TPE-Ketoalkyne探针在制备鉴别尿酸盐和羟基磷灰石晶体产品中的应用

tpe-ketoalkyne探针在制备鉴别尿酸盐和羟基磷灰石晶体产品中的应用
技术领域
1.本发明涉及尿酸钠晶体鉴定技术领域，具体涉及tpe-ketoalkyne探针在制备特异性鉴别尿酸盐和羟基磷灰石晶体产品中的应用。


背景技术：

2.痛风性关节炎是一种最常见的关节炎疾病，其病理特征是尿酸盐(msu)晶体沉积在关节和软组织内，可导致关节的破坏。此外，msu晶体沉积可增加心血管和肾脏疾病的风险，损害患者的生活质量。痛风性关节炎的主要治疗策略是通过药物或手术减少msu晶体的沉积，因此及时准确的检测msu晶体是痛风性关节炎诊治和防止复发的关键。
3.痛风性关节炎通常由专业医生通过患者的临床表现并且结合相关检查诊断。因为不同类型晶体沉积引发急性关节炎的临床表现相似，因此临床上不仅需要我们利用技术检测msu晶体同时也要特异性鉴别与msu晶体相似的晶体。近年来，先进的影像学技术在痛风的诊断上不断更新，尤其是超声和双能计算机断层扫描(dect)，已经成为临床上检测msu晶体不可或缺的技术方法。
4.然而，超声扫描时间较长、特异性低，成功的超声诊断需要专业技术人员。dect有电离辐射，价格相对昂贵，在痛风早期的灵敏度较低。传统上检验员通过补偿偏振光显微镜(cplm)检测msu晶体是诊断痛风的金标准。但是相关人员在没有接受专业培训情况下cplm检测会增加识别msu晶体的错误率，导致一定的假阴性和假阳性。例如区分msu晶体和其他晶体如羟基磷灰石(hap)晶体可能是一个挑战。此外，检测过程耗时较长，导致临床工作效率低下，压力较大。受激拉曼散射(srs)显微镜是一种相对较新的技术，可以实现高速成像，现已成功诊断新鲜痛风组织，并可以根据定量化学分析识别关节液中的晶体。但实验室级仪器体积庞大，价格昂贵，给临床操作带来不便。鉴于目前的情况，该技术还局限于基础科研的应用。
5.因此，目前需要一种快速特异性标记msu晶体的方法或产品辅助诊断痛风。


技术实现要素：

6.为了克服现有技术中的缺陷，本发明提供了tpe-ketoalkyne探针在制备特异性鉴别尿酸盐和羟基磷灰石晶体产品中的应用。
7.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
8.本发明的第一方面是提供tpe-ketoalkyne探针在制备特异性鉴别尿酸盐和羟基磷灰石晶体产品中的应用，该产品包括与尿酸盐晶体特异性结合的tpe-ketoalkyne探针。
9.进一步地，上述产品的使用是基于激光共聚焦荧光成像技术。
10.进一步地，tpe-ketoalkyne探针在使用时采用的浓度是5-80μm。
11.本发明的第二方面是提供tpe-ketoalkyne探针在制备辅助诊断痛风性关节炎产品中的应用，该产品包括与尿酸盐晶体特异性结合的tpe-ketoalkyne探针。
12.进一步地，上述产品的使用是基于激光共聚焦荧光成像技术。
13.进一步地，tpe-ketoalkyne探针在使用时采用的浓度是5-80μm。
14.本发明的第三方面是提供一种特异性鉴别尿酸盐和羟基磷灰石晶体或辅助诊断痛风性关节炎的产品，该产品包括与尿酸盐晶体特异性结合的tpe-ketoalkyne探针。
15.进一步地，上述产品的使用是基于激光共聚焦荧光成像技术。
16.进一步地，tpe-ketoalkyne探针在使用时采用的浓度是5-80μm。
17.本发明的第四方面是提供一种特异性鉴别尿酸盐晶体和羟基磷灰石晶体的方法，将待测晶体样品加入至磷酸缓冲盐溶液中制备成溶液，然后滴加tpe-ketoalkyne探针并进行混合，通过激光共聚焦荧光成像进行观察。
18.本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
19.本发明优化了体外研究中msu晶体快速成像技术，采用tpe-ketoalkyne探针，其成像效果与临床上金标准方法cplm成像效果相同，尤其是对msu和hap晶体引起的不同类型的晶体性关节炎鉴别时更具有优势。此外此操作过程方便快速，不需要通过专业人员对晶体的折光性、形态学等判断和识别，仅仅通过是否产生聚集增强的荧光信号就可以鉴别msu和hap晶体。而且tpe-ketoalkyne探针产生的荧光与普通荧光不同，它不具有淬灭性，可供长时间监测，不仅为痛风相关的基础研究提供了良好的平台，而且还为临床上检测痛风提供了新的辅助手段。
附图说明
20.图1是7种tpe探针的化学结构示意图；其中，图a-g分别显示了tpe-nh2、tpe-2nh2、tpe-4nh2、tpe-cooh、tpe-2cooh、tpe-4cooh和tpe-ketoalkyne的化学结构；
21.图2显示了标样msu晶体溶液分别与7种tpe探针tpe-nh2、tpe-2nh2、tpe-4nh2、tpe-cooh、tpe-2cooh、tpe-4cooh、tpe-ketoalkyne的荧光成像结果；其中，图a显示了msu晶体溶液分别与tpe-nh2、tpe-2nh2和tpe-4nh2探针的荧光成像结果；图b显示了msu晶体溶液分别与tpe-cooh、tpe-2cooh和tpe-4cooh探针的荧光成像结果；图c显示了msu晶体溶液与tpe-ketoalkyne探针的荧光成像结果；图d显示了上述7种tpe探针与msu晶体混合后溶液的相对荧光强度；
22.图3显示了不同浓度的tpe-ketoalkyne探针与标样msu晶体共聚焦荧光成像结果；图a显示了msu晶体溶液分别与不同浓度的tpe-ketoalkyne探针混合后的荧光成像结果；图b显示了不同浓度tpe-ketoalkyne探针与msu晶体混合后溶液的相对荧光强度；图c显示了10μm tpe-ketoalkyne探针混合msu晶体的3d荧光成像结果；
23.图4通过激光共聚焦荧光成像和cplm成像显示了tpe-ketoalkyne探针特异性鉴别标样msu和hap晶体；其中，图a显示了tpe-ketoalkyne探针与标样msu晶体、hap晶体的共聚焦荧光成像结果；图b显示了tpe-ketoalkyne探针与标样msu和hap晶体等比例混合样品的共聚焦荧光成像结果；图c显示了tpe-ketoalkyne探针与标样msu晶体、hap晶体、标样msu和hap晶体等比例混合样品的cplm成像结果；
24.图5通过激光共聚焦荧光成像和cplm成像显示了tpe-ketoalkyne探针快速高效标记临床样本中的msu晶体；其中，图a-b分别显示了tpe-ketoalkyne探针标记关节液和痛风石中的msu晶体的激光共聚焦荧光成像结果；图c-d分别显示了tpe-ketoalkyne探针标记关
节液和痛风石中的msu晶体的cplm成像结果；图e显示了混合不同的时间(0、60、120s)后，tpe-ketoalkyne与msu晶体的荧光成像结果；图f通过3d成像结果显示了tpe-ketoalkyne探针与msu晶体结合的有效性。
具体实施方式
25.本发明提供了tpe-ketoalkyne探针在制备特异性鉴别尿酸盐和羟基磷灰石晶体产品中的应用。下面通过具体实施例和附图对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。
26.实施例中方法如无特殊说明的采用常规方法，使用的试剂如无特殊说明的使用常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。
27.实施例1
28.本实施例采用7种tpe探针(tpe-nh
21.、tpe-2nh
22.、tpe-4nh
23.、tpe-cooh
[4,5]
、tpe-2cooh
[6]
、tpe-4cooh
[7]
、tpe-ketoalkyne
[8,9]
；具体的化学结构如图1所示)基于荧光成像技术标记msu晶体，具体的实验步骤和结果如下：
[0029]
1.筛选标记标样msu晶体最有效的aie探针
[0030]
将标样msu晶体加入至磷酸缓冲盐溶液(pbs)中制备成浓度为50mg/ml的溶液，分别加入相同浓度(80μm)的tpe探针tpe-nh2、tpe-2nh2、tpe-4nh2、tpe-cooh、tpe-2cooh、tpe-4cooh和tpe-ketoalkyne进行激光共聚焦荧光成像。
[0031]
如图2所示，tpe-nh2、tpe-2nh2、tpe-4nh2探针散在分布于msu晶体溶液中并且荧光强度没有统计学差异(图2a)；tpe-4cooh、tpe-2cooh、tpe-cooh探针可以与标样msu晶体不同程度地结合，荧光强度表现出逐渐增强的趋势，其中tpe-cooh探针标记标样msu晶体荧光效果相对较好(图2b)；与前6种tpe探针相比，msu晶体明显增强了tpe-ketoalkyne的aie效应使得溶液中的相对荧光强度最强，所以tpe-ketoalkyne是标记标样msu晶体最有效的探针分子(图2c-d)。
[0032]
2.不同浓度的tpe-ketoalkyne探针与标样msu晶体共聚焦荧光成像
[0033]
将标样msu晶体加入至磷酸缓冲盐溶液(pbs)中制备成浓度为50mg/ml的溶液，分别加入不同浓度(5、10、20、40、60和80μm)的tpe-ketoalkyn探针进行激光共聚焦荧光成像。
[0034]
如图3所示，与最低浓度5μm tpe-ketoalkyne探针相比，随着探针浓度升高(10-80μm)，标样msu晶体溶液中的荧光强度逐渐增强且有统计学意义(图3a-b)。10μm tpe-ketoalkyne探针与msu晶体3d荧光成像结果进一步显示此探针结合标样msu晶体的有效性(图3c)。
[0035]
3.按照以下组别进行分组，并同时进行cplm成像和激光共聚焦荧光成像
[0036]
第一组样本是标样msu晶体、标样hap晶体、标样混合体系(将标样msu晶体和hap晶体等比例混合)，标样的制备已成熟且有商业化来源。
[0037]
第二组样本是患者关节液和痛风石中的msu晶体。
[0038]
两组中收集的每个样品分别加入至磷酸缓冲盐溶液(pbs)中制备成溶液：第一组标样msu晶体、标样hap晶体的浓度分别为50mg/ml，混合体系的浓度为25mg/ml，第二组关节液晶体的浓度为15mg/ml，痛风石晶体的浓度为100mg/ml。将每个样品溶液平均分配至两个离心管内，其中一管样品溶液通过cplm成像，另一管样品溶液滴加tpe-ketoalkyne探针(除
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技术特征：
1.tpe-ketoalkyne探针在制备特异性鉴别尿酸盐和羟基磷灰石晶体产品中的应用，其特征在于，所述产品包括与尿酸盐晶体特异性结合的tpe-ketoalkyne探针。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品的使用是基于激光共聚焦荧光成像技术。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，tpe-ketoalkyne探针在使用时采用的浓度是5-80μm。4.tpe-ketoalkyne探针在制备辅助诊断痛风性关节炎产品中的应用，其特征在于，所述产品包括与尿酸盐晶体特异性结合的tpe-ketoalkyne探针。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述产品的使用是基于激光共聚焦荧光成像技术。6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，tpe-ketoalkyne探针在使用时采用的浓度是5-80μm。7.一种特异性鉴别尿酸盐和羟基磷灰石晶体或辅助诊断痛风性关节炎的产品，其特征在于，所述产品包括与尿酸盐晶体特异性结合的tpe-ketoalkyne探针。8.根据权利要求7所述的产品，其特征在于，所述产品的使用是基于激光共聚焦荧光成像技术。9.根据权利要求7所述的产品，其特征在于，tpe-ketoalkyne探针在使用时采用的浓度是5-80μm。10.一种特异性鉴别尿酸盐晶体和羟基磷灰石晶体的方法，其特征在于，将待测晶体样品加入至磷酸缓冲盐溶液中制备成溶液，然后滴加tpe-ketoalkyne探针并进行混合，通过激光共聚焦荧光成像进行观察。

技术总结
本发明提供了TPE-Ketoalkyne探针在制备特异性鉴别尿酸盐和羟基磷灰石晶体产品中的应用，该产品包括与尿酸盐晶体特异性结合的TPE-Ketoalkyne探针。本发明优化了体外研究中MSU晶体快速成像技术，采用TPE-Ketoalkyne探针，其成像效果与临床上专业人员通过CPLM检测出双折光MSU晶体的效果相同，尤其是对MSU和HAP晶体引起的不同类型的晶体性关节炎鉴别时更具有优势。TPE-Ketoalkyne探针产生的荧光与普通荧光不同，它不具有淬灭性，可供长时间监测，不仅为痛风相关的基础研究提供了良好的平台，而且还为临床上检测痛风提供了新的辅助手段。段。段。


技术研发人员：王文娟 华英汇 陈子怡 徐翰林
受保护的技术使用者：复旦大学附属华山医院
技术研发日：2023.06.07
技术公布日：2023/9/9