父源性睾丸发育不良动物模型的构建方法、干预靶标及其应用

1.本发明涉及动物模型构建技术领域，具体涉及一种父源性睾丸发育不良动物模型的构建方法、干预靶标及其应用。


背景技术：

2.睾丸发育不良是指各种因素导致睾丸没有发育或发育不完全，是一种日益常见且与环境有关的雄性生殖系统发育障碍性疾病，其主要包括隐睾、尿道下裂、低精子质量、睾丸癌等睾丸发育不良状态。睾丸发育不良的已知起因主要包括先天与后天因素。其中先天因素主要是由染色体异常引起的，多见青春期发育延迟，男性第二性征不明显，乳房增大等女性化表现，人群的发病率是1000-1500分之一；后天因素主要包括感染、外伤以及内分泌异常等。睾丸发育不良易诱发男性不育症发生、心血管疾病等，基于流行病学调查，大约15％的夫妇受到不孕不育症的影响，男性因素被认为在50％的不孕夫妇中起作用，并且是20％不孕不育症的唯一病因。目前随着环境污染、社会压力、慢性应激等外界因素的加剧，男性睾丸发育不良的发病率逐年升高，并且尚未存在有效的治疗手段，这可能与睾丸发育不良的病因和临床表现复杂、多样有关。
3.近年来，“健康与疾病的发育起源(dohad)”学说目前已受到研究人员的广泛关注[1]。例如，母体孕期暴露于尼古丁、酒精会导致雄性子代肛殖距缩短，男性胎儿出现女性化特征；孕期某些药物使用(如人工合成类糖皮质激素、非甾体抗炎药等)可导致子代睾丸睾酮合成功能抑制。目前多数研究睾丸发育不良模型均集中于母体不良环境暴露所致[2,3]。然而，近期随着“健康与疾病的父系起源(pohad)”学说的兴起，越来越多的证据支持父体不良环境暴露可致子代睾丸发育不良[4]。如父体孕前双酚a和镉等重金属暴露会导致子代出现精子数量减少、精子质量降低[5,6]。目前，虽然部分睾丸发育不良综合征模型已得到广泛应用，如睾丸生精细胞中atg5/atg7敲除的小鼠表现出少精、无精症，但是仍然没有模型能完全模拟睾丸发育不良并反映其发生发展过程。因此，为了补充与扩展睾丸发育不良模型的范围，迫切需要父源性睾丸发育不良模型的建立与应用，进一步探究其发病机制、早期预警与防治，从而造福人类。
[0004]
咖啡因是一种黄嘌呤生物碱，广泛存在于咖啡、茶、能量饮料、食物和止痛药物中，临床上可作为治疗早产儿呼吸暂停的辅助药物[7]。流行病学调查发现男性咖啡因暴露的现状较女性更为严重，并且有年轻化的趋势。根据美国国家健康和营养调查数据，育龄男性咖啡因平均摄入量为240mg/d，约为女性的1.5倍，最高可达300mg/d[8-10]。本发明前期系统研究发现，母体孕期咖啡因暴露具有胎儿发育毒性，可引起子代iugr、低出生体重，子代睾丸发育不良的风险增加。近期，随着父源性因素在子代发育中的角色被关注，本发明将目光聚焦于父体孕前咖啡因暴露(paternal pro-gestational caffeine exposure,ppce)大鼠模型上，证实了ppce可致子代睾丸发育不良，由此提供一种父源性睾丸发育不良动物模型的构建方法及其应用。
[0005]
主要参考文献：
[0006]
1.suzuki k:the developing world of dohad.j dev orig health dis 2018,9(3):266-269.
[0007]
2.pei lg,zhang q,yuan c,liu m,zou yf,lv f,luo dj,zhong s,wang h:the gc-igf1axis-mediated testicular dysplasia caused by prenatal caffeine exposure.j endocrinol 2019,242(1):m17-m32.
[0008]
3.dimofski p,meyre d,dreumont n,leininger-muller b:consequences of paternal nutrition on offspring health and disease.nutrients 2021,13(8).
[0009]
4.soubry a:pohad:why we should study future fathers.environ epigenet 2018,4(2):dvy007.
[0010]
5.goli p,yazdi m,poursafa p,kelishadi r:intergenerational influence of paternal physical activity on the offspring's brain:a systematic review and meta-analysis.int j dev neurosci 2021,81(1):10-25.
[0011]
6.mcpherson no,fullston t,aitken rj,lane m:paternal obesity,interventions,and mechanistic pathways to impaired health in offspring.ann nutr metab 2014,64(3-4):231-238.
[0012]
7.grosso g,godos j,galvano f,giovannucci el:coffee,caffeine,and health outcomes:an umbrella review.annu rev nutr 2017,37:131-156.
[0013]
8.jia h,liu w,liu j,jin q,li c,yu y,meng l,wu g,zhao r,zhao y:[assessment of caffeine intake in children and adolescents aged 6-17years in beijing city].wei sheng yan jiu 2020,49(2):220-226.
[0014]
9.drewnowski a,rehm cd:sources of caffeine in diets of us children and adults:trends by beverage type and purchase location.nutrients 2016,8(3):154.
[0015]
10.fulgoni vl,3rd,keast dr,lieberman hr:trends in intake and sources of caffeine in the diets of us adults:2001-2010.am j clin nutr 2015,101(5):1081-1087.


技术实现要素：

[0016]
本发明要解决的技术问题是提供一种成功率高、有效可靠、可重复性强、简便易行的父源性睾丸发育不良的动物模型构建方法。
[0017]
为解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：
[0018]
第一方面，本发明提供一种父源性睾丸发育不良动物模型的构建方法，其特征在于：包括下列步骤：
[0019]
s1：选取健康8周龄雄性wistar大鼠，在8～16周龄的时间段内，每日给予15、30和60mg/kg咖啡因胃內灌注，且自由饮食；
[0020]
s2：给药完成后，与12周龄的正常雌性wistar大鼠进行合笼受孕，所获取的孕鼠自然生产，获得f1代，以生产日作为出生后0天，出生后1天时选取窝仔数为12～14只的窝仔，调整每窝雄、雌性仔鼠各6只进行哺乳喂养；
[0021]
s3：仔鼠出生后4周断奶并雄、雌分笼，部分继续正常饮食饲养至6、12和32周；分别于各个时间点进行睾丸功能相关指标检测来判断睾丸发育不良发生；最终得到父源性睾丸发育不良动物模型。
[0022]
s4：部分子代饲养至出生后6周，再给予睾丸曲细精管局部显微注射腺相关重组病毒过表达mest，两周后检测睾丸功能相关指标，以判断睾丸发育不良是否被改善。
[0023]
进一步地，所述步骤s1中，正常饮食是配方与《中华人民共和国国家标准gb14924.3-2001》规定的小鼠、大鼠配方饲料相同。
[0024]
更进一步地，所述步骤s3、s4中，睾丸功能相关指标是：睾丸形态、血睾酮水平、睾丸内生睾酮水平、睾丸睾酮合成酶(star、p450scc、3β-hsd)系统表达、精子质量(精子数、活力、形态等)、交配成功率。
[0025]
第二方面，本发明提供一种父源性睾丸发育不良动物模型在筛选亲代环境、内分泌干扰物或药物等中的应用，其特征在于：所述父源性睾丸发育不良动物模型由如以上任一构建方法得到。
[0026]
第三方面，本发明提供一种父源性睾丸发育不良动物模型在筛选睾丸发育不良早期预警及干预靶标中的应用，其特征在于：所述父源性睾丸发育不良动物模型由如以上任一构建方法得到。
[0027]
第四方面，本发明提供一种父源性睾丸发育不良动物模型在筛选防治睾丸发育不良治疗的应用，其特征在于：所述父源性睾丸发育不良动物模型由如以上任一构建方法得到。
[0028]
本发明的技术原理及研究过程如下：
[0029]
本发明通过模拟男性日常生活中咖啡因的易获取等特点，构建了ppce动物模型，动过获取出生前后不同时间点雄性子代，检测睾丸功能相关指标确定睾丸发育不良的发生发展，进而建立父源性睾丸发育不良大鼠模型。该模型模拟了父源性睾丸发育不良发生发展的疾病表型，对阐明父源性睾丸发育不良的发生发展机制，确定早期预警及防治具有重要意义。
[0030]
本发明的优点及有益效果如下：
[0031]
1、造模方法简单易行、可重复性高：本发明的造模方法简单，父体孕前给予咖啡因，并与正常雌性交配获取出生前后不同时间点雄性子代，检测睾丸形态、血睾酮水平、睾丸睾酮合成酶系统(包括star、p450scc、3β-hsd)表达、睾丸内生睾酮水平、精子质量(精子数、活力、形态等)以及交配成功率来观察睾丸功能改变情况，并判断睾丸发育不良是否发生。本模型指标稳定性好，可重复性高，为父源性睾丸发育不良提供了一种可靠的方法。
[0032]
2、该模型应用广泛、研究意义大：基于本发明构建的父源性睾丸发育不良模型，可用于指导男性健康饮食生活、有利于探讨父源性睾丸发育不良的发生发展机制、早期预警及干预靶标中的应用。
附图说明
[0033]
图1.ppce子代大鼠出生前后睾丸形态学改变。
[0034]
图1中：a：ppce子代胎睾丸形态学；b，c：ppce子代胎睾丸最大最大截面积、最长直径；d：ppce子代胎睾丸最大截面积、最长直径；e：ppce成年子代睾丸体积与形态学；f：ppce
成年子代睾丸重；g-i：ppce成年子代睾丸生精上皮厚度与生精小管直径、面积。
[0035]
图2.ppce子代大鼠出生前后睾酮合成功能抑制。
[0036]
图2中：a：ppce组胎血睾酮水平；b：ppce子代胎睾丸睾酮合成相关基因的mrna表达；c：ppce子代胎睾丸star蛋白表达；d：ppce成年后子代血睾酮水平；e：ppce子代胎睾丸睾酮合成相关基因的mrna表达；f：ppce子代胎睾丸star蛋白表达。
[0037]
图3.ppce子代成年大鼠生精功能异常及生育力降低。
[0038]
图3中：a：ppce成年12周子代精子形态；b：ppce成年12周子代精子数目；c：ppce成年子代32周精子数量；d：ppce成年32周子代精子活力；e：ppce成年32周子代精子畸形率；f：ppce成年子代交配成功率。
[0039]
图4.mest/wnt信号介导子代成年大鼠生精功能异常及生育力降低。
[0040]
图4中：a：ppce子代差异基因；b，c：ppce子代差异基因kegg与go富集分析；d，e：ppce子代出生前后睾丸mest启动子区dna甲基化及表达；f-h：ppce子代出生前后睾丸mest与3β-hsd荧光双标；i，j:ppce子代出生前后wnt信号通路基因表达；k：ppce子代出生前后wnt信号通路蛋白表达。
[0041]
图5.mest/wnt信号调控睾丸间质细胞睾酮合成功能。
[0042]
图5中：a-c：细胞干预后差异基因kegg与go通路富集分析；d-f：细胞干预后wnt信号基因与蛋白表达；g-j：细胞干预后睾酮合成相关基因与蛋白表达。
[0043]
图6.干预mest可逆转ppce所致子代睾丸发育不良。
[0044]
图6中：a：睾丸曲细精管显微注射mest腺相关病毒；b：睾丸活体成像；c：干预后wnt信号基因与蛋白表达；d：干预后睾酮合成功能相关酶基因与蛋白表达。
具体实施方式
[0045]
以下结合具体实施例和附图，对本发明的技术内容作进一步的详细阐述。
[0046]
【实施例1】本发明父源性睾丸发育不良动物模型的构建
[0047]
1实验动物
[0048]
spf级健康wistar大鼠，购自湖北省疾病预防控制中心，动物许可证号：scxk(鄂)2018-2020。本研究获武汉大学医学部伦理委员会批准，并严格按照国际实验动物保护认证评估机构相关处理准则执行。
[0049]
实验动物饲养于屏障环境内，温度22～25℃，湿度50％，12小时昼夜交替。
[0050]
2实验方法
[0051]
雄性7周龄wistar大鼠40只(体重260-300g)，自由饮水进食，适应性喂养7天后，分为对照组(每日灌胃生理盐水1ml/100g)与孕前ppce组(每日给与15、30和60mg/kg咖啡因)，在给药时间达两个月后，将雄性wistar大鼠(此时16周龄)与正常12周龄雌性wistar大鼠按1:2的比例进行合笼交配(注意：每只雄鼠保证只交配成功一次，以保证雄鼠与子代满足一对一的要求)。次日早晨检查阴道涂片，若在镜下观察到精子即记录为妊娠日0(gestational day，gd)，并将已受孕的雌鼠拎出单独饲养。持续如此，以保证每组至少产生12只孕鼠。在gd20时，部分孕鼠给予2％的异氟烷麻醉处死，取胎血与睾丸组织。将每窝雄性胎鼠的血液样本合并为一个样本进行后续血系列相关指标分析。胎儿右侧睾丸组织立即在液氮中冷冻，并在-80℃下保存以供进一步rt-qpcr分析。此外，随机选取五个来自于不同窝
的左侧胎睾丸置于4％多聚甲醛溶液中过夜，酒精脱水后石蜡包埋备用于he、免疫荧光、免疫组化等形态学分析。给药与受孕期间各组孕鼠均自由正常饮食。饲料购自武汉市万千佳兴生物科技有限公司，许可证号：scxk(鄂)2011-0011。饲料配方与《中华人民共和国国家标准gb14924.3-2001》规定的小鼠大鼠配方饲料相同。
[0052]
其余的孕鼠自然生产，出生时8-14只窝仔数被认为是合格的，并于不同窝之间进行胎仔性别和数量的调整，使其达到12只/窝，性别1:1。子代大鼠出生后4周龄断奶和雌雄分笼。并于出生后6、12、32周三个时间点进行取材，右侧睾丸立即在液氮中冷冻，并在-80℃下保存以供进一步rt-qpcr分析。随机选取5只出生后子代左侧睾丸置于4％多聚甲醛溶液中过夜，酒精脱水后石蜡包埋备用于he、免疫荧光、免疫组化等形态学分析。
[0053]
3检测指标及方法
[0054]
3.1 he染色
[0055]
将大鼠睾丸在4％多聚甲醛溶液中固定3天，并用石蜡包埋技术处理。将睾丸以5μm矢状切片以进行形态学染色分析。将切片放入苏木精染液中15 min，蒸馏水浸洗15 min，1％的盐酸乙醇分色10 s左右，切片颜色由红变浅即可，蒸馏水浸洗10 s左右，用0.6％氨水反蓝，然后在流水冲洗10 s左右。将染色后的切片放入0.5％伊红染液中复染2 min。然后依次将切片置入95％酒精i 5min
→
95％酒精ii 5 min
→
无水乙醇ⅰ5 min
→
无水乙醇ⅱ5 min
→
二甲苯ⅰ5min
→
二甲苯ⅱ中3-5 min透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片。
[0056]
3.2免疫组化与免疫荧光
[0057]
对于免疫组织化学染色，将大鼠睾丸在4％多聚甲醛溶液中固定3天，并用石蜡包埋技术处理。将睾丸以5μm矢状切片以进行形态学染色分析。脱蜡，补液和抗原修复后，使用edta抗原修复缓冲液(ph 8.0)处理石蜡切片。使用bsa封闭睾酮合成关键酶star与印记基因mest一抗，使用dab与dapi染色试剂盒(genetech company，ltd.，上海，中国)进行检测。
[0058]
3.3 rt-qpcr
[0059]
对于rt-qpcr检测，使用trizol试剂分离出睾丸组织的总rna，将分离的rna等分保存在-80℃，使用cdna合成试剂盒将总质量1μg的纯化rna进行反转录，随后使用扩增cdna，反应进行40个循环。使用2-δδ
ct方法计算相对扩增子表达。测定了rna中的star、p450scc、3β-hsd、17α-hsd、17β-hsd、和gapdh的表达。大鼠的引物序列显示在表1中。所有cdna序列均从ncbi entrez核苷酸数据库获得，并且使用primer premier 6.0(premier biosoft international，palo alto，ca，usa)设计引物。使用ncbi blast数据库查询每个设计的引物序列，以进行同源性比较，以确定最终使用的引物序列。引物信息如表1所示。
[0060]
表1.相关引物序列
[0061]
[0062][0063]
4实验结果
[0064]
ppce可引起雄性子代大鼠睾丸发育不良，具体表现为：与对照组相比，ppce组雄性子代大鼠睾丸形态异常，包括间质拓宽、细胞数减少、生精小管形态不规则等。并且血睾酮水平降低，睾丸睾酮合成酶系统表达抑制，表现为睾酮合成功能抑制。此外，ppce组成年子代雄性大鼠精子数减少、精子质量降低、精子畸形率增加，交配成功率下降，表现为生精功能异常且生育力降低。
[0065]
4.1子代大鼠出生前后睾丸形态学改变
[0066]
子代大鼠出生前后睾丸形态学改变如图1所示。与对照组相比，ppce组胎睾丸出现间质拓宽、间质细胞核皱缩等形态学改变(图1中a，见红色箭头标注处)，且其最大截面积、最长直径显著缩短(图1中b，c)，生精小管相关同样最大截面积、最长直径显著缩(图1中d，e)；成年后(出生后12周龄)子代大鼠睾丸体积呈显著缩小(图1中e)，睾丸出现生精小管形态异常、其内部精子数目减少等形态学改变(图1中e，见红色箭头标注处)。同时其睾丸重有降低趋势(图1中f)，生精上皮厚度与生精小管直径、面积显著降低(图1中g-i)。提示，ppce可致子代出生前后睾丸形态学异常。
[0067]
4.2子代大鼠出生前后睾酮合成功能抑制
[0068]
子代大鼠出生前后睾酮合成功能改变结果如图2所示。结果显示，与对照组相比，在胎儿时期，ppce组血睾酮水平显著降低(图2中a)，睾酮合成酶系统(包括p450scc、star、3β-hsd、17α-hsd、17β-hsd)的mrna表达抑制(图2中b)，并且睾酮合成关键酶star蛋白表达降低(图2中c)；成年后子代血睾酮水平持续降低(图2中d)，睾酮合成相关酶的mrna表达抑制(图2中f)，star蛋白表达降低(图2中f)。提示，ppce可致子代大鼠出生前后睾酮合成功能持续抑制。
[0069]
4.3子代成年大鼠生精功能异常及生育力降低
[0070]
子代成年大鼠生精功能改变如图3所示。结果表明，与对照组相比，ppce组的子代
成年大鼠在出生后12周与32周龄时异常精子(包括无头、无尾精子等)数显著增多(图3中a，b)。进一步观察精子质量相关指标后发现，12周龄时ppce组子代精子数显著降低(图3中c)、精子活力显著减弱(图3中d)、精子畸形率显著升高(图3中e)，并且当其与正常雌性交配后可发现交配成功率降低(图3中f)。以上结果提示，ppce可导致雄性子代生精功能异常，并且成年后生育力降低。
[0071]
【实施例2】本发明父源性睾丸发育不良动物模型预警靶标的探寻
[0072]
1实验动物与实验方法部分与实例1中一致
[0073]
2检测指标及方法
[0074]
2.1免疫组化与免疫荧光
[0075]
对于免疫组织化学染色，将大鼠睾丸在4％多聚甲醛溶液中固定3天，并用石蜡包埋技术处理。将睾丸以5μm矢状切片以进行形态学染色分析。脱蜡，补液和抗原修复后，使用edta抗原修复缓冲液(ph 8.0)处理石蜡切片。使用bsa封闭睾酮合成关键酶star与印记基因mest一抗，使用dab与dapi染色试剂盒(genetech company，ltd.，上海，中国)进行检测。
[0076]
2.2 rt-qpcr
[0077]
对于rt-qpcr检测，使用trizol试剂分离出睾丸组织的总rna，将分离的rna等分保存在-80℃，使用cdna合成试剂盒将总质量1μg的纯化rna进行反转录，随后使用扩增cdna，反应进行40个循环。使用2-δδ
ct方法计算相对扩增子表达。测定了rna中的mest、wnt信号通路和gapdh的表达。大鼠的引物序列显示在表1中。所有cdna序列均从ncbi entrez核苷酸数据库获得，并且使用primer premier 6.0(premier biosoft international，palo alto，ca，usa)设计引物。使用ncbi blast数据库查询每个设计的引物序列，以进行同源性比较，以确定最终使用的引物序列。引物信息如表1所示。
[0078]
2.3睾丸组织蛋白浓度测定
[0079]
从负八十度冰箱中取睾丸组织解冻，称重50mg睾丸组织后，加入pbs后充分研磨混匀，根据bca试剂盒说明书进行实验。根据所需总体积，以50：1的比例将a试剂与b试剂进行混合以制备bsa工作液，注意bsa工作液需现配现用；使用pbs将蛋白标准品溶液(25mg/ml)按照梯度分别稀释为0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/ml，并使得稀释后各个标准品终体积为20μl；出96孔板，于各孔中加入适当体积的待测样品与pbs，同时设置等体积标准品孔；向各孔中加入预先配制完成的bca工作液，每孔各200μl，置于37℃恒温摇床中混匀反应约半小时；上述步骤完成后，将96孔板置于酶标仪中，以570nm波长读取各孔吸光值；最后，依据各孔的吸光值来绘制标准曲线，并按照样品稀释比例，计算各个孔中样品蛋白浓度。
[0080]
2.4睾丸组织的蛋白提取
[0081]
称量50mg睾丸组织于1.5ml离心管中，剪碎后(注意不要混入睾丸筋膜)加入500μl含有蛋白酶抑制剂的ripa裂解液，使用匀浆机匀浆至无明显沉淀物；将睾丸组织匀浆液置于冰上静置30分钟，在充分裂解组织蛋白后，于12000rpm 4℃离心15分钟，小心吸取静置上清液后转移至新的1.5ml离心管中；根据上述步骤用bca法测定睾丸组织蛋白浓度，并根据结果将各样品用pbs调整为统一浓度；组织蛋白样品加入适量5
×
loading buffer后混合均匀，于金属浴器100℃加热5分钟，冷却后进行后续检测与储存。
[0082]
2.5睾丸组织蛋白western blot步骤
[0083]
使用蒸馏水清洗1.5mm玻璃板，清洗完成后使用吹风机吹干，组装后加蒸馏水检漏；按凝胶试剂盒说明书配制分离胶及浓缩胶，并插入1.5mm的10孔或15孔梳子。待浓缩胶凝固后，垂直向上缓慢拔出梳子(注意不要破坏凝胶)；上样：将凝固后的胶从胶架取下并安装于电泳槽中，加入预先配置好的电泳缓冲液，避免胶孔里出现气泡。随后将处理好的蛋白样品缓慢加入梳孔中(尽量不要漏出孔外)，同时设置蛋白marker孔；电泳：设定电泳条件为恒压60v，待样品从浓缩胶进入分离胶后，调整电压为120v继续电泳；转膜：裁剪合适大小的pvdf膜并放置于甲醇中活化2分钟。将胶和膜按顺序叠成“三明治”状至夹板中，放入电转槽中，低温恒流150ma电转0.5-1.5小时；将上述电转完成后的pvdf膜裁剪后置于5％脱脂牛奶封闭液中，放入4℃冰箱摇床上封闭1小时；使用一抗稀释液按照各抗体说明书稀释不同一抗。将裁剪的pvdf膜完全浸泡于一抗中，注意一抗应完全覆盖pvdf膜，置于4℃摇床孵育过夜；取出pvdf膜，将其置于tbst溶液中，注意膜应完全浸没于tbst溶液中，放置摇床上洗涤3次，每次5分钟；依据二抗说明书使用5％脱脂牛奶稀释二抗，室温下将pvdf膜置于二抗中反应2-3小时；重复第8步洗膜；取ecl化学发光试剂盒中的a液和b液等比例混合后配置成工作液，随后加到pvdf膜上并完全覆盖膜，反应数分钟后使用化学发光成像系统获取图像并保存。
[0084]
3实验结果
[0085]
3.1mest/wnt信号介导子代成年大鼠生精功能异常及生育力降低
[0086]
为探寻ppce所致子代睾丸发育不良的发生机制。本发明首先对子代睾丸组织进行了转录组测序，结果表明ppce组子代睾丸较对照组中多种mrna表达发生改变，其中印记基因mest表达改变较为明显(图4中a)，进一步本发明通过kegg与go富集分析发现，ppce组子代睾丸中差异变化的基因富集于类固醇激素合成与wnt信号通路(图4中b，c)。测序结果提示mest与wnt信号在ppce所致子代睾丸发育不良中可能存在重要作用。本发明对相关指标验证发现，与对照相比，ppce(h)组子代出生前后(gd20与pw12)睾丸中mest启动子区多个位点dna甲基化水平降低，且其mrna表达水平升高(图4中d，e)。为确定mest富集表达于睾丸组织中哪种细胞，本发明对睾丸进行mest与3β-hsd进行免疫荧光双标后发现，ppce(h)组子代出生前后睾丸间质区域(即间质细胞)中mest表达增加(图4中f-h)。随后本发明对wnt信号相关指标检测发现，ppce(h)组子代出生前后睾丸中wnt信号相关指标(如wnt1、wnt2等)mrna表达显著抑制(图4中i，j)，且wnt信号效应蛋白β-catenin表达显著抑制(图4中k)。综合上述测序与实验验证实验可初步提示，ppce可致子代睾丸间质细胞mest启动子区dna甲基化水平降低及表达升高，wnt信号抑制，进而导致ppce所致子代睾丸发育不良。
[0087]
3.2mest/wnt信号调控睾丸间质细胞睾酮合成功能
[0088]
为确证mest/wnt信号参与调控睾丸间质细胞睾酮合成功能。本发明选用大鼠睾丸间质细胞系r2c为研究对象，对mest和wnt信号进行干预后检测其下游睾酮合成相关指标变化。首先，本发明对沉默与过表达mest后的r2c细胞进行转录组学测序后发现，其多种mrna表达变化，且kegg与go富集分析发现其同样富集于wnt信号通路，这初步提示mest可能通过wnt信号发挥作用(图5中a-c)。检测其下游指标可发现，当沉默mest后，wnt信号激活(wnt、β-catenin等表达升高)(图5中e，f)，睾酮合成相关酶mrna表达升高，star蛋白表达增加(图5中d，f，l)；而当过表达mest后，wnt信号抑制(图5中e，f)，睾酮合成相关酶表达降低(图5中d，f)。这表明mest可能通过负向调控wnt信号调控睾丸间质细胞睾酮合成功能。进一步，本
发明于r2c细胞上过表达mest以模拟动物模型上的mest的mrna表达改变，并随后给与wnt信号通路激动剂skl2001共处理来确证wnt通路是否参与调控间质细胞睾酮合成。结果表明，wnt信号激动剂可以逆转mest高表达所致的睾酮合成相关酶如star的表达抑制(图5中g-j)。综上提示，mest/wnt信号参与调节睾丸间质细胞睾酮合成功能。
[0089]
【实施例3】本发明父源性睾丸发育不良动物模型干预靶标的确证
[0090]
1实验动物与实验方法部分与【实施例1】中一致，另外，在ppce组pw8子代大鼠进行睾丸曲细精管显微注射重组腺相关病毒，持续干预四周，获取相应组别(假手术组、空载体组、mest干预组)血与睾丸组织进行进一步检测。
[0091]
2检测指标及方法
[0092]
2.1免疫组化与免疫荧光
[0093]
对于免疫组织化学染色，将大鼠睾丸在4％多聚甲醛溶液中固定3天，并用石蜡包埋技术处理。将睾丸以5μm矢状切片以进行形态学染色分析。脱蜡，补液和抗原修复后，使用edta抗原修复缓冲液(ph 8.0)处理石蜡切片。使用bsa封闭睾酮合成关键酶star与印记基因mest一抗，使用dab与dapi染色试剂盒(genetech company，ltd.，上海，中国)进行检测。
[0094]
2.2rt-qpcr
[0095]
对于rt-qpcr检测，使用trizol试剂分离出睾丸组织的总rna，将分离的rna等分保存在-80℃，使用cdna合成试剂盒将总质量1μg的纯化rna进行反转录，随后使用扩增cdna，反应进行40个循环。使用2-δδ
ct方法计算相对扩增子表达。测定了rna中的睾酮合成相关基因、mest、wnt信号通路和gapdh的表达。大鼠的引物序列显示在表1中。所有cdna序列均从ncbi entrez核苷酸数据库获得，并且使用primer premier 6.0(premier biosoft international，palo alto，ca，usa)设计引物。使用ncbi blast数据库查询每个设计的引物序列，以进行同源性比较，以确定最终使用的引物序列。引物信息如表1所示。
[0096]
2.3睾丸组织蛋白浓度测定
[0097]
从-80℃冰箱中取睾丸组织解冻，称重50mg睾丸组织后，加入pbs后充分研磨混匀，根据bca试剂盒说明书进行实验。根据所需总体积，以50：1的比例将a试剂与b试剂进行混合以制备bsa工作液，注意bsa工作液需现配现用；使用pbs将蛋白标准品溶液(25mg/ml)按照梯度分别稀释为0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/ml，并使得稀释后各个标准品终体积为20μl；出96孔板，于各孔中加入适当体积的待测样品与pbs，同时设置等体积标准品孔；向各孔中加入预先配制完成的bca工作液，每孔各200μl，置于37℃恒温摇床中混匀反应约半小时；上述步骤完成后，将96孔板置于酶标仪中，以570nm波长读取各孔吸光值；最后，依据各孔的吸光值来绘制标准曲线，并按照样品稀释比例，计算各个孔中样品蛋白浓度。
[0098]
2.4睾丸组织的蛋白提取
[0099]
称量50mg睾丸组织于1.5ml离心管中，剪碎后(注意不要混入睾丸筋膜)加入500μl含有蛋白酶抑制剂的ripa裂解液，使用匀浆机匀浆至无明显沉淀物；将睾丸组织匀浆液置于冰上静置30分钟，在充分裂解组织蛋白后，于12000rpm 4℃离心15分钟，小心吸取静置上清液后转移至新的1.5ml离心管中；根据上述步骤用bca法测定睾丸组织蛋白浓度，并根据结果将各样品用pbs调整为统一浓度；组织蛋白样品加入适量5
×
loading buffer后混合均匀，于金属浴器100℃加热5分钟，冷却后进行后续检测与储存。
[0100]
2.5睾丸组织蛋白western blot步骤
[0101]
使用蒸馏水清洗1.5mm玻璃板，清洗完成后使用吹风机吹干，组装后加蒸馏水检漏；按凝胶试剂盒说明书配制分离胶及浓缩胶，并插入1.5mm的10孔或15孔梳子。待浓缩胶凝固后，垂直向上缓慢拔出梳子(注意不要破坏凝胶)；上样：将凝固后的胶从胶架取下并安装于电泳槽中，加入预先配置好的电泳缓冲液，避免胶孔里出现气泡。随后将处理好的蛋白样品缓慢加入梳孔中(尽量不要漏出孔外)，同时设置蛋白marker孔；电泳：设定电泳条件为恒压60v，待样品从浓缩胶进入分离胶后，调整电压为120v继续电泳；转膜：裁剪合适大小的pvdf膜并放置于甲醇中活化2分钟。将胶和膜按顺序叠成“三明治”状至夹板中，放入电转槽中，低温恒流150ma电转0.5-1.5小时；将上述电转完成后的pvdf膜裁剪后置于5％脱脂牛奶封闭液中，放入4℃冰箱摇床上封闭1小时；使用一抗稀释液按照各抗体说明书稀释不同一抗。将裁剪的pvdf膜完全浸泡于一抗中，注意一抗应完全覆盖pvdf膜，置于4℃摇床孵育过夜；取出pvdf膜，将其置于tbst溶液中，注意膜应完全浸没于tbst溶液中，放置摇床上洗涤3次，每次5分钟；依据二抗说明书使用5％脱脂牛奶稀释二抗，室温下将pvdf膜置于二抗中反应2-3小时；重复第8步洗膜；取ecl化学发光试剂盒中的a液和b液等比例混合后配置成工作液，随后加到pvdf膜上并完全覆盖膜，反应数分钟后使用化学发光成像系统获取图像并保存。
[0102]
3实验结果
[0103]
3.1干预mest后可逆转睾丸间质细胞睾酮合成功能
[0104]
本发明通过构建mest的沉默重组腺相关病毒，给予大鼠睾丸曲细精管显微注射后(图6中a)，检测睾丸睾酮合成相关指标改变。结果表明，mest重组腺相关病毒可靶向作用于睾丸局部，且干预效果较好(图6中b)。在上述干预完成后，检测睾酮合成相关指标发现，在上述干预后，wnt信号基因与β-catenin蛋白表达抑制均被逆转(图6中c)。同时睾酮合成相关mrna表达上升，star蛋白表达回调(图6中d)。综合上述实验，mest干预后可逆转子代大鼠睾丸发育不良，这位睾丸发育不良的防治策略提供了一定的依据。
[0105]
本发明方法通过孕前灌胃给予8周龄雄性wistar大鼠15、30和60mg/kg.d的咖啡因并持续两个月后，与正常雌性大鼠交配获取雄性子代，可发现ppce雄性子代表现出睾丸发育不良的典型表型，并通过相关预警靶标探寻与应用，说明了成功建立父源性睾丸发育不良模型，探寻了父源性睾丸发育不良的可能治疗靶标。本发明的造模方法简单，模型中睾丸形态学异常改变、睾酮水平降低、睾丸睾酮合成功能抑制、睾丸生精功能及生育力降低等指标稳定性好，说明本发明造模方法稳定有效可靠，可重复性强。

技术特征：
1.一种父源性睾丸发育不良动物模型的构建方法，其特征在于：包括下列步骤：s1：选取正常六周龄啮齿类动物，通过灌胃给与不同剂量咖啡因即15mg/kg.d、30mg/kg.d和60mg/kg.d并持续2个月，给药期间自由饮食；s2：给药完成后与正常雌性啮齿类动物以父系遗传模式进行交配，获取相应孕鼠；s3：上述步骤s2的部分孕鼠于孕20天取胎血与胎鼠睾丸；部分孕鼠自然生产，获得f1子代，留取窝仔数≥10只的孕鼠，每只孕鼠的仔数保留10只，雌雄各半，仔鼠出生后4周断奶并雄、雌分笼，部分雄性子代继续正常饮食饲养至6/12/32周龄取血与睾丸；s4：在上述步骤完成后，检测不同时间点即孕20、出生后6/12/32周子代睾丸功能相关指标来综合判定睾丸发育不良发生；最终得到父源性睾丸发育不良动物模型。2.根据权利要求1所述的父源性睾丸发育不良动物模型的构建方法，其特征在于：所述步骤s1中，啮齿类动物为spf级wistar、sd大鼠。3.根据权利要求1或2所述的父源性睾丸发育不良动物模型的构建方法，其特征在于：所述步骤s1、s3中，正常饮食是配方与《中华人民共和国国家标准gb14924.3-2001》规定的小鼠、大鼠配方饲料相同。4.根据权利要求3所述的父源性睾丸发育不良动物模型的构建方法，其特征在于：所述步骤s4中，睾丸功能检测相关指标是：血睾酮水平、睾丸内生睾酮水平、睾丸睾酮合成功能、精子质量。5.一种父源性睾丸发育不良动物模型在筛选父体孕前不良环境中的应用，其特征在于：所述动物模型由如权利要求1至4中任一构建方法得到。6.一种父源性睾丸发育不良动物模型在筛选父源性睾丸发育不良早期预警靶标中的应用，其特征在于：所述动物模型由如权利要求1至4中任一构建方法得到。7.一种父源性睾丸发育不良动物模型在筛选父源性睾丸发育不良早期干预靶标中的应用，其特征在于：所述动物模型由如权利要求1至4中任一构建方法得到。8.一种父源性睾丸发育不良动物模型在筛选防治睾丸发育不良药物中的应用，其特征在于：所述动物模型由如权利要求1至4中任一构建方法得到。

技术总结
本发明提供一种父源性睾丸发育不良动物模型的构建方法、干预靶标及其应用。所述的父源性睾丸发育不良动物模型，为亲代6周龄雄性Wistar大鼠不同剂量咖啡因灌胃2个月后，与正常雌性大鼠交配获取F1代出生前和出生后雄性大鼠，后者出现睾丸发育不良，表现为睾丸形态学异常与睾酮合成功能抑制。基于父源性睾丸发育不良模型，对出生后12周雄性大鼠经睾丸曲细精管注射干扰Mest的腺相关病毒后，睾丸功能受损得到有效的纠正。本发明提供的构建方法简单、成功率高、减少了人为操作因素带来的影响，为父源性睾丸发育不良动物模型的发病机制及预防诊疗创造了动物模型基础，具有重要的研究意义和科学价值。意义和科学价值。意义和科学价值。


技术研发人员：汪晖 陈廖斌 柳毅 刘奕 孔梓宇
受保护的技术使用者：武汉大学
技术研发日：2023.06.26
技术公布日：2023/9/7