一种氯酚假节杆菌BJY-3及其在降解尼古丁中的应用的制作方法

一种氯酚假节杆菌bjy-3及其在降解尼古丁中的应用
技术领域
1.本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及一种氯酚假节杆菌bjy-3及其在高效降解尼古丁中的应用。


背景技术：

2.尼古丁（nicotine）是一种吡啶类生物碱，又称烟碱，化学结构名称为1-甲基-2-（3-吡啶基）-四氢吡咯烷，化学式为c
10h14
n2。其具有高毒性，可透过生物膜，化学结构稳定，并且是烟草特有致癌物质亚硝胺（tsnas）的重要前体物，存在于环境中不易降解，严重污染环境。能够与水以任意比例互溶，对人类生活及生态环境是一个极大的威胁。
3.尼古丁危害人体健康，也是造成人吸烟上瘾的主要原因。吸烟时，尼古丁可迅速被吸收至动脉血液循环中，并进入体内的其他组织，对人神经系统、心血管系统、呼吸系统产生影响。并且，尼古丁在人体肝脏中代谢产物包括可替宁、去甲烟碱和烟碱酸等，可明显增加人体患癌症的风险。同时，烟草种植业与烟草工业所产生的烟草废弃物中含有大量尼古丁，据不完全统计，每年约会产生300万吨烟草废弃物，其尼古丁含量约为3%~5%。这些尼古丁会随雨水沉降到土壤，对工业、种植业与环境造成巨大危害。
4.针对烟草行业产生的难以降解的烟碱类物质，自上世纪五十年代开始，科学家开始筛选可降解尼古丁的微生物，尤其是细菌，以期对提高烟草制品质量、减少环境危害提供微生物菌株资源。


技术实现要素：

5.为了解决上述问题，本发明旨在提供一株可以高效降解尼古丁的降解菌，该菌株可以利用尼古丁为碳氮源进行生长，以应用于降解烟草制品、烟草工业废弃物以及烟草种植地中的尼古丁，减少吸烟对人体健康的危害，降低烟草工业和种植业对环境的破坏。
6.一方面，本技术提供了一种氯酚假节杆菌菌株，所述菌株为氯酚假节杆菌（pseudarthrobacter chlorophenolicus）bjy-3，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no. 25122，保藏日期：2022年6月20日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
7.其中，本技术筛选获得的氯酚假节杆菌bjy-3为革兰氏阳性菌，其在lb固体培养基上菌落成淡黄色，圆形，表面光滑，不透明。
8.另一方面，本技术还提供了包含所述氯酚假节杆菌bjy-3的菌制剂。
9.可选的，本技术所述菌制剂可以是利用氯酚假节杆菌bjy-3制成的液体菌剂或固体菌剂，也可以是和其他可降解尼古丁或具有其他降解功能的菌株复配成的菌株组合物菌剂。
10.另一方面，本技术还提供了氯酚假节杆菌bjy-3菌株，和/或菌制剂在微生物降解尼古丁中的应用。
11.另一方面，本技术还提供了所述氯酚假节杆菌bjy-3菌株，和/或菌制剂在微生物
降解含有尼古丁的烟草制品、烟草工业废弃物和/或烟草种植地中的应用。
12.另一方面，本技术还提供了利用氯酚假节杆菌bjy-3菌株和/或菌制剂处理烟草制品和/或烟草工业废弃物获得的菌降解物。
13.另一方面，本技术还提供了一种微生物降解尼古丁的方法，包括利用所述的氯酚假节杆菌bjy-3菌株，和/或所述的菌制剂处理烟草制品、烟草工业废弃物和/或烟草种植地土壤的步骤。
14.在一种实施方式中，所述处理的方式包括：将所述菌株和/或所述微生物菌剂制成od值为2.0-3.0混悬液，喷施所述烟草制品或将所述烟草制品浸泡于所述混悬液中5~60秒后捞出。
15.在一种实施方式中，所述菌株和/或所述菌制剂的接种量为0.01%~20%。
16.在一种实施方式中，所述方法还包括处理后置于温度28℃~32℃、相对湿度20%~50%、氧气含量18%~25%下培养1~30天的步骤。
17.在一种实施方式中，所述烟草制品包括烟叶、复烤烟叶、烟草薄片、烟丝、卷烟、雪茄烟；所述烟草工业废弃物包括烟梗和烟末。
18.可以理解的是，本技术所述“烟丝”是指用烟叶、复烤烟叶、烟草薄片为原料加工成制成的丝、末、粒状商品。
19.另一方面，本技术还提供了所述的氯酚假节杆菌菌株bjy-3、所述的菌制剂、所述的菌降解物和/或所述的方法在制备可燃卷烟、加热不燃烧卷烟和/或烟油中的应用。
20.可选的，在制备可燃卷烟和/或加热不燃烧卷烟时，bjy-3菌株和/或菌制剂和/或菌降解物可应用的烟支部位包括但不限于：烟支的烟丝、滤嘴纤维丝束、卷烟纸、接口胶等。
21.可选的，所述烟油是电子烟和/或其他非燃烧类香烟产品的烟油。
22.在一种实施方式中，本技术所述菌株bjy-3的获得方法如下：采集烟草种植地土壤、烟草废弃物与烟草叶片、根、秸秆、花苞等生物材料，将其放入筛选培养基中培养获得含菌的培养液，将该培养液涂布于尼古丁无机盐固体培养基上，挑取长势旺盛菌株分离培养，以菌株16srdna判断菌株种属，并通过高效液相色谱法判断其是否具有尼古丁降解能力，最终筛选获得对尼古丁降解能力高的菌株。
23.本技术至少具有如下有益效果。
24.1、本技术筛选分离高效降解尼古丁菌株氯酚假节杆菌bjy-3，可以丰富降解尼古丁菌株资源，筛选高效降解尼古丁相关基因，为转基因烟草与工程菌株提供新的基因来源，提高烟草产品的质量，并且可以显著降低吸烟对人身体的危害。
25.2、本技术筛选获得的氯酚假节杆菌bjy-3，在尼古丁培养基、烟叶和烟丝中均显示出了很高的降解尼古丁的能力，可用于烟草制品的生产中，起到减少烟草制品中尼古丁的含量，进而减轻吸烟对身体的危害；同时该菌株还可以用于降解烟草制品生产中产生的含尼古丁废弃物，实现废物利用，提高烟草利用率，或者用于处理烟草种植地中的尼古丁，从而改善环境，避免尼古丁对环境及生态危害，具有重要的经济、社会和生态效益。
附图说明
26.此处所说明的附图用来提供对本技术的进一步理解，构成本技术的一部分，本技术的示意性实施例及其说明用于解释本技术，并不构成对本技术的不当限定。
27.图1是bjy-3菌体在lb培养基中菌落形状图。
28.图2是bjy-3菌体通过革兰氏染色在光学电镜下观察图。
29.图3是bjy-3菌体在尼古丁无机盐培养基中产生蓝色降解圈图。
30.图4是bjy-3菌体16srdna测序，并分析检测菌属关系。
31.图5是bjy-3菌体降解无机盐培养基中尼古丁0h的高效液相色谱图。
32.图6是bjy-3菌体降解无机盐培养基中尼古丁13h的高效液相色谱图。
33.图7是bjy-3菌体降解前烟叶中尼古丁的高效液相色谱图。
34.图8是bjy-3菌体处理烟叶6天后烟叶中尼古丁含量的高效液相色谱图。
35.图9是bjy-3菌体处理烟叶前（图7）后（图8）烟叶中尼古丁含量液相色谱峰面积变化柱状图。
36.图10是bjy-3菌体处理烟丝21天后烟丝中尼古丁含量变化折线图。
具体实施方式
37.为了更清楚的阐释本技术的整体构思，下面以实施例的方式进行详细说明。在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本技术更为彻底的理解。然而，对于本领域技术人员来说显而易见的是，本技术可以无需一个或多个这些细节而得以实施。在其他的例子中，为了避免与本技术发生混淆，对于本领域公知的一些技术特征未进行描述。
38.如未特殊说明，在以下实施方式中，所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
39.实施例1 菌株的筛选与鉴定。
40.（一）、生物材料采集。
41.在烟草种植地土壤与烟草叶片、根、秸秆、花苞以及烟草废弃物分离含有大量尼古丁，故可推测其中可分离出多种尼古丁降解菌。
42.采集地点与材料。
43.1、黑龙江省哈尔滨市宾西县采集烟草种植地中的土壤、根、秸秆、叶。
44.2、黑龙江省牡丹江市烟草地采集烟草花苞、根、秸秆、叶。
45.3、四川省什邡市烟草叶片及烟草废弃物。
46.采集要求。
47.1、每采样点间隔约为20米。
48.2、每点取土样约一个乒乓球大小，取土壤深度5cm、10cm、15cm，并采集此地烟草叶片、秸秆等，要求尽量完整。
49.3、烟草废弃物采集方法同烟草种植地土壤。
50.（二）、分离得到一株高效降解尼古丁氯酚假节杆菌bjy-3。
51.利用无机盐培养基，添加尼古丁作为唯一的碳氮源，分离可以利用尼古丁生长的菌株。最后分离得到9株不同菌株，其中bjy-3具有很高的尼古丁降解活性。
52.具体方法如下。
53.1）培养基的配置及灭菌。
54.a、lb培养基的配置。
55.胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠l0 g，蒸馏水定容至1 l，ph值自然。121℃高压灭菌20 min。
56.b、尼古丁无机盐培养基的配制。
57.根据表1中数据配制培养基，纯水定容至1l，ph自然，121℃高压灭菌20min（尼古丁经0.22
µ
m滤膜加入），固体培养基则在液体培养基基础上添加2.0%琼脂。
58.表1尼古丁无机盐培养基配方注：固体培养基加琼脂。
59.2）富集培养。
60.a、用lb培养基收集实验材料（切碎研磨后的植物组织与土壤样本各2g）中的大部分微生物，为期3-4天（30℃，160 rpm）。
61.b、利用尼古丁无机盐培养基以高浓度尼古丁进行胁迫，30℃、160 rpm，每7天换液一次，重复6次。
62.3）涂布筛菌。
63.将最后一次培养液涂布在尼古丁固体培养基上，并挑取长势旺盛的菌株进行单独培养，将此菌株分离纯化后接种到尼古丁培养基中，30℃、160 rpm摇床培养24 h后，通过高效液相色谱仪(high performance liquid chromatography，hplc)检测培养基中尼古丁含量，筛选出具有尼古丁降解能力的菌株。
64.经筛选最终获得一株尼古丁降解能力突出的菌株bjy-3，其来源于四川省什邡市的烟草废弃物中。
65.4）菌株bjy-3的形态观察与降解圈观察。
66.如图1所示，菌株bjy-3在lb固体培养基上菌落成淡黄色，圆形，表面光滑，不透明。
67.如图2所示，菌株bjy-3的革兰氏染色结果显示，其染色后呈蓝色，为革兰氏阳性菌。
68.如图3所示，在尼古丁固体培养基中间利用牛津杯生成直径约1 cm的圆形孔洞，并向孔洞中加入150μl菌液，可观察到培养基中产生蓝色降解圈。
69.（三）、确定菌属。
70.利用16srdna测序，并分析检测菌属关系，菌株bjy-3与标准菌株氯酚假节杆菌pseudarthrobacter chlorophenolicus a6关系最近，具体系统发育树见图4。
71.具体步骤如下。
72.1、提取菌株基因组dna。
73.2、利用16srdna通用引物进行目的基因扩增，其中，正向引物为：5
’‑
tggcgaacgggtgagtaatacat-3’；反向引物为：5
’‑
gcggttaggctaactacttctgg-3’。
74.pcr反应体系见表2。
75.表2 16srdna的pcr体系
注：总体积为50μl。
76.实施例2 氯酚假节杆菌bjy-3的分解尼古丁活性。
77.分别将氯酚假节杆菌bjy-3接种于表1所示的尼古丁无机盐培养基、烟叶和烟丝中，利用高效液相色谱hplc检测尼古丁含量，确认bjy-3的降解尼古丁活性。
78.其中，检测尼古丁含量的高效液相色谱条件如下：流动相：纯甲醇：0.1%二乙胺水溶液=40：60。柱温：40℃。进样量：20μl。流速：0.8 ml/min。
79.（一）、菌株bjy-3对尼古丁的降解。
80.以1%的接种量，将菌株bjy-3接种于5 ml浓度为500 mg/l的尼古丁无机盐培养基中，于30℃、160rpm下培养，并于加入菌种前，以及加入菌种后每隔1~2h取适量培养液，将培养液于12000 rpm离心10 min，取上清液过0.22 nm有机滤膜装入液相进样瓶中，进行高效液相色谱分析。所得结果如图5、图6与表3所示。
81.图5和图6分别为菌株bjy-3处理500mg/l的尼古丁无机盐培养基0h与13h后高效液相色谱图，结合图5、图6和表3的结果可知，利用菌株bjy-3处理表1中的尼古丁无机盐培养基13h后，500mg尼古丁几乎被降解。
82.表3 菌株bjy-3对无机盐培养基中尼古丁的降解效果注：h：小时。
83.（二）、菌株bjy-3对烟叶、烟丝、烟梗和烟草种植地土壤的降解。
84.1）样品前处理。
85.a、分别取适量的烟叶（由内蒙古卷烟厂提供），烟丝（由内蒙古卷烟厂提供），烟草废弃物（由内蒙古卷烟厂提供，具体为采摘完烟叶的废弃烟末和烟梗以1:1的质量比混合，并粉碎至100目），和烟草种植地土壤（由内蒙古卷烟厂提供，具体为采集自内蒙古自治区赤峰市喀喇沁旗乃林镇的烟草种植区的已采收完烟草后的土壤样品），利用紫外灯灭菌6 h，期间不停翻动，保证灭菌效果。
86.b、灭菌后分别放入无菌取样袋中并加入一定量无菌水，放置24h平衡水分（此步骤可省略）。
87.2）菌株培养与提取。
88.a、将菌株bjy-3以2%接种量接种于100 ml lb培养基中30℃、160 rpm培养24 h。
89.b、倒入50 ml离心管中以8000 rpm转速离心3 min，保留沉淀。
90.c、向离心管中加入10-20 ml无菌水振荡洗涤。
91.d、以8000 rpm转速离心3 min，保留沉淀，重复洗涤两次。
92.e、加入一定量无菌水使菌液od值达到2.0~3.0，获得bjy-3混悬菌液。
93.3）菌株处理烟叶、烟丝、烟草废弃物和烟草种植地土壤a、烟叶处理：将30 g烟叶浸泡入bjy-3混悬菌液中30 s后捞出擦干，放放于30℃培养箱，于相对湿度30%、氧气含量21%条件下培养。
94.b、烟丝、烟草废弃物和烟草种植地土壤的处理：取10ml bjy-3混悬菌液，分别称取250g干燥后的烟丝、烟草废弃物和土壤样品，将菌液喷施在烟丝、烟草废弃物和土壤样品中，然后放于30℃培养箱，于相对湿度30%、氧气含量21%条件下培养。
95.降解效果。
96.1、菌株bjy-3对烟叶中尼古丁的降解效果。
97.菌株bjy-3对烟叶中尼古丁的降解效果见表4。
98.表4 菌株bjy-3对烟叶中尼古丁的降解效果时间尼古丁含量（质量比m/m)降解率0d3.80%5d3.62%4.74%10d3.51%7.63%15d3.32%12.63%注：d：天。
99.由表4可知，烟叶的初始尼古丁含量（质量比m/m)约为3.80%，经过菌株bjy-3处理15天后，烟叶中尼古丁含量（质量比m/m)约为3.32%，降解率达12.63%。
100.其中，采用高效液相色谱分析bjy-3菌体降解前后烟叶中尼古丁的含量变化情况，所得结果如图7~图9所示。图7是采用bjy-3菌体降解前烟叶中尼古丁的高效液相色谱图，图8是采用bjy-3菌体处理烟叶6天后烟叶中尼古丁含量的高效液相色谱图，图9是图7和图8中采用bjy-3菌体处理烟叶前后的烟叶中尼古丁含量液相色谱峰面积变化，结合图7、图8以及图9中的对比可知，烟叶在采用bjy-3菌处理前后其尼古丁含量存在显著降低，说明本技术筛选获得的bjy-3菌体对烟叶中的尼古丁具有降解效果。
101.2、菌株bjy-3对烟丝中尼古丁的降解效果。
102.菌株bjy-3对烟丝中尼古丁的降解效果见表5。
103.表5 菌株bjy-3对烟丝中尼古丁的降解效果时间尼古丁含量（质量比m/m)降解率0d1.94%7d1.82%6.19%14d1.69%12.89%21d1.54%20.62%注：d：天。
104.由表5可知，烟丝的初始尼古丁含量（质量比m/m)约为1.94%，经过菌株bjy-3处理
21天后，尼古丁含量（质量比m/m)约为1.54%，降解率达20.62%。
105.将上述烟丝中尼古丁的降解数据绘制成折线图以分析其变化趋势，所得结果如图10所示。由图10可知，bjy-3菌体处理烟丝21天中烟丝中尼古丁含量呈下降趋势，说明本技术筛选获得的bjy-3菌体对烟叶中的尼古丁具有降解效果。
106.3、菌株bjy-3对烟草废弃物中尼古丁的降解效果。
107.菌株bjy-3对烟草废弃物中尼古丁的降解效果见表6。
108.表6 菌株bjy-3对烟草废弃物中尼古丁的降解效果时间尼古丁含量（质量比m/m）降解率0d3.06%7d2.71%11.44%14d1.64%46.41%21d1.27%58.50%28d1.15%62.42%注：d：天。
109.由表6可知，烟草废弃物的初始尼古丁含量（质量比m/m)约为3.06%，经过菌株bjy-3处理28天后，尼古丁含量（质量比m/m)约为1.15%，降解率达62.42%。
110.4、菌株bjy-3对土壤样品中尼古丁的降解效果。
111.菌株bjy-3对土壤样品中尼古丁的降解效果见表7。
112.表7 菌株bjy-3对烟草种植地土壤中尼古丁的降解效果时间尼古丁含量（质量比m/m）降解率0d1.69%7d1.45%14.20%14d1.28%24.26%21d1.03%39.05%28d0.97%42.60%注：d：天。
113.由表7可知，土壤样品的初始尼古丁含量（质量比m/m)约为1.69%，经过菌株bjy-3处理28天后，尼古丁含量（质量比m/m)约为0.97%，降解率达42.60%。
114.综合上述可知，本技术提供的氯酚假节杆菌（pseudarthrobacter chlorophenolicus）bjy-3对尼古丁培养基、烟草制品、烟草废弃物以及烟草种植地土壤中的尼古丁均显示出了很好的降解能力，在烟草种植和生产工业中，具有重要的经济、社会和生态效益。
115.以上所述仅为本技术的实施例而已，并不用于限制本技术。对于本领域技术人员来说，本技术可以有各种更改和变化。凡在本技术的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本技术的权利要求范围之内。

技术特征：
1.一种氯酚假节杆菌菌株，其特征在于，所述菌株为氯酚假节杆菌（pseudarthrobacter chlorophenolicus）bjy-3，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no. 25122。2.包含如权利要求1所述的氯酚假节杆菌bjy-3的菌制剂。3.如权利要求1所述的氯酚假节杆菌菌株，和/或权利要求2所述的菌制剂在微生物降解尼古丁中的应用。4.如权利要求1所述的氯酚假节杆菌菌株，和/或权利要求2所述的菌制剂在微生物降解含有尼古丁的烟草制品、烟草工业废弃物和/或烟草种植地土壤中的应用。5.利用如权利要求1所述的氯酚假节杆菌菌株，和/或如权利要求2所述的菌制剂处理烟草制品、烟草工业废弃物获得的菌降解物。6.一种微生物降解尼古丁的方法，其特征在于，包括利用如权利要求1所述的氯酚假节杆菌菌株，和/或如权利要求2所述的菌制剂处理烟草制品、烟草工业废弃物和/或烟草种植地土壤的步骤。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述处理的方式包括：将所述菌株和/或所述微生物菌剂制成od值为2.0-3.0混悬液，喷施所述烟草制品或将所述烟草制品浸泡于所述混悬液中5~60秒后捞出；和/或，所述菌株和/或所述菌制剂的接种量为0.01%~20%。8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法还包括处理后置于温度28℃~32℃、相对湿度20%~50%、氧气含量18%~25%下培养1~30天的步骤。9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述烟草制品包括烟叶、复烤烟叶、烟草薄片、烟丝、卷烟、雪茄烟；所述烟草工业废弃物包括烟梗和烟末。10.如权利要求1所述的氯酚假节杆菌菌株、如权利要求2所述的菌制剂、如权利要求5所述的菌降解物和/或权利要求6-9任一所述的方法在制备可燃卷烟、加热不燃烧卷烟和/或烟油中的应用。

技术总结
本发明公开了一种氯酚假节杆菌BJY-3及其在降解尼古丁中的应用，属于微生物领域。该菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.25122。本申请分离得到的菌株BJY-3具有降解尼古丁的能力，可以丰富降解尼古丁的菌株资源，筛选高效降解尼古丁相关基因，为转基因烟草与工程菌株提供新的基因来源，提高烟草产品的质量，还可以用于处理烟草废弃物和种植地土壤中的尼古丁，具有重要的经济、社会和生态效益。社会和生态效益。社会和生态效益。


技术研发人员：于涛 费玥 李海涛 李杰 李力群 郭春生 云晶 那宝丹 张善林
受保护的技术使用者：内蒙古昆明卷烟有限责任公司
技术研发日：2023.07.28
技术公布日：2023/9/7