将人诱导性多能干细胞间接诱导为间充质干细胞的培养液和方法与流程

1.本发明涉及一种将人诱导性多能干细胞间接诱导为间充质干细胞的培养液和方法，属于细胞分化技术领域。


背景技术：

2.诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells，ips细胞)，是指通过导入特定的转录因子将终末分化的体细胞重编程为多能性干细胞。2006年日本京都大学shinya yamanaka在学术杂志《细胞》上率先报道了诱导多能干细胞的研究，他们把oct3/4、sox2、c-myc和klf4这四种转录因子基因克隆入病毒载体，然后引入小鼠成纤维细胞，发现可诱导其发生转化，产生的ips细胞在形态、基因和蛋白表达、表观遗传修饰状态、细胞倍增能力、类胚体和畸形瘤生成能力、分化能力等方面都与胚胎干细胞相似。
3.间充质干细胞(mesenchymal stem cells，msc)是一种多能干细胞，首次分离于骨髓，后来在脂肪、脐带和牙髓等部位均分离出此类成纤维样形态的细胞。msc具有成骨、成脂和成软骨分化潜力，表达cd73、cd90、cd105等标志，但不表达hla-dr，因此其具有低免疫型；另外msc分泌许多细胞因子，在再生医学和免疫调节方面具有重要作用；因此，多项ⅰ～ⅲ期临床试验使用自体或异体msc治疗退行性疾病和自身免疫性疾病如神经退行性疾病、缺血性心脏病、抗宿主移植(gvhd)疾病等。体外动物实验和体内临床试验也均表明移植的msc可以归巢至损伤或炎症部位，通过细胞间接触或旁分泌作用，促进细胞存活、损伤细胞修复或分化为功能性细胞。
4.多种成体组织来源的msc已用于临床试验，但不同来源、不同培养方法甚至不同冻存条件都对细胞质量和功能有影响。原代分离的msc一般具有有限的增殖能力，长期培养后细胞的功能和分化潜力都受到影响，如骨髓来源msc倍增时间约3.75天，可以扩增到10代左右；脂肪来源msc倍增时间约1.6天，而脐带来源msc倍增时间更短，扩增能力也更强。除此之外，脐带来源msc具有更低的免疫原性和更强的免疫调节作用，且分泌更高的il-6、il-8等细胞因子。研究发现，不仅从不同组织来源如骨髓、脂肪和脐带血分离获取的msc具有不同的生物学特性，而且从不同健康供体来源的骨髓msc也具有不同的增殖能力和成骨分化潜能，这就导致msc细胞治疗临床试验中会产生不一致的数据。另外，不同年龄的供体所获得的msc质量不同，年老供体由于细胞衰老、dna损伤积聚以及代谢不稳定等因素使得msc扩增能力、分化潜能和临床使用受限。早期研究采用将hesc和基质细胞如op9细胞共培养的方法诱导分化为msc，但此方法培养时间久且诱导分化效率低；另外拟胚体(eb)方法也被用于msc的诱导，如使用pdgf-ab和fgf2诱导分化的msc细胞可经流式分选后获得；但这些方法不仅耗时而且效率不高，难以用于临床试验。目前尚未见到关于将诱导性多能干细胞诱导为间充质干细胞的报道。


技术实现要素：

5.针对上述现有技术，为克服获得间充质干细胞的方法耗时长、产量低的问题，本发明提供了一种将人诱导性多能干细胞间接诱导为间充质干细胞的培养液和方法。
6.本发明是通过以下技术方案实现的：
7.一种将人诱导性多能干细胞间接诱导为间充质干细胞的培养液，由神经外胚层诱导培养液、间充质干细胞分化培养液和间充质干细胞维持培养液组成。
8.所述神经外胚层诱导培养液，由neurobasal培养基、dmem/f12培养基、n2添加剂、b27添加剂、gsk3抑制剂和tgf-β抑制剂组成，其中，各组分的用量配比关系为：neurobasal培养基占47％～50％(体积百分数，下同)，n2添加剂占0.8～1.2％，b27添加剂占1.8～2.2％，gsk3抑制剂的浓度为8～12μm，tgf-β抑制剂的浓度为2.5～3.5μm，余量为dmem/f12培养基。
9.所述间充质干细胞分化培养液，由egf(表皮细胞生长因子)、bfgf(碱性成纤维细胞生长因子)和间充质干细胞维持培养液组成，其中，egf的浓度为4～6ng/ml，优选5ng/ml，bfgf的浓度为4～6ng/ml，优选5ng/ml。
10.所述间充质干细胞维持培养液为yinfengbio无血清培养基，该培养基是现有技术中已有的培养基，可常规市场购买得到，是北京银丰鼎诚生物科技有限公司自主研发的培养基，由400ml的mesenchy stem cell basal medium和100ml的mesenchy stem cell supplement组成。
11.优选的，所述神经外胚层诱导培养液中，各组分的用量配比关系为：neurobasal培养基占48.5％，n2添加剂占1.0％，b27添加剂占2.0％，gsk3抑制剂的浓度为10μm，tgf-β抑制剂的浓度为3.0μm，余量为dmem/f12培养基。
12.所述neurobasal培养基、dmem/f12培养基为常用的细胞培养基，可常规市场购买得到；所述n2添加剂、b27添加剂为常用的神经细胞培养添加剂，可常规市场购买得到。
13.所述tgf-β抑制剂选自sb431542，可常规市场购买得到；其可诱导干细胞向多方向细胞分化，包括内皮细胞、神经细胞等，也可直接用于胚胎干细胞向间充质样细胞的分化。
14.所述gsk3抑制剂选自chir99021，可常规市场购买得到；其是一种wnt信号的激活剂，与forskolin/isx-9/sb431542等试剂联合使用时诱导神经细胞的分化。
15.所述将人诱导性多能干细胞间接诱导为间充质干细胞的培养液在将人诱导性多能干细胞间接诱导为间充质干细胞中的应用。
16.一种将人诱导性多能干细胞间接诱导为间充质干细胞的方法，包括以下步骤：
17.(1)取诱导性多能干细胞，在37℃、5％co2条件下，采用神经外胚层诱导培养液定向分化培养6天，得培养液；定向分化培养期间每1～3天(优选1天)更换一次培养液；
18.(2)步骤(1)所得培养液(含神经外胚层细胞)，在37℃、5％co2条件下，采用间充质干细胞分化培养液分化培养7天，得培养液；定向分化培养期间每1～3天(优选1天)更换一次培养液；在间充质干细胞分化培养液的诱导下，神经外胚层细胞向间充质干细胞转变，生长因子可促进细胞的转变和快速生长，并维持细胞在生长过程中的良好状态；
19.(3)步骤(2)所得培养液，在37℃、5％co2条件下，采用间充质干细胞维持培养液培养3～5代，得间充质干细胞；培养期间每2～4天(优选2天)更换一次培养液。
20.本发明的培养液，采用neurobasal和dmem/f12基础培养基，并添加有维持细胞生
长必须的关键成分n2和b27等，以及gsk3抑制剂、tgf-β抑制剂、egf等因子，各组分定向起作用，可协同诱导ipscs细胞定向分化为间充质干细胞。培养液中含有特定的信号抑制剂，可以提高间充质干细胞的纯度和产量。
21.本发明的方法，可在较短时间内将诱导性多能干细胞定向分化为间充质干细胞。本发明以诱导性多能干细胞为起始，原材料数量不受限制，诱导性多能干细胞可以无限扩增，且避免了胚胎干细胞使用方面的道德争议。培养周期为2周左右，大大缩短了培养时间，降低了生产成本。本发明培养间充质干细胞使用的是无血清培养液，得到的间充质干细胞可快速向临床转化。
附图说明
22.图1：ips细胞的多能性鉴定结果示意图，其中，a、b、c分别表示内胚层、中胚层和外胚层。
23.图2：各阶段的细胞的形态示意图。
24.图3：流式细胞鉴定结果示意图。
具体实施方式
25.下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域技术人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。
26.下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法、检测方法，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法、检测方法。
27.本发明所使用的诱导性多能干细胞，是通过常规方法获得的：使用仙台病毒重编程试剂盒(invitrogen
tm
cytotune
tm-ips2.0仙台病毒重编程试剂盒，货号：a16517)，按照说明书，通过标准重编程方法，获得高频hla纯合子脐血来源单个核细胞来源的诱导性多能干细胞。
28.实施例1将人诱导性多能干细胞间接诱导为间充质干细胞
29.步骤如下：
30.(1)取诱导性多能干细胞，按照干细胞培养方法培养在六孔板中，每隔3～4天使用versene消化并传代，使用mtesr-1完全培养基培养在37℃，5％co2孵箱中。
31.准备做间充质干细胞分化前，使用versene传代并鉴定ips细胞的多能性表达(结果如图1所示，由图1可见，诱导分化所用ips细胞具有在体外分化为三个胚层的组织的能力)。当鉴定完成且细胞密度至70％时可进行分化实验。
32.(2)将传代至matrigel的细胞培养在37℃，5％co2条件下，待细胞密度80％时，加入神经外胚层诱导培养液(六孔板2ml/孔，sb431542和chir99021现用现加，基础培养液4℃保存不超过7天，且使用前30分钟取出置于室温预热)，于37℃，5％co2条件下培养6天，每天更换一次培养液。
33.(3)诱导6天结束时，浆细胞使用tryple消化并以8
×
104/cm2的密度接种于matrigel包被的六孔板中，使用间充质干细胞分化培养液进行诱导分化7天(生长因子现用
现配，基础培养基配置完成后可于4℃保存30天)，37℃、5％co2，每天更换一次培养液。
34.(4)诱导分化结束后，使用tryple将细胞消化并以4
×
104/cm2密度接种于matrigel包被的六孔板中，使用间充质干细胞维持培养液培养，37℃、5％co2，记为p0；每2天更换一次培养液。
35.p0代细胞培养至90％密度时传代培养，并以1
×
104/cm2密度接种于六孔板中，使用间充质干细胞维持培养液培养。培养得到p2代、p3代。
36.各阶段的细胞进行细胞形态鉴定，结果如图2所示，其中，由左至右、由上至下依次表示ips细胞、步骤(2)所得细胞、步骤(3)所得细胞、p0代细胞、p1代细胞、p2代细胞。由图2可见，阶段性诱导分化获得的imsc具有成纤维样典型形态。
37.对p0代细胞进行特征性蛋白表达(流式细胞技术)鉴定，结果如图3所示。由图3可见诱导分化的imsc表达msc细胞标志性marker。
38.结论：本发明的方法，操作简单，分化效率高，可行性强，可以很好的用于多能干细胞来源的间充质干细胞的诱导分化。
39.给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。

技术特征：
1.一种将人诱导性多能干细胞间接诱导为间充质干细胞的培养液，其特征在于：由神经外胚层诱导培养液、间充质干细胞分化培养液和间充质干细胞维持培养液组成；所述神经外胚层诱导培养液，由neurobasal培养基、dmem/f12培养基、n2添加剂、b27添加剂、gsk3抑制剂和tgf-β抑制剂组成，其中，各组分的用量配比关系为：neurobasal培养基占47％～50％，n2添加剂占0.8～1.2％，b27添加剂占1.8～2.2％，gsk3抑制剂的浓度为8～12μm，tgf-β抑制剂的浓度为2.5～3.5μm，余量为dmem/f12培养基；所述间充质干细胞分化培养液，由egf、bfgf和间充质干细胞维持培养液组成，其中，egf的浓度为4～6ng/ml，bfgf的浓度为4～6ng/ml。2.根据权利要求1所述的将人诱导性多能干细胞间接诱导为间充质干细胞的培养液，其特征在于：所述间充质干细胞维持培养液为yinfengbio无血清培养基。3.根据权利要求1所述的将人诱导性多能干细胞间接诱导为间充质干细胞的培养液，其特征在于：所述神经外胚层诱导培养液中，各组分的用量配比关系为：neurobasal培养基占48.5％，n2添加剂占1.0％，b27添加剂占2.0％，gsk3抑制剂的浓度为10μm，tgf-β抑制剂的浓度为3.0μm，余量为dmem/f12培养基。4.根据权利要求1所述的将人诱导性多能干细胞间接诱导为间充质干细胞的培养液，其特征在于：所述tgf-β抑制剂选自sb431542。5.根据权利要求1所述的将人诱导性多能干细胞间接诱导为间充质干细胞的培养液，其特征在于：所述gsk3抑制剂选自chir99021。6.根据权利要求1所述的将人诱导性多能干细胞间接诱导为间充质干细胞的培养液，其特征在于：所述间充质干细胞分化培养液中，egf的浓度为5ng/ml，bfgf的浓度为5ng/ml。7.权利要求1～6中任一项所述的培养液在将人诱导性多能干细胞间接诱导为间充质干细胞中的应用。8.一种将人诱导性多能干细胞间接诱导为间充质干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)取诱导性多能干细胞，在37℃、5％co2条件下，采用神经外胚层诱导培养液定向分化培养6天，得培养液；定向分化培养期间每1～3天更换一次培养液；(2)步骤(1)所得培养液，在37℃、5％co2条件下，采用间充质干细胞分化培养液分化培养7天，得培养液；定向分化培养期间每1～3天更换一次培养液；(3)步骤(2)所得培养液，在37℃、5％co2条件下，采用间充质干细胞维持培养液培养3～5代，得间充质干细胞；培养期间每2～4天更换一次培养液；所述神经外胚层诱导培养液，由neurobasal培养基、dmem/f12培养基、n2添加剂、b27添加剂、gsk3抑制剂和tgf-β抑制剂组成，其中，各组分的用量配比关系为：neurobasal培养基占47％～50％，n2添加剂占0.8～1.2％，b27添加剂占1.8～2.2％，gsk3抑制剂的浓度为8～12μm，tgf-β抑制剂的浓度为2.5～3.5μm，余量为dmem/f12培养基；所述间充质干细胞分化培养液，由egf、bfgf和间充质干细胞维持培养液组成，其中，egf的浓度为4～6ng/ml，bfgf的浓度为4～6ng/ml。9.根据权利要求8所述的将人诱导性多能干细胞间接诱导为间充质干细胞的方法，其特征在于：所述间充质干细胞维持培养液为yinfengbio无血清培养基。10.根据权利要求8所述的将人诱导性多能干细胞间接诱导为间充质干细胞的方法，其
特征在于：所述神经外胚层诱导培养液中，各组分的用量配比关系为：neurobasal培养基占48.5％，n2添加剂占1.0％，b27添加剂占2.0％，gsk3抑制剂的浓度为10μm，tgf-β抑制剂的浓度为3.0μm，余量为dmem/f12培养基；所述tgf-β抑制剂选自sb431542；所述gsk3抑制剂选自chir99021。

技术总结
本发明公开了一种将人诱导性多能干细胞间接诱导为间充质干细胞的培养液，由神经外胚层诱导培养液、间充质干细胞分化培养液和间充质干细胞维持培养液组成。所述神经外胚层诱导培养液由Neurobasal培养基、DMEM/F12培养基、N2添加剂、B27添加剂、GSK3抑制剂和TGF-β抑制剂组成。本发明还公开了一种将人诱导性多能干细胞间接诱导为间充质干细胞的方法：取诱导性多能干细胞，采用神经外胚层诱导培养液定向分化培养6天，然后采用间充质干细胞分化培养液分化培养7天，然后采用间充质干细胞维持培养液培养3～5代。本发明的方法可在较短时间内将诱导性多能干细胞定向分化为间充质干细胞，大大缩短了培养时间。大缩短了培养时间。大缩短了培养时间。


技术研发人员：刘菲 郭芳蕾 张癸荣 李明月 张文华 梁晓华
受保护的技术使用者：银丰生物工程集团有限公司
技术研发日：2023.07.26
技术公布日：2023/9/9