一种厌氧氨氧化颗粒污泥长期低温保藏后的复苏方法

1.本发明属于微生物保藏及复苏技术领域，具体涉及一种厌氧氨氧化颗粒污泥长期低温保藏后的复苏方法。


背景技术：

2.厌氧氨氧化(anaerobic ammonium oxidation，anammox)技术是指在厌氧条件下厌氧氨氧化菌(anaerobic ammonium oxidation bacteria，anaob)以亚硝氮为电子受体将氨氮转化为氮气的一种新型生物脱氮技术。与传统硝化-反硝化工艺相比，anammox工艺具有容积去除率高、成本低等优点，备受业内青睐。
3.然而，由于anaob倍增时间长达半月甚至数月，导致工程反应器中的厌氧氨氧化颗粒污泥(anammox granular sludge,angs)生长缓慢，此外在工程启动、运行崩溃等多种工况下均需投加大量angs，导致工程中angs常常供不应求，通过保藏angs，为后续工程应用提供“储备库”是解决手段之一。现有研究表明，4℃低温保藏是长期保藏angs的有效手段，在长期保藏过程中，angs中的anaob大多进入休眠状态。如何快速复苏angs是目前应用中亟需解决的技术问题。。
4.现有关于angs的复苏大多通过添加氨氮、亚硝氮等基础进水基质营养物质，angs的脱氮活性恢复缓慢，甚至长达数月。anaob是化能自养型微生物，co2固定生成有机物是支撑后续代谢活动的物质基础。叶酸是介导anaob二氧化碳固定途径(wood
–
ljungdahl pathway)中甲基转移所必需的生长因子，固定途径的8步中有4步涉及叶酸及其衍生物。然而，基因组学的研究表明anaob属叶酸合成缺陷型微生物，自身无法合成叶酸，需伴生菌提供。而经长期低温保藏后，angs中存活的微生物大多处于休眠状态，伴生菌与anaob间互作微弱，在复苏起始阶段，通过添加叶酸为促进anaob代谢恢复，加速angs快速复苏提供了新方法。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于解决现有技术中厌氧氨氧化颗粒污泥(angs)长期低温保藏后脱氮活性恢复慢的问题，并提供一种厌氧氨氧化颗粒污泥长期低温保藏后的复苏方法。该方法通过在复苏体系中添加厌氧氨氧化菌(anaob)的限制性生长因子叶酸，添加后能在复苏前期明显提高angs脱氮活性以及活细胞比例的恢复。
6.为了实现上述发明目的，本发明所采用的具体技术方案如下：
7.本发明提供一种厌氧氨氧化颗粒污泥长期低温保藏后的复苏方法，具体步骤如下：
8.s1、将长期低温保藏的厌氧氨氧化颗粒污泥置于室温环境，待所述厌氧氨氧化颗粒污泥恢复室温后，用磷酸盐缓冲液冲洗去除厌氧氨氧化颗粒污泥表面残留的缓冲剂后转移至复苏容器中；
9.s2、所述复苏容器中加入含营养物质的模拟废水和生长因子叶酸构成复苏体系；
对所述复苏体系进行曝气除氧处理，待复苏体系达到缺氧状态后将复苏容器密封；
10.s3、将密封后的复苏容器置于恒温震荡培养环境中进行复苏培养；所述复苏培养过程定时更换含营养物质的模拟废水和叶酸，保证复苏培养过程中厌氧氨氧化颗粒污泥获得充足营养物质和生长因子；待厌氧氨氧化颗粒污泥的脱氮活性和活细胞的比例恢复至指定水平后，完成复苏。
11.本实施例中所述的长期低温保藏厌氧氨氧化颗粒污泥，指的是在低温环境中保藏3个月以上的厌氧氨氧化颗粒污泥。
12.作为优选，所述厌氧氨氧化颗粒污泥的浓度为1.2～1.5gvss/l。
13.作为优选，所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.1m，ph值为7.5。所述磷酸盐缓冲液冲洗的次数为3～5次。
14.作为优选，所述复苏体系中厌氧氨氧化颗粒污泥与含营养物质的模拟废水的体积比为1:(40～50)。
15.作为优选，所述复苏体系中叶酸浓度为0.1～1μm。
16.作为优选，所述的复苏容器为厌氧血清瓶。
17.作为优选，所述曝气除氧处理通入的气体为含有95％ ar和5％ co2的混合气体，曝气除氧处理的时长为10～15min。
18.作为优选，所述缺氧状态为复苏体系内溶解氧浓度＜0.2mg/l。
19.作为优选，所述含营养物质的模拟废水的组分包括：(nh4)2so
4 0.24g/l、nano
2 0.25g/l、nahco
3 0.8g/l、khco
3 0.24g/l、kh2po
4 0.0175g/l、cacl20.0175g/l、mgso4·
7h2o 0.3g/l、微量元素i浓缩液1ml/l、微量元素ii浓缩液1ml/l。
20.进一步的，所述微量元素i浓缩液的组分包括edta 5g/l和feso
4 5g/l。
21.进一步的，所述微量元素ii浓缩液的组分包括znso4·
7h2o 0.43g/l、cocl2·
6h2o 0.24g/l、mncl2·
4h2o 0.99g/l、cuso4·
5h2o 0.25g/l、namoo4·
2h2o0.22g/l、nicl2·
6h2o 0.19g/l、naseo4·
10h2o 0.21g/l和h3bo
4 0.014g/l。
22.作为优选，所述复苏培养过程在避光条件下进行，时间为8～12天。所述恒温震荡培养环境条件为：培养温度30℃，震荡速率150rpm/min。
23.作为优选，复苏培养过程每隔2天更换含营养物质的模拟废水和叶酸。
24.本发明相对于现有技术而言，具有以下有益效果：
25.本发明在长期低温保藏后的angs复苏过程中添加anaob的限制性生长因子叶酸，加速恢复anaob的代谢活动。相比目前仅添加营养物质的复苏过程，本发明提供的复苏方法能更好地促进厌氧氨氧化颗粒污泥脱氮活性和活细胞比例的恢复。
具体实施方式
26.为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。本发明各个实施例中的技术特征在没有相互冲突的前提下，均可进行相应组合。
27.实施例1
28.本实施例提供一种添加叶酸浓度为0.1μm的厌氧氨氧化颗粒污泥长期低温保藏后的复苏方法，具体步骤如下：
29.(1)将实验室4℃低温保藏150d的厌氧氨氧化颗粒污泥(angs)取出，置于室温环境12h后使angs恢复室温；之后用磷酸盐缓冲液(0.1m,ph＝7.5)冲洗3～5次后去除厌氧氨氧化颗粒污泥保藏过程中的缓冲剂等，自然沉降滗水完成清洗，转移10g冲洗后的angs至厌氧血清瓶；
30.(2)向厌氧血清瓶中加入500ml含营养物质的模拟废水，再外加0.1μm叶酸构成复苏体系；上述复苏体系中通入含有95％ ar和5％ co2的混合气体进行曝气除氧处理10min后，除去氧气；待复苏体系内溶解氧浓度＜0.2mg/l后将厌氧血清瓶的瓶口用丁基橡胶塞塞紧，加铝盖密封；
31.上述含营养物质的模拟废水的组分包括：(nh4)2so
4 0.24g/l、nano
2 0.25g/l、nahco
3 0.8g/l、khco
3 0.24g/l、kh2po
4 0.0175g/l、cacl
2 0.0175g/l、mgso4·
7h2o 0.3g/l、微量元素i浓缩液1ml/l、微量元素ii浓缩液1ml/l；所述微量元素i浓缩液的组分包括edta 5g/l和feso
4 5g/l；所述微量元素ii浓缩液的组分包括znso4·
7h2o 0.43g/l、cocl2·
6h2o 0.24g/l、mncl2·
4h2o0.99g/l、cuso4·
5h2o 0.25g/l、namoo4·
2h2o 0.22g/l、nicl2·
6h2o 0.19g/l、naseo4·
10h2o 0.21g/l和h3bo
4 0.014g/l。
32.(3)将密封后的厌氧血清瓶转移至恒温震荡培养箱，条件设置为30℃、150rpm/min进行避光培养8天。复苏培养过程每隔2天更换含营养物质的模拟废水和叶酸。
33.本实施例中，经上述步骤(1)～(3)得到了经0.1μm叶酸处理后复苏的angs。
34.实施例2
35.本实施例提供一种添加叶酸浓度为1μm的厌氧氨氧化颗粒污泥长期低温保藏后的复苏方法，具体步骤如下：
36.(1)将实验室4℃低温保藏150d的厌氧氨氧化颗粒污泥(angs)取出，置于室温环境12h后使angs恢复室温；之后用磷酸盐缓冲液(0.1m,ph＝7.5)冲洗3～5次后去除厌氧氨氧化颗粒污泥保藏过程中的缓冲剂等，自然沉降滗水完成清洗，转移10g冲洗后的angs至厌氧血清瓶；
37.(2)向厌氧血清瓶中加入500ml含营养物质的模拟废水，再外加1μm叶酸构成复苏体系；上述复苏体系中通入含有95％ ar和5％ co2的混合气体进行曝气除氧处理10min后，除去氧气；待复苏体系内溶解氧浓度＜0.2mg/l后将厌氧血清瓶的瓶口用丁基橡胶塞塞紧，加铝盖密封；
38.上述含营养物质的模拟废水的组分包括：(nh4)2so
4 0.24g/l、nano
2 0.25g/l、nahco
3 0.8g/l、khco
3 0.24g/l、kh2po
4 0.0175g/l、cacl
2 0.0175g/l、mgso4·
7h2o 0.3g/l、微量元素i浓缩液1ml/l、微量元素ii浓缩液1ml/l；所述微量元素i浓缩液的组分包括edta 5g/l和feso
4 5g/l；所述微量元素ii浓缩液的组分包括znso4·
7h2o 0.43g/l、cocl2·
6h2o 0.24g/l、mncl2·
4h2o0.99g/l、cuso4·
5h2o 0.25g/l、namoo4·
2h2o 0.22g/l、nicl2·
6h2o 0.19g/l、naseo4·
10h2o 0.21g/l和h3bo
4 0.014g/l。
39.(3)将密封后的厌氧血清瓶转移至恒温震荡培养箱，条件设置为30℃、150rpm/min进行避光培养8天。复苏培养过程每隔2天更换含营养物质的模拟废水和叶酸。
40.本实施例中，经上述步骤(1)～(3)得到了经1μm叶酸处理后复苏的angs。
41.对比例1
42.本对比例提供一种不添加叶酸的厌氧氨氧化颗粒污泥长期低温保藏后的复苏方法，具体步骤如下：
43.(1)将实验室4℃低温保藏150d的厌氧氨氧化颗粒污泥(angs)取出，置于室温环境12h后使angs恢复室温；之后用磷酸盐缓冲液(0.1m,ph＝7.5)冲洗3～5次后去除厌氧氨氧化颗粒污泥保藏过程中的缓冲剂等，自然沉降滗水完成清洗，转移10g冲洗后的angs至厌氧血清瓶；
44.(2)向厌氧血清瓶中加入500ml含营养物质的模拟废水，再外加与实施例1中叶酸体积等量的蒸馏水构成复苏体系；上述复苏体系中通入含有95％ ar和5％co2的混合气体进行曝气除氧处理10min后，除去氧气；待复苏体系内溶解氧浓度＜0.2mg/l后将厌氧血清瓶的瓶口用丁基橡胶塞塞紧，加铝盖密封；
45.上述含营养物质的模拟废水的组分包括：(nh4)2so
4 0.24g/l、nano
2 0.25g/l、nahco
3 0.8g/l、khco
3 0.24g/l、kh2po
4 0.0175g/l、cacl
2 0.0175g/l、mgso4·
7h2o 0.3g/l、微量元素i浓缩液1ml/l、微量元素ii浓缩液1ml/l；所述微量元素i浓缩液的组分包括edta 5g/l和feso
4 5g/l；所述微量元素ii浓缩液的组分包括znso4·
7h2o 0.43g/l、cocl2·
6h2o 0.24g/l、mncl2·
4h2o0.99g/l、cuso4·
5h2o 0.25g/l、namoo4·
2h2o 0.22g/l、nicl2·
6h2o 0.19g/l、naseo4·
10h2o 0.21g/l和h3bo
4 0.014g/l。
46.(3)将密封后的厌氧血清瓶转移至恒温震荡培养箱，条件设置为30℃、150rpm/min进行避光培养8天。复苏培养过程每隔2天更换含营养物质的模拟废水和叶酸。
47.本对比例中，经上述步骤(1)～(3)得到了不添加叶酸处理后复苏的angs。
48.最终，实施例1、实施例2和对比例1的对比结果如下：
49.从angs脱氮活性恢复来看：复苏起始，实施例1、2与对比例1的angs脱氮比活性分别为160.7
±
15.1、158.2
±
8.1和159.3
±
2.7mg-n/g-vss-d，复苏8天后，三组脱氮比活性分别为267.2
±
18.6、305.2
±
9.2和238.3
±
12.7mg-n/g-vss-d，实施例1和2分别比对比例1高12％和28％。该结果表明，复苏过程添加0.1和1μm叶酸能够明显促进angs脱氮活性的恢复。
50.从angs中活细胞比例恢复来看：复苏起始，实施例1、2与对比例1的angs中活细胞比例分别为59.2
±
3.6％、60.0
±
3.5％和63.0
±
4.7％，复苏8天后，三组活细胞比例分别为73.2
±
1.4％、75.5
±
2.2％和68.5
±
3.8％，实施例1和2中活细胞比例分别比对比例1高4.7％和7.0％，该结果表明，复苏过程添加0.1和1μm叶酸能够促进angs中活细胞比例的恢复。
51.理论上，经过长期低温保藏后的厌氧氨氧化颗粒污泥，在复苏过程中脱氮活性和活细胞比例会随着培养时间的增加而上升。本发明并不限定脱氮活性和活细胞比例达到什么水平即为复苏完成。在实际的应用中，厌氧氨氧化颗粒污泥的脱氮活性和活细胞比例水平，可根据后续使用的需求确定。
52.综上所述，本发明通过在angs长期低温保藏后的复苏过程添加叶酸，可有效提高angs脱氮活性和活细胞比例的恢复。为现有长期低温保藏后angs脱氮活性和活细胞恢复慢提供了一种解决方案。
53.以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，然其并非用以限制本发明。有关技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变
化和变型。因此凡采取等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

技术特征：
1.一种厌氧氨氧化颗粒污泥长期低温保藏后的复苏方法，其特征在于，具体步骤如下：s1、将长期低温保藏的厌氧氨氧化颗粒污泥置于室温环境，待所述厌氧氨氧化颗粒污泥恢复室温后，用磷酸盐缓冲液冲洗去除厌氧氨氧化颗粒污泥表面残留的缓冲剂后转移至复苏容器中；s2、向所述复苏容器中加入含营养物质的模拟废水和生长因子叶酸构成复苏体系；对所述复苏体系进行曝气除氧处理，待复苏体系达到缺氧状态后将复苏容器密封；s3、将密封后的复苏容器置于恒温震荡培养环境中进行复苏培养；所述复苏培养过程定时更换含营养物质的模拟废水和叶酸，保证复苏培养过程中厌氧氨氧化颗粒污泥获得充足营养物质和生长因子；待厌氧氨氧化颗粒污泥的脱氮活性和活细胞的比例恢复至指定水平后，完成复苏。2. 如权利要求1所述的一种厌氧氨氧化颗粒污泥长期低温保藏后的复苏方法，其特征在于，所述厌氧氨氧化颗粒污泥的浓度为1.2~1.5 gvss/l。3. 如权利要求1所述的一种厌氧氨氧化颗粒污泥长期低温保藏后的复苏方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.1 m，ph值为7.5；所述磷酸盐缓冲液冲洗的次数为3~5次。4.如权利要求1所述的一种厌氧氨氧化颗粒污泥长期低温保藏后的复苏方法，其特征在于，所述复苏体系中厌氧氨氧化颗粒污泥与含营养物质的模拟废水的体积比为1:（40~50）；所述复苏体系中叶酸浓度为0.1~1μm。5.如权利要求1所述的一种厌氧氨氧化颗粒污泥长期低温保藏后的复苏方法，其特征在于，所述的复苏容器为厌氧血清瓶。6. 如权利要求1所述的一种厌氧氨氧化颗粒污泥长期低温保藏后的复苏方法，其特征在于，所述曝气除氧处理通入的气体为含有95% ar和5% co2的混合气体；所述曝气除氧处理的时长为10~15 min。7.如权利要求1所述的一种厌氧氨氧化颗粒污泥长期低温保藏后的复苏方法，其特征在于，所述缺氧状态为复苏体系内溶解氧浓度＜0.2mg/l。8. 如权利要求1所述的一种厌氧氨氧化颗粒污泥长期低温保藏后的复苏方法，其特征在于，所述含营养物质的模拟废水的组分包括：(nh4)2so
4 0.24g/l、nano
2 0.25g/l、nahco
3 0.8g/l、khco
3 0.24 g/l、kh2po
4 0.0175 g/l、cacl
2 0.0175 g/l、mgso4·
7h2o 0.3 g/l、微量元素i浓缩液 1 ml/l、微量元素ii浓缩液 1 ml/l；所述微量元素i浓缩液的组分包括edta 5g/l和feso
4 5g/l；所述微量元素ii浓缩液的组分包括znso4·
7h2o 0.43g/l、cocl2·
6h2o 0.24g/l、mncl2·
4h2o 0.99g/l、cuso4·
5h2o 0.25g/l、namoo4·
2h2o 0.22g/l、nicl2·
6h2o 0.19g/l、naseo4·
10h2o 0.21g/l和h3bo
4 0.014g/l。9. 如权利要求1所述的一种厌氧氨氧化颗粒污泥长期低温保藏后的复苏方法，其特征在于，所述复苏培养过程在避光条件下进行，时间为8~12天；所述恒温震荡培养环境条件为：培养温度30℃，震荡速率150 rpm/min；优选的，复苏培养过程每隔2天更换含营养物质的模拟废水和叶酸。

技术总结
本发明公开了一种厌氧氨氧化颗粒污泥长期低温保藏后的复苏方法，属于微生物保藏及复苏技术领域。本发明通过在长期低温保藏后的厌氧氨氧化颗粒污泥复苏过程添加其缺陷性生长因子叶酸，可有效加速厌氧氨氧化颗粒污泥脱氮活性和活细胞比例的恢复。活性和活细胞比例的恢复。


技术研发人员：郑平 潘超
受保护的技术使用者：浙江大学
技术研发日：2023.03.13
技术公布日：2023/9/7