体工作液，贴膜，37℃温育1小时；
[0209]
3.弃去液体，洗板3次，每孔加入100ul辣根过氧化物酶标亲和工作液，贴膜，37℃温育1小时；
[0210]
4.弃去液体，洗板5次，每孔加入90ul底物溶液，37℃避光显色15-30分钟；
[0211]
5.每孔加入50ul终止液，终止反应。
[0212]
6.分别用酶标仪检测450nm和570nm处的吸光度，450nm读出数值减去570nm读出数值即为实际吸光度，根据标准品绘制相应的标准曲线，计算得出样品中目的蛋白浓度。
[0213]
结果如图4所示，a为年轻和老年人脑脊液中erv-env含量(或浓度)的检测,b为长期培养的人神经元培养基上清中erv-env含量(或浓度)的检测，老年人脑脊液中erv-env含量高于年轻人脑脊液，且人神经元培养时间长则上清液中的erv-env含量升高；上述结果表明，衰老人脑脊液及神经元长时间培养上清中erv-env含量升高，而且erv能从细胞内分泌到细胞外。
[0214]
检测待测脑脊液或人神经元培养基上清的erv-env表达的物质包括：特异结合erv-env的物质，具体为hervk-env elisa试剂盒(cusabio，货号cbs-el007812hu)。
[0215]
五、衰老额叶组织中erv基因组dna含量的检测
[0216]
1)、额叶组织基因组dna提取
[0217]
1、取额叶液氮冻存组织10mg左右，放入装有此株的组织研磨管中，加入1ml冷的pbs(1x、ph值7.3),研磨机60hz,60s，两次，然后500g，5min离心，倒掉上清液；
[0218]
2、使用组织细胞dna提取试剂盒，加200ul缓冲液ga，振荡至彻底悬浮；
[0219]
3、加入20ul proteinase k溶液混匀，56℃放置1-3小时，直至组织溶解，简短离心以去除管内壁水珠；
[0220]
4、加入200ul缓冲液gb，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管内壁水珠；
[0221]
5、加入200ul无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管内壁水珠；
[0222]
6、将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱cb3中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱cb3放回收集管中；
[0223]
7、向吸附柱cb3中加入500ul缓冲液gd(使用前加入无水乙醇)，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱cb3放回收集管中；
[0224]
8、向吸附柱cb3中加入600ul漂洗液pw(使用前加入无水乙醇)，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱cb3放回收集管中；
[0225]
9、重复操作步骤8；
[0226]
10、将吸附柱cb3放回收集管中，12000rpm离心2分钟，倒掉废液，将吸附柱cb3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；
[0227]
11、将吸附柱cb3转入一个干净的离心管，向吸附膜中间部位悬空滴加100ul洗脱缓冲液te，室温放置5分钟，12000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中。
[0228]
上述额叶组织分别源于8个年轻食蟹猴个体和8个年老的食蟹猴个体，具体收集方法与实施例1的一相同。
[0229]
2)、qpcr检测额叶组织erv基因组dna含量
[0230]
1、测定16个样品的dna浓度，然后均稀释至相同的浓度；
[0231]
2、qpcr检测，验证erv基因组dna含量。
[0232]
上述qpcr检测的引物见表4。
[0233]
3、用上述实时荧光定量pcr引物cyerv#1进行qpcr扩增，放置于荧光定量pcr仪反应。
[0234]
qpcr结果来自8个年轻和8个年老的食蟹猴个体的额叶组织。定量结果见图5，纵坐标为erv dna含量(倍数)，纵坐标倍数为将年轻组erv dna含量取平均数后归一化成1，然后用年老组erv dna含量除以平均数即为倍数。结果表明，与年轻额叶组织相比，年老额叶组织中erv基因组dna含量显著增加。
[0235]
检测待测额叶组织的erv基因组dna含量的物质包括：特异结合erv基因组的物质，具体为包括用于扩增erv区域的qpcr引物cyerv#1和内参5s rrna。
[0236]
六、衰老额叶组织中rvlp含量的检测
[0237]
透射电镜观察结果来自8个年轻和8个年老的食蟹猴个体或培养7天和培养35天的神经元样本。免疫透射电镜结果来自5例年轻和6例年老人样品或培养7天和培养35天的神经元样本。
[0238]
检测结果和定量结果见图6，图6a为透射电子显微镜鉴定食蟹猴衰老额叶组织rvlp的表达和定位情况，图6b为免疫透射电镜鉴定老年人额叶组织rvlp的表达和定位情况，图6c为透射电子显微镜鉴定培养7天和培养35天的神经元中rvlp的表达和定位情况，图6d为免疫透射电镜鉴定培养7天和培养35天的神经元中rvlp的表达和定位情况；图6的纵坐标分别为每个细胞中rvlp的数目和单位面积rvlp的数目；结果表明，与年轻额叶组织相比，年老额叶组织中每个细胞中rvlp的数目和单位面积rvlp的数目显著增加(图6a和6b)，与培养7天的神经元相比，培养35天的神经元中每个细胞中rvlp的数目显著增加(图6c和6d)。
[0239]
检测待测额叶组织中rvlp含量采用的物质包括：透射电子显微镜，或免疫透射电镜和特异结合erv-env的物质，其中，特异结合erv-env的物质包括鼠抗hervk-env抗体和金标记的抗小鼠二抗。
[0240]
上述结果表明，
[0241]
erv的含量可以作为检测额叶或神经元衰老程度的标志物，erv的含量可以通过erv的dna甲基化水平、erv的rna表达水平、erv-env的表达量(细胞内包括额叶或培养的人神经元、分泌到细胞外包括脑脊液或培养的人神经元上清液)、erv基因组dna含量和erv的rvlp含量中至少一种体现，具体如下：
[0242]
erv的dna甲基化水平可以作为检测额叶或体外培养的神经元衰老程度的标志物，具体如下：检测待测额叶组织或体外培养神经元的erv的dna甲基化水平，erv的dna甲基化水平低的待测额叶组织或神经元的衰老程度大于或候选大于erv的dna甲基化水平高的待测额叶组织或神经元。
[0243]
erv的rna表达水平可以作为检测额叶或体外培养的神经元衰老程度的标志物，具体如下：检测待测额叶组织或体外培养神经元的erv的rna表达水平，erv的rna表达水平高的待测额叶组织或神经元的衰老程度大于或候选大于erv的rna表达水平低的待测额叶组织或神经元。
[0244]
erv-env的表达量可以作为检测额叶或体外培养的神经元衰老程度的标志物，具
体如下：检测待测额叶组织或体外培养神经元或脑脊液或神经元培养上清液的erv-env的表达量，erv-env的表达量高的待测额叶组织或神经元的衰老程度大于或候选大于erv-env的表达量低的待测额叶组织或神经元。
[0245]
erv基因组dna含量可以作为检测额叶或体外培养的神经元衰老程度的标志物，具体如下：检测待测额叶组织或体外培养神经元的erv基因组dna含量，erv基因组dna含量高的待测额叶组织或神经元的衰老程度大于或候选大于erv基因组dna含量低的待测额叶组织或神经元。
[0246]
rvlp含量可以作为检测额叶或体外培养的神经元衰老程度的标志物，具体如下：检测待测额叶组织或体外培养的神经元中rvlp含量，rvlp含量高(每个细胞中rvlp的数目或单位面积rvlp的数目高)的待测额叶组织或神经元的衰老程度大于或候选大于rvlp含量低(每个细胞中rvlp的数目或单位面积rvlp的数目低)的待测额叶组织或神经元。
[0247]
实施例2、erv激活的cgas-sting天然免疫信号通路相关蛋白在检测灵长类额叶组织和人神经元衰老中的应用
[0248]
一、衰老额叶组织或长期培养的人神经元细胞质erv dna上cgas富集量的检测
[0249]
1)、将protein a dynabeads与等量cgas(cgas购自cell signaling technology，货号为15102s)或对照igg抗体(购自cell signaling technology，货号为2729s)共孵育，使磁珠与抗体结合；
[0250]
2)、对于额叶组织，称取等质量的额叶组织(0.5g)左右，加入1ml预冷的pbs，放入组织研磨仪中，70hz，120秒振荡研磨后使用70μm细胞筛过滤，收集过滤下来的单细胞悬液，2000rpm离心5分钟，弃掉上清液，加入1ml pbs并向其中加入27μl 37％甲醛,室温固定6min，之后加入114μl 1.25m的甘氨酸终止交联。交联好的单细胞用预冷的pbs清洗两次后离心；
[0251]
3)、对于培养7天和35天的人神经元细胞，收集相同细胞数的细胞，将它们在pbs中的1％甲醛中在rt下固定8分钟，然后用125mm甘氨酸猝灭。
[0252]
4)、吸走pbs后弹匀，加800μl buffer a在4℃旋转器上旋转10分钟进行核质分离，12000g离心5分钟，吸取上清为胞质组分；
[0253]
5)、将已结合抗体的磁珠与胞质的染色质-蛋白质混合物进行共孵育，4℃旋转过夜；
[0254]
6)、用ripa buffer和te buffer清洗非特异性结合片段，之后加入蛋白酶k在68℃金属浴中解交联；
[0255]
7)、用酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)两步法抽提沉淀dna，并用ddh2o溶解；
[0256]
8)、qpcr检测，验证cgas在erv区域的结合位点；
[0257]
上述qpcr检测的引物见表4(引物为herv或cyerv#2)，内参选用5s rdna：
[0258]
qpcr结果来自8个年轻和8个年老的食蟹猴个体的额叶组织和体外培养的人神经元细胞。定量结果见图7，纵坐标为cgas在erv上的相对富集含量；a为额叶组织cgas在细胞质erv dna上的相对富集量，b为体外培养的人神经元细胞cgas在细胞质erv dna上的相对富集量；结果表明，与年轻额叶组织相比，年老额叶组织中cgas在erv上的相对富集显著增加；与第7天人神经元相比，第35天人神经元中cgas在erv上的相对富集显著增加。
[0259]
检测待测额叶组织或神经元中细胞质erv dna上cgas富集量采用的物质包括：特异结合cgas蛋白和erv dna序列的物质；其中特异结合cgas蛋白的物质具体为免疫共沉淀所需试剂，包括兔抗cgas(d1d3g)和兔抗igg，特异结合erv dna序列的物质具体为qpcr的引物，为引物herv或cyerv#2。
[0260]
二、衰老额叶组织或老年人脑脊液或长期培养的神经元上清液中2
’3’‑
cgamp含量的检测
[0261]
1)、组织裂解和试剂准备
[0262]
1.使用冰上预冷的ripa裂解缓冲液裂解额叶组织，然后在4℃下以600
×
g离心20分钟，收集组织裂解物上清液，收集人脑脊液或长期培养的人神经元上清液，500
×
g离心5分钟，取上清液用于实验或分装后-80℃保存；
[0263]
2.准备immunoassay buffer c(1x)，用90ml ddh2o稀释一整瓶浓缩的immunoassay buffer c(10x)；
[0264]
3.准备wash buffer(1x)，用2l ddh2o稀释一整瓶浓缩的wash buffer(400x),加入1ml polysorbate 20；
[0265]
4.制备标准品，
[0266]
5.准备2
‘3’‑
cgamp-hrp-tracer(1x)，用5ml immunoassay buffer c(1x)稀释2
‘3’‑
cgamp-hrp-tracer,获得6ml液体，1:100加入60ul红色染料以指示，稀释的2
‘3’‑
cgamp-hrp-tracer存储在4℃，两周内使用完；
[0267]
6.准备2
‘3’‑
cgamp elisa polyclonal antiserum(1x)，6ml 2
‘3’‑
cgamp elisa polyclonal antiserum已制备好在小瓶中，1:100加入60ul蓝色染料以指示。
[0268]
2)、elisa实验
[0269]
1.每孔加入300ul wash buffer(1x)，预洗孔板5次；
[0270]
2.每孔加入100ul immunoassay buffer c(1x)至nsb孔，加入50ul immunoassay buffer c(1x)至b0孔；
[0271]
3.加入50ul标准品至标准品孔中，加入50ul样品至样品孔中；
[0272]
4.除ta和blk孔外，每孔加入50ul 2
’3’‑
cgamp-hrp-tracer(1x)；
[0273]
5.除ta、nsb和blk孔外，每孔加入50ul 2
’3’‑
cgamp elisa polyclonal antiserum(1x)；
[0274]
6.用封膜覆盖板子，室温摇床2小时；
[0275]
7.清除孔中液体，每孔加入300ul wash buffer(1x)，洗孔板5次；
[0276]
8.每孔加入175ul tmb substrate solution；
[0277]
9.加入5ul 2
’3’‑
cgamp-hrp-tracer(1x)至ta孔；
[0278]
10.用封膜覆盖板子，室温摇床30分钟；
[0279]
11.无需清除孔中液体，直接加入75ul hrp stop solution至每孔，液体由蓝变黄；
[0280]
12.分别用酶标仪检测450nm和570nm处的吸光度，450nm读出数值减去570nm读出数值即为实际吸光度，根据标准品绘制相应的标准曲线，计算得出样品中目的蛋白浓度。
[0281]
结果如图8所示，a为年轻和老年食蟹猴额叶匀浆中2
’3’‑
cgamp含量的检测,b为年轻人和老年人脑脊液中2
’3’‑
cgamp含量(或浓度)的检测,c为长期培养的人神经元培养基
上清中2
’3’‑
cgamp含量的检测，纵坐标倍数为将年轻组或培养7天的神经元上清液的2
’3’‑
cgamp浓度取平均数后归一化成1，然后用年老组或培养35天的神经元上清液2
’3’‑
cgamp浓度除以平均数；年老食蟹猴额叶匀浆中2
’3’‑
cgamp含量高于年轻额叶匀浆，老年人脑脊液中2
’3’‑
cgamp含量高于年轻人脑脊液，且人神经元培养时间长则上清液中的2
’3’‑
cgamp含量升高；上述结果表明，年老猴额叶匀浆，衰老人脑脊液及神经元长时间培养上清中2
’3’‑
cgamp含量升高。
[0282]
检测待测脑脊液及神经元长时间培养上清中2
’3’‑
cgamp含量的物质包括：特异结合2
’3’‑
cgamp的物质，具体为2
’3’‑
cgamp elisa试剂盒(cayman，货号501700)。
[0283]
3、衰老额叶组织或长期培养的神经元p-tbk1的检测
[0284]
非人灵长类染色结果来自8个年轻和8个年老的食蟹猴个体的额叶冰冻切片，人类染色结果来自5例年轻和6例年老人额叶冰冻切片，人神经元染色结果来自三个独立重复孔的培养7天，14天，21天，28天和培养35天的细胞样本。
[0285]
检测结果和定量结果见图9，图9中纵坐标倍数为将年轻组或培养7天的神经元上清液的p-tbk1表达量取平均数后归一化成1，然后用年老组或培养14-35天的神经元上清液p-tbk1表达量分别除以平均数；图9a为免疫荧光染色鉴定衰老食蟹猴额叶组织分子标志物p-tbk1的表达和定位情况，图9b为免疫荧光染色鉴定人额叶组织分子标志物p-tbk1的表达和定位情况，图9c为免疫荧光染色鉴定长期培养的人神经元分子标志物p-tbk1的表达和定位情况。结果表明，与年轻额叶组织相比，年老额叶组织中p-tbk1阳性的神经元比例显著增加(图9a和9b)，随着长期培养人神经元p-tbk1阳性的神经元比例显著增加(图9c)。
[0286]
检测待测额叶及神经元中p-tbk1表达量的物质包括：特异结合p-tbk1的物质，具体为兔抗phospho-tbk1/nak(ser172)。
[0287]
上述结果表明，erv激活的cgas-sting天然免疫信号通路相关蛋白的表达可以作为检测额叶或神经元衰老程度的标志物，cgas-sting天然免疫信号通路相关蛋白的表达通过如下至少一种体现：cgas在细胞质erv dna上富集量、2
’3’‑
cgamp表达量(额叶匀浆、脑脊液或神经元上清液)、p-tbk1表达量，具体如下：
[0288]
cgas在细胞质erv dna上富集量可以作为检测额叶或体外培养的神经元衰老程度的标志物，具体如下：检测待测额叶或体外培养神经元细胞质erv dna上cgas的富集量，细胞质erv dna上cgas富集量高的待测额叶组织或神经元的衰老程度大于或候选大于细胞质erv dna上cgas富集量低的待测额叶组织或神经元。
[0289]2’3’‑
cgamp含量可以作为检测额叶或体外培养的神经元衰老程度的标志物，具体如下：检测待测额叶匀浆、脑脊液或人神经元培养上清液中2
’3’‑
cgamp含量，2
’3’‑
cgamp含量高的待测额叶组织或神经元的衰老程度大于或候选大于2
’3’‑
cgamp含量低的待测额叶组织或神经元。
[0290]
p-tbk1表达量可以作为检测额叶或体外培养的神经元衰老程度的标志物，具体如下：检测待测额叶或体外培养的神经元中p-tbk1表达量，p-tbk1表达量高的待测额叶组织或神经元的衰老程度大于或候选大于p-tbk1表达量低的待测额叶组织或神经元。
[0291]
实施例3、敲低lamin b1和lamin b2诱导erv激活从而促进人类神经元衰老
[0292]
一、衰老额叶组织神经元和长期培养的神经元中lmnb1和lmnb2的rna表达水平的检测
[0293]
非人灵长类单核rna测序结果来自8个年轻和8个年老的食蟹猴个体额叶，人神经元bulk rna-seq结果来自三个独立重复孔的培养7天和培养35天的细胞样本。
[0294]
测序分析结果见图10和图11，图10a和10c为单核rna测序鉴定衰老食蟹猴额叶神经元中lmnb1和lmnb2的rna表达水平，图11a为bulk rna-seq鉴定长期培养的人神经元lmnb1和lmnb2的rna表达水平。结果表明，与年轻额叶组织相比，年老额叶神经元中lmnb1和lmnb2的rna表达水平显著降低(图10a和c)，随着长期培养人神经元lmnb1和lmnb2的rna表达水平显著降低(图11a和c)。
[0295]
二、衰老额叶组织神经元和长期培养的神经元中lamin b1和lamin b2蛋白表达量的检测
[0296]
非人灵长类染色结果来自8个年轻和8个年老的食蟹猴个体的额叶冰冻切片，人神经元染色结果来自三个独立重复孔的培养7天，14天，21天，28天和培养35天的细胞样本。
[0297]
检测结果和定量结果见图10和图11，图10或11中纵坐标倍数为将年轻组的lamin b1或b2的荧光强度取平均数后归一化成1，然后用年老组的lamin b1或b2的荧光强度分别除以平均数；图10b和d为免疫荧光染色鉴定衰老食蟹猴额叶组织分子标志物lamin b1和b2的表达情况，图11b和c为免疫荧光染色鉴定长期培养的人神经元分子标志物lamin b1和b2的表达情况。结果表明，与年轻额叶组织相比，年老额叶组织神经元中lamin b1/b2的荧光强度显著降低(图10b和d)，随着长期培养人神经元lamin b1/b2的荧光强度显著降低(图11b和c)。
[0298]
三、体外培养的神经元中sirna介导的lmnb1和lmnb2敲低效率的检测
[0299]
人神经元来源于三个独立重复孔的培养21天的样本。
[0300]
特异性靶向lmnb1和lmnb2的mrna的sirna分子购自riobio(中国)。sirna的序列如表4所示。同样由ribobio提供的nc双链体与任何哺乳动物基因都不同源，并广泛用于敲除测定。按照制造商的说明，使用lipofectamine 3000转染试剂(thermo fisher scientific)用针对lmnb1和lmnb2的nc或sirna双链体转染神经元。
[0301]
简言之，对于6孔板上的一个孔，将6μl lipofectamine 3000试剂在125μl opti-mem培养基中稀释，然后充分混合。将针对lmnb1和lmnb2的sirna双链体(各3μl)在125μlopti-mem培养基中稀释，然后充分混合，得到稀释后的sirna双链体。将稀释后的sirna双链体加入稀释的lipofectamine 3000试剂(1:1比例)中，然后在室温下孵育10-15分钟，得到sirna脂质复合物。将sirna脂质复合物添加到神经元中，并在6-8小时后用新鲜培养基代替。转染后48小时，收集细胞，并通过qrt-pcr测量lmnb1和lmnb2的mrna水平。转染后72小时，收集细胞进行免疫荧光，以检测lmnb1和lmnb2的敲除效率。
[0302]
对于长时间培养后的神经元，每6天转染一次sirna双链体，并连续转染多次。当转染后的神经元培养21天(以第一次转染当天记作第0天)时，收集样本免疫荧光检测。
[0303]
检测结果和定量结果见图12，图12中纵坐标倍数为将对照组的lamin b1或b2的转录本表达量或荧光强度取平均数后归一化成1，然后用敲低组中lamin b1或b2的转录本的表达量或荧光强度分别除以平均数；图12a为qrt-pcr鉴定敲低lmnb1和lmnb2的人神经元lmnb1和lmnb2的rna表达情况，图12b和c为免疫荧光染色鉴定敲低lmnb1和lmnb2的人神经元lamin b1和b2的表达情况。结果表明，与对照组相比，敲低lmnb1和lmnb2的人神经元lmnb1和lmnb2的rna表达显著降低(图12a)，敲低lmnb1和lmnb2的人神经元lamin b1/b2的
荧光强度显著降低(图12b和c)。
[0304]
四、lmnb1和lmnb2缺陷的人神经元中h3k9me3降低且erv激活
[0305]
将上述三得到的敲低lmnb1和lmnb2的人神经元进行如下免疫荧光染色、透射电镜和免疫透射电镜，分别检测h3k9me3、erv-env和rvlp的表达。对照组为培养21天的人神经元样本。
[0306]
检测结果和定量结果见图13，图13中纵坐标倍数为将对照组荧光强度取平均数后归一化成1，然后用敲低组荧光强度分别除以平均数；图13a为免疫荧光染色鉴定敲低lmnb1和lmnb2的人神经元h3k9me3的表达情况，图13b为免疫荧光染色鉴定敲低lmnb1和lmnb2的人神经元erv-env的表达情况,图13c为透射电镜鉴定敲低lmnb1和lmnb2的人神经元rvlp的表达情况,图13d为免疫透射电镜鉴定敲低lmnb1和lmnb2的人神经元rvlp的表达情况。结果表明，与对照组相比，敲低lmnb1和lmnb2的人神经元h3k9me3的荧光强度显著降低(图13a)，敲低lmnb1和lmnb2的人神经元erv-env的荧光强度显著增加(图13b)，敲低lmnb1和lmnb2的人神经元rvlp含量显著增加(图13c和d)。
[0307]
五、lmnb1和lmnb2缺陷的人神经元天然免疫反应激活
[0308]
将上述三得到的敲低lmnb1和lmnb2的人神经元进行如下ip实验、elisa鉴定、免疫荧光染色和bulk rna-seq分析，分别检测细胞质erv dna上cgas富集、神经元上清液中2
’3’‑
cgamp的表达、p-tbk1的表达、rela的表达。对照组为培养21天的人神经元样本。
[0309]
检测结果和定量结果见图14，图14中纵坐标倍数为将对照组表达量或荧光强度取平均数后归一化成1，然后用敲低组表达量或荧光强度分别除以平均数；图14a为ip实验鉴定敲低lmnb1和lmnb2的人神经元细胞质erv dna上cgas富集情况，图14b为elisa鉴定敲低lmnb1和lmnb2的人神经元上清液中2
’3’‑
cgamp的表达情况,图14c为免疫荧光染色鉴定敲低lmnb1和lmnb2的人神经元p-tbk1的表达情况,图14d为免疫荧光染色鉴定敲低lmnb1和lmnb2的人神经元rela的表达情况,图14e为bulk rna-seq分析鉴定敲低lmnb1和lmnb2的人神经元上调基因炎症通路富集情况。结果表明，与对照组相比，敲低lmnb1和lmnb2的人神经元细胞质erv dna上cgas富集显著增加(图14a)，敲低lmnb1和lmnb2的人神经元上清液中2
’3’‑
cgamp水平显著增加(图14b)，敲低lmnb1和lmnb2的人神经元p-tbk1阳性细胞比例显著增加(图14c)，敲低lmnb1和lmnb2的人神经元rela的荧光强度显著增加(图14d)，敲低lmnb1和lmnb2的人神经元上调基因炎症通路显著富集(图14e)。
[0310]
六、lmnb1和lmnb2缺陷的人神经元加速衰老
[0311]
将上述三得到的敲低lmnb1和lmnb2的人神经元进行如下sa-β-gal染色、elisa鉴定、免疫荧光染色、elisa鉴定，分别检测人神经元β半乳糖苷酶活性、人神经元上清液中aβ(1-40)的表达、人神经元上清液中aβ(1-40)的表达、人神经元aggresome的表达、人神经元上清液中il-6的表达。对照组为培养21天的人神经元样本。
[0312]
检测结果和定量结果见图15，图15中的涉及纵坐标为倍数的均为将对照的表达量取平均数后归一化成1，然后用敲低lmnb1和lmnb2组除以平均数即为倍数；图15a为sa-β-gal染色鉴定敲低lmnb1和lmnb2的人神经元β半乳糖苷酶活性，图15b为elisa鉴定敲低lmnb1和lmnb2的人神经元上清液中aβ(1-40)的表达情况,图15c为免疫荧光染色鉴定敲低lmnb1和lmnb2的人神经元aggresome的表达情况,图15d为elisa鉴定敲低lmnb1和lmnb2的人神经元上清液中il-6的表达情况。结果表明，与对照组相比，敲低lmnb1和lmnb2的人神经
元β半乳糖苷酶活性显著增加(图15a)，敲低lmnb1和lmnb2的人神经元上清液中aβ(1-40)水平显著增加(图15b)，敲低lmnb1和lmnb2的人神经元aggresome阳性细胞比例显著增加(图15c)，敲低lmnb1和lmnb2的人神经元上清液中il-6浓度显著增加(图15d)。表明，敲低lmnb1和lmnb2促进人神经元衰老和炎症，在本发明的实施例中，衰老的检测指标具体包括β半乳糖苷酶活性、aβ(1-40)表达量和aggresome表达量，炎症的检测指标具体包括il-6表达量。
[0313]
实施例4、以lmnb1和lmnb2作为干预靶点抑制erv或cgas通路的激活能够延缓人类神经元炎症和衰老
[0314]
一、lmnb1和lmnb2缺陷的人神经元中sirna介导的erv，cgas或sting的敲低效率检测
[0315]
人神经元来源于实施例3的三获得的敲低lmnb1和lmnb2的人神经元，在lmnb1和lmnb2缺陷的人神经元基础上敲除erv，cgas或stin，具体如下：
[0316]
特异性靶向ervs、cgas或sting的mrna的sirna分子购自riobio(中国)。sirna的序列如表4所示。具体如下：当lmnb1和lmnb2缺陷的人神经元培养9天和15天时，按照制造商的说明，使用lipofectamine 3000转染试剂(thermo fisher scientific)用针对erv、cgas或sting的nc或sirna双链体转染神经元。当转染后hneuron培养21天时，收集样本，得到敲除ervs、cgas或sting的神经元样本，进行免疫荧光或qrt-pcr，分别检测erv的rna表达、erv-env的蛋白表达、敲低cgas后cgas的rna表达情、敲低cgas后cgas的蛋白表达、敲低sting后sting的rna表达和敲低sting后sting的蛋白表达。对照组为实施例3的三获得的敲低lmnb1和lmnb2的人神经元。
[0317]
检测结果和定量结果见图16，图16中的涉及纵坐标为倍数的均为将对照的表达量或荧光强度取平均数后归一化成1，然后用各个敲低组表达量或荧光强度除以平均数即为倍数；图16a为qrt-pcr鉴定敲低lmnb1和lmnb2的人神经元进一步敲低erv后erv的rna表达情况，图16b为免疫荧光染色鉴定敲低lmnb1和lmnb2的人神经元进一步敲低erv后erv-env的蛋白表达情况，图16c为qrt-pcr鉴定敲低lmnb1和lmnb2的人神经元进一步敲低cgas后cgas的rna表达情况，图16d为免疫荧光染色鉴定敲低lmnb1和lmnb2的人神经元进一步敲低cgas后cgas的蛋白表达情况,图16e为qrt-pcr鉴定敲低lmnb1和lmnb2的人神经元进一步敲低sting后sting的rna表达情况，图16f为免疫荧光染色鉴定敲低lmnb1和lmnb2的人神经元进一步敲低sting后sting的蛋白表达情况。结果表明，与对照组相比，敲低erv的人神经元erv的rna表达显著降低(图16a)，erv-env的蛋白表达显著降低(图16b)，敲低cgas的人神经元cgas的rna表达显著降低(图16c)，cgas的蛋白表达显著降低(图16d)，敲低sting的人神经元sting的rna表达显著降低(图16e)，sting的蛋白表达显著降低(图16f)。
[0318]
二、lmnb1和lmnb2缺陷的人神经元中抑制erv或cgas通路的激活能够延缓人类神经元的炎症和衰老
[0319]
将上述一获得的敲除ervs、cgas或sting的神经元样本进行qrt-pcr鉴定、sa-β-gal染色鉴定、β半乳糖苷酶活性、aβ(4g8)表达情况、aggresome表达情况。对照组为实施例3的三获得的敲低lmnb1和lmnb2的人神经元。
[0320]
检测结果和定量结果见图17，图17中的涉及纵坐标为倍数均为将对照的表达量或荧光强度取平均数后归一化成1，然后用敲低组表达量或荧光强度除以平均数即为倍数；图17a和b为免疫荧光染色敲低lmnb1和lmnb2的人神经元进一步敲低erv，cgas或sting后rela
的表达情况，图17c为qrt-pcr鉴定敲低lmnb1和lmnb2的人神经元进一步敲低erv，cgas或sting后il-6的rna表达情况，图17d和e为sa-β-gal染色鉴定敲低lmnb1和lmnb2的人神经元进一步敲低erv，cgas或sting后β半乳糖苷酶活性，图17f和g为免疫荧光染色鉴定敲低lmnb1和lmnb2的人神经元进一步敲低erv，cgas或sting后aβ(4g8)表达情况，图17h和i为免疫荧光染色鉴定敲低lmnb1和lmnb2的人神经元进一步敲低erv，cgas或sting后aggresome表达情况。结果表明，与对照组相比，敲低erv，cgas或sting的人神经元rela表达显著降低(图17a和b)，il-6的rna表达显著降低(图17c)，β半乳糖苷酶活性显著降低(图17d和e)，aβ(4g8)表达显著降低(图17f和g)，aggresome表达显著降低(图17h和i)。
[0321]
上述结果表明erv，cgas或sting的抑制剂(sirna)能够延缓人类神经元的炎症和衰老，在本发明的实施例中，炎症的检测指标具体包括rela和il-6表达量，衰老的检测指标具体包括β半乳糖苷酶活性、aβ(4g8)表达量和aggresome表达量。。
[0322]
实施例5、逆转录酶抑制剂阿巴卡韦治疗能够延缓长期培养的人类神经元和老年小鼠额叶的炎症和衰老
[0323]
一、阿巴卡韦治疗的人神经元中erv基因组dna含量的检测
[0324]
长时间培养神经元细胞：将人神经元在sdnm培养基培养18天(培养当天记作第一天)，再向培养基中添加终浓度为1μm的阿巴卡韦(selleckchem)继续培养至35天。
[0325]
lmnb1和lmnb2敲低的神经元：采用转染3次(第一次转染记作第0天)的lmnb1和lmnb2敲低的神经元细胞，在第三次转染后添加终浓度为1μm的阿巴卡韦孵育细胞，培养至21天。
[0326]
每次更换培养基时都将阿巴卡韦新鲜加入培养基中，直到在指定的时间点进行分析。以不添加阿巴卡韦作为加药对照组。
[0327]
1)、阿巴卡韦治疗的神经元基因组dna提取
[0328]
1、用accumax(millipore)酶促收获人类神经元，并在室温下以12000
×
g离心5分钟；
[0329]
2、使用组织细胞dna提取试剂盒，加200ul缓冲液ga至装有细胞团的离心管中，振荡至彻底悬浮；
[0330]
3、加入20ul proteinase k溶液混匀，56℃放置至细胞团溶解，简短离心以去除管内壁水珠；
[0331]
4、加入200ul缓冲液gb，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管内壁水珠；
[0332]
5、加入200ul无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管内壁水珠；
[0333]
6、将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱cb3中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱cb3放回收集管中；
[0334]
7、向吸附柱cb3中加入500ul缓冲液gd(使用前加入无水乙醇)，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱cb3放回收集管中；
[0335]
8、向吸附柱cb3中加入600ul漂洗液pw(使用前加入无水乙醇)，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱cb3放回收集管中；
[0336]
9、重复操作步骤8；
[0337]
10、将吸附柱cb3放回收集管中，12000rpm离心2分钟，倒掉废液，将吸附柱cb3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；
[0338]
11、将吸附柱cb3转入一个干净的离心管，向吸附膜中间部位悬空滴加100ul洗脱缓冲液te，室温放置5分钟，12000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中。
[0339]
对照组：不加入阿巴卡韦的各个神经元样本。
[0340]
2)、qpcr检测阿巴卡韦治疗的神经元erv基因组dna含量
[0341]
1、测定6个样品的dna浓度，然后均稀释至相同的浓度；
[0342]
2、qpcr检测，验证erv基因组dna含量。
[0343]
上述qpcr检测的引物见表4，内参选用5s rrna：
[0344]
3、用上述实时荧光定量pcr引物进行qpcr扩增，放置于荧光定量pcr仪反应。
[0345]
qpcr结果来自三个独立重复孔的阿巴卡韦治疗的神经元和对照处理的神经元样本。定量结果见图18，纵坐标为erv dna含量(倍数)，为将对照的erv dna含量取平均数后归一化成1，然后用阿巴卡韦组erv dna含量除以平均数即为倍数；。结果表明，与加药对照组相比，阿巴卡韦治疗的神经元中erv基因组dna含量显著降低。
[0346]
二、阿巴卡韦治疗的神经元中炎症因子表达的检测
[0347]
1)、阿巴卡韦治疗的神经元rna的提取
[0348]
1、6孔板培养的经过阿巴卡韦治疗的人神经元每孔加入1ml trizol，吹打融化混匀，室温静至至少5分钟充分裂解；
[0349]
2、加入200ul氯仿(chcl3)，盖上ep管盖，上下摇晃充分混匀15秒，室温静至15分钟，4℃12000
×
g离心15分钟；
[0350]
3、取新的ep管，每管加入500ul异丙醇，吸取步骤2的上层水相加入异丙醇中，颠倒混匀15秒，室温静至10分钟，4℃12000
×
g离心10分钟；
[0351]
4、缓慢倾斜倒掉异丙醇，加入1ml预冷的用rnase free水配置的75％乙醇，盖上ep管盖，温和上下颠倒，4℃12000
×
g离心5分钟；
[0352]
5、尽量去净乙醇，开盖晾5分钟；
[0353]
6、加20ul rnase free水，吹打混匀10次，吸2ul用于测浓度，继续反转录或-80℃保存；
[0354]
2)、阿巴卡韦治疗的神经元rna反转录成cdna
[0355]
1、rna反转录成cdna反应体系如下表5；
[0356]
表5为反转录体系1
[0357]
组分体积/质量rna2μgrandom primers1μloligo(dt)
15
primers1μlnuclease-free waterto 10μl
[0358]
2、将上述模版rna与引物放入pcr仪，70℃，5min变性，完成后立即置于冰上；
[0359]
3、配制反转录混合液，向每个样品管加10μl混合液，配方如下表6：
[0360]
表6为反转录混合体系2
[0361]
组分体积
nuclease-free water1.6μlgoscript
tm 5x reaction buffer4μlmgcl2(25mm)2μlpcr nucleotide mix1μlrecombinant rnasin ri0.4μlgoscript reverse transcriptase1μl
[0362]
4、设置反转录程序，退火-延伸-逆转录酶失活，放入pcr仪，完成后得到cdna；反应程序为如下表7:
[0363]
表7为反转录程序
[0364]
步骤温度时间125℃6min242℃80min370℃15min44℃∞
[0365]
3)、实时荧光定量pcr
[0366]
1、在primerbank上查找目的基因的引物序列并合成引物，将引物溶于ddh2o中。
[0367]
实时荧光定量pcr引物序列如下所示：
[0368][0369]
2、以cdna为模板，用ddh2o稀释10倍，用上述实时荧光定量pcr引物进行rt-qpcr扩增，放置于荧光定量pcr仪反应。
[0370]
上述反应体系如下表8；
[0371]
表8为rt-qpcr体系
[0372][0373]
上述反应程序为表9；
[0374]
表9为rt-qpcr程序
[0375][0376][0377]
qpcr结果来自三个独立重复孔的阿巴卡韦治疗的神经元和对照处理的神经元样本。阿巴卡韦治疗的神经元中il6、il8和ifng的mrna表达量结果如图19所示，图19中的涉及纵坐标为倍数的均为将对照转录本表达量取平均数后归一化成1，然后用阿巴卡韦组转录本表达量除以平均数即为倍数；结果表明，与加药对照组相比，阿巴卡韦治疗的神经元中炎症标志物il6、il8和ifng的mrna表达量降低。
[0378]
三、阿巴卡韦给药小鼠额叶p-tbk1表达的检测
[0379]
为了评估长期口服阿巴卡韦对衰老小鼠fl变性的影响，每天用3ml溶于含0.4％二甲基亚砜的饮用水中的阿巴卡韦水溶液(阿巴卡韦终浓度为1mg/ml)饲喂18个月大的雄性小鼠，以饮用水中的0.4％二甲基二亚砜作为对照(每组n＝5只小鼠)。经过12个月的阿巴卡韦治疗后，将小鼠麻醉，然后通过心脏系统灌注生理盐水。用4％pfa固定脑组织，用于随后的分析。
[0380]
用免疫荧光染色方法检测阿巴卡韦给药小鼠的额叶神经元p-tbk1的表达。
[0381]
阿巴卡韦给药小鼠的额叶神经元p-tbk1的检测和定量结果见图20，图20中的涉及纵坐标为倍数均为将对照表达量取平均数后归一化成1，然后用阿巴卡韦组表达量除以平均数即为倍数；结果表明，与对照组相比，阿巴卡韦给药小鼠的额叶神经元中p-tbk1阳性的神经元比例显著降低。
[0382]
四、阿巴卡韦治疗的神经元和阿巴卡韦给药小鼠额叶β-amyloid(4g8)表达的检测
[0383]
将上述一得到的阿巴卡韦治疗的神经元和上述三得到的阿巴卡韦给药小鼠的额叶进行额叶神经元β-amyloid(4g8)的检测。
[0384]
以不进行阿巴卡韦治疗的神经元和不给药的小鼠的额叶分别作为对照组。
[0385]
阿巴卡韦治疗的神经元和阿巴卡韦给药小鼠的额叶神经元β-amyloid(4g8)的检测和定量结果见图21，图21中的涉及纵坐标为倍数均为将对照表达量取平均数后归一化成1，然后用阿巴卡韦组表达量除以平均数即为倍数；图21a为免疫荧光染色鉴定阿巴卡韦治疗的神经元β-amyloid(4g8)的表达和定位情况，图21b为免疫荧光染色鉴定阿巴卡韦给药小鼠的额叶神经元β-amyloid(4g8)的表达和定位情况，结果表明，与对照组相比，阿巴卡韦治疗的神经元和阿巴卡韦给药小鼠额叶神经元中衰老标志物β-amyloid(4g8)阳性的细胞比例显著降低。
[0386]
五、阿巴卡韦治疗的神经元和阿巴卡韦给药小鼠额叶衰老标志物aggresome表达的检测
[0387]
将上述一得到的阿巴卡韦治疗的神经元和上述三得的阿巴卡韦给药小鼠的额叶
进行神经元aggresome的检测和定量。
[0388]
以不进行阿巴卡韦治疗的神经元和不给药的小鼠的额叶分别作为对照组。
[0389]
阿巴卡韦治疗的神经元和阿巴卡韦给药小鼠的额叶神经元aggresome的检测和定量结果见图22，图22中的涉及纵坐标为倍数均为将对照表达量取平均数后归一化成1，然后用阿巴卡韦组表达量除以平均数即为倍数；图22a为免疫荧光染色鉴定阿巴卡韦治疗的神经元aggresome的表达和定位情况，图22b为免疫荧光染色鉴定阿巴卡韦给药小鼠的额叶神经元aggresome的表达和定位情况，结果表明，与对照组相比，阿巴卡韦治疗的神经元和阿巴卡韦给药小鼠额叶神经元中aggresome阳性的细胞比例显著降低。

技术特征：
1.检测erv激活或/和其激活的下游cgas-sting天然免疫信号通路相关蛋白表达量的物质在如下a1-a6中的应用：a1)检测额叶的衰老程度；a2)检测神经元的衰老程度；a3)评估或预测额叶功能退行或衰老导致的相关疾病；a4)制备检测额叶衰老程度的产品；a5)制备检测神经元衰老程度的产品；a6)制备评估或预测额叶功能退行或衰老导致的相关疾病的产品。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述erv激活通过如下至少一种体现：erv的dna甲基化水平、erv的rna表达水平、erv-env的表达量、erv基因组dna含量和erv样颗粒含量；所述erv激活的下游cgas-sting天然免疫信号通路相关蛋白表达量通过如下至少一种体现：cgas在细胞质erv dna上富集量、2
’3’‑
cgamp含量和p-tbk1表达量。3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述额叶或神经元来源于人或灵长类动物。4.根据权利要求1-3中所述的应用，其特征在于：所述检测erv激活或/和其激活的下游cgas-sting天然免疫信号通路相关蛋白表达量的物质为如下至少一种：b1、检测erv的dna甲基化水平的物质；b2、检测erv的rna表达水平的物质；b3、检测erv-env的表达量的物质；b4、检测erv基因组dna含量的物质；b5、检测erv样颗粒含量的物质；b6、检测cgas在细胞质erv dna上富集量的物质；b7、检测2
’3’‑
cgamp含量的物质；b8、检测p-tbk1表达量的物质。5.一种产品，其包括权利要求1-4任一中所述检测erv激活或/和其激活的下游cgas-sting天然免疫信号通路相关蛋白表达量的物质；所述产品具有如下至少一种功能：a1)检测额叶的衰老程度；a2)检测神经元的衰老程度；a3)评估或预测额叶功能退行或衰老导致的相关疾病。6.erv或/和其激活的下游cgas-sting天然免疫信号通路相关蛋白表达的抑制剂在如下至少一种中的应用：c1、制备治疗额叶衰老或退行引发疾病的产品；c2、制备延缓神经元或额叶衰老的产品；c3、制备延缓神经元细胞炎症的产品；c4、制备降低神经元的炎症因子表达的产物。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：
所述抑制剂为抑制erv活性的药物或sirna，或/和抑制erv激活的下游cgas-sting天然免疫信号通路相关蛋白表达的sirna；进一步地，所述药物为反转录酶抑制剂。8.激活erv的激活剂在如下至少一种中的应用：d1、制备加速额叶衰老或退行疾病的产品；d2、制备加速额叶或神经元衰老的产品；d3、制备诱导神经元天然免疫反应激活的产品；d4、制备增加神经元的炎症因子表达量的产品。

技术总结
本发明公开了ERV及其下游信号通路蛋白作为神经元衰老标志物及其在干扰神经元衰老中的应用。本发明提供了检测ERV激活或/和其激活的下游cGAS-STING天然免疫信号通路相关蛋白表达量的物质在如下应用：A1)检测额叶的衰老程度；A2)检测神经元的衰老程度；A3)评估或预测额叶功能退行或衰老导致的相关疾病；A4)制备检测额叶衰老程度的产品；A5)制备检测神经元的衰老程度的产品；A6)制备评估或预测额叶功能退行或衰老导致的相关疾病的产品；本发明的实验证明了，利用上述标志物可以评估脑衰老相关疾病，还可以检测人类脑功能等。还可以检测人类脑功能等。


技术研发人员：刘光慧 曲静 张维绮 王思 张慧 李嘉明
受保护的技术使用者：北京干细胞与再生医学研究院
技术研发日：2023.05.26
技术公布日：2023/9/6