miR-30d-5p抑制物在制备神经干细胞促分化药物中的应用

30d-5p抑制物分化培养72小时的dcx免疫荧光实验结果，hoechst染核，标尺=25微米； b为dcx阳性神经元前体细胞比例的统计（均值
±
标准差，a vs. control group，p《0.001；b vs.mir-nc group，p《0.001）。
9.图2为分化培养后map-2免疫荧光检测结果。其中：a为神经干细胞转染mir-nc或mir-30d-5p抑制物分化培养7天的map-2免疫荧光实验结果，hoechst染核，标尺=25微米； b为map-2阳性成熟神经元比例的统计（均值
±
标准差，a vs. control group，p《0.001；b vs.mir-nc group，p《0.001）。
实施方式
10.下面将结合实施例对本发明的进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
11.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
12.下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
13.本实施例的体外神经干细胞向神经元分化实验使用大鼠胚胎神经干细胞。
14.本实施例采用mirna抑制物对mir-30d-5p的表达进行下调，以mir-nc作为对照，将携带有mir-30d-5p抑制物和对照mir-nc的慢病毒分别感染神经干细胞后进行筛选，得到稳定低表达和正常表达mir-30d-5p的神经干细胞系，体外分化培养，观察两种情况下神经元分化情况。
15.具体过程如下：1. 神经干细胞培养和mirna抑制物转染1) 神经干细胞系来自赛默飞世尔科技有限公司的gibco rat fetal neural stem cells，培养在5% co2的37℃培养箱中，培养液为加入egf和bfgf（终浓度均为20 ng/ml）和1%青霉素/链霉素的dmem（gibco公司）。
16.2) mir-30d-5p抑制物来自赛默飞世尔科技有限公司，细胞转染利用invitrogen的lipofectamine rnaimax转染试剂，转染步骤按照说明书操作，mirna抑制物浓度为5纳摩/升。
17.2. 分化培养及dcx和map-2免疫荧光检测1) 分化培养实验：将神经干细胞及转染mirna抑制物的神经干细胞以1
×
105个/ml的密度接种于预先置入涂有多聚赖氨酸盖玻片的24孔培养板各孔中，加入含10%fbs的dmem/f12完全培养液1 ml。将24孔培养板置于饱和湿度的37℃、5% co2培养箱中培养，3天后进行dcx免疫荧光检测，7天后进行map-2免疫荧光检测。
18.2) dcx免疫荧光检测：在培养3 d后，取上述各组6孔细胞，吸去培养孔中的培养液，加入含4%多聚甲醛的0.01 mol/l pbs (ph7.2) 1 ml，室温下固定15 min。吸去多聚甲醛，用pbs清洗3遍，每孔加入200
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l含10%山羊血清的pbs，室温下轻轻振摇30 min。吸去上述封闭液，加入1:1000稀释的豚鼠抗dcx 200
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l（abcam公司），室温下轻轻振摇1 h后放入4℃冰箱中过夜。次日晨吸去一抗，用pbs清洗3遍后，加入1:800稀释的alexa fluor
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羊抗豚鼠二抗（abcam公司），避光、室温下轻轻振摇2 h，用pbs清洗3遍后，加入1:2000稀释的hoechst（abcam公司）室温避光孵育30 min，pbs充分清洗后甘油磷酸缓冲液封片，荧光显微镜下观察dcx免疫荧光情况。
19.3) map-2免疫荧光检测：在培养7 d后，取上述各组6孔细胞，吸去培养孔中的培养液，加入含4%多聚甲醛的0.01 mol/l pbs (ph7.2) 1 ml，室温下固定15 min。吸去多聚甲醛，用pbs清洗3遍，每孔加入200
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l含10%山羊血清的pbs，室温下轻轻振摇30 min。吸去上述封闭液，加入1:1000稀释的兔抗map-2 200
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l（abcam公司），室温下轻轻振摇1 h后放入4℃冰箱中过夜。次日晨吸去一抗，用pbs清洗3遍后，加入1:800稀释的alexa fluor
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488山羊抗兔二抗（abcam公司），避光、室温下轻轻振摇2 h，用pbs清洗3遍后，加入1:2000稀释的hoechst（abcam公司）室温避光孵育30 min，pbs充分清洗后甘油磷酸缓冲液封片，荧光显微镜下观察map-2免疫荧光情况。
20.3. 统计学处理应用spss 21.0数据统计软件对数据进行分析。所得计量资料用均值
±
标准差表示，三组间两两比较采用单因素方差分析。以p＜0.05认为差异有统计学意义。
21.结果如图1、2所示，与空白对照组和mir-nc组比较，神经干细胞转染mir-30d-5p抑制物后，向dcx阳性神经元前体细胞和map-2阳性成熟神经元分化数量明显增多，单因素方差分析结果显示，组间差异有统计学意义（p＜0.05）。a vs. control group，p＜0.001；b vs. mir-nc group，p＜0.001。


技术特征：
1. mir-30d-5p在筛选促进神经干细胞向神经元分化的药物中的应用。2. mir-30d-5p抑制物在制备促进神经干细胞向神经元分化的药物中的应用。

技术总结
本发明公开了miR-30d-5p抑制物在制备神经干细胞促分化药物中的应用，属于生物医药技术领域。本发明采用miRNA抑制物对miR-30d-5p的表达进行下调，以miR-NC作为对照，将携带有miR-30d-5p抑制物和对照miR-NC的慢病毒分别感染神经干细胞后进行筛选，得到稳定低表达和正常表达miR-30d-5p的神经干细胞系，体外分化培养，观察两种情况下神经元的分化情况。结果显示，低表达miR-30d-5p能明显促进神经干细胞向神经元分化，miR-30d-5p抑制物在体外能促进神经干细胞向神经元分化（P<0.05）。神经干细胞向神经元分化（P<0.05）。神经干细胞向神经元分化（P<0.05）。


技术研发人员：陆健花 衣昕
受保护的技术使用者：南通大学
技术研发日：2023.05.25
技术公布日：2023/9/6