用于DAB显色的DAB缓冲液和DAB染色液试剂盒的制作方法

用于dab显色的dab缓冲液和dab染色液试剂盒
技术领域
1.本技术涉及免疫组织化学染色领域，具体涉及用于dab显色的dab缓冲液和dab染色液试剂盒。


背景技术：

2.现有技术中的dab染色液试剂盒一般都包含阻断剂、反应增强液、酶标聚合物igg、dab浓缩液、dab缓冲液和苏木素等成分，主要用于病理科免疫组织化学染色。免疫组织化学染色是病理科常用技术之一，利用抗原抗体特异性结合的免疫学原理，通过酶促反应使抗原-抗体-酶标聚合物igg复合物在原位显色，来确定组织细胞中是否有目标抗原，并对目标抗原进行定位、定性的检测技术。
3.在dab染色液试剂盒中，酶标聚合物igg（俗称二抗、聚合物二抗）是最重要的组分。传统的二抗一般是以羊抗鼠或羊抗兔抗体与过氧化物酶（hrp）在化合物的作用下结合，其结合效率低，检测灵敏度差，已不能满足体外诊断试剂的需求。最近的聚合物二抗大部分是以多聚物为基板，通过多聚物上广泛的结合位点，将羊抗鼠、羊抗兔抗体以及hrp酶偶联到多聚物上。以多聚物为基板能够结合大量的抗体的和hrp酶，因此其检测灵敏度和染色效果相对于传统的二抗有了大幅的提升。但因为聚合物二抗原料技术和工艺的不同，不同的聚合物二抗原料的染色质量有较大的差距，原料价格也普遍偏高。
4.在dab染色液试剂盒的使用过程中，如何提高显色度也尤为重要。现有技术一般是以3,3二氨基联苯胺(dab)作为显色底物，以聚合物igg上标记的hrp催化dab显色。dab显色液一般是以dab浓缩液和dab缓冲液按照1:20的比例配制而成。dab缓冲液中含有对于显色至关重要的过氧化氢（h2o2），又由于h2o2具有不稳定、易分解的特性，导致dab缓冲液经常由于h2o2的分解而失效，造成免疫组织化学染色浅或阴性。因此，如何保持dab缓冲液中h2o2的稳定性至关重要。
5.dab的显色原理是：hrp催化h2o2氧化dab形成还原型的dab，还原型的dab不溶于水，会在抗原-抗体-酶标聚合物igg复合物的原位形成棕黄色沉淀。在这个反应过程中，由于h2o2和dab之间存在较高的标准电势差，同时h2o2自身理化性质的不稳定性，配制好的dab显色液会逐渐氧化并失效，不能长时间放置。因此现有的试剂盒使用的显色试剂是将dab配制成dab浓缩液，将h2o2配制成dab缓冲液，分开配制保存，并在使用时两者按照1:20现配现用。
6.综上所述，dab染色液试剂盒存在的问题主要包括：
①
由于h2o2的不稳定性而导致的试剂盒灵敏度低；
②
配制好的dab显色液稳定性差，保质期短。目前，公开号为cn113484313a的中国发明专利中通过添加dab增强剂，成分包括硫酸铜、氧化钠、氧化钾、蔗糖和苯扎氯铵，来提高免疫组化检测的强度和灵敏度；通过使用焦磷酸钠、edta来保护和稳定过氧化氢；通过甲基乙二醇延缓dab的氧化速率增加其稳定性。公开号为cn1595150a的中国发明专利中通过添加碳水化合物和聚合物抑制显色物的自动氧化活性来提高稳定性。公开号为cn110887831a的中国发明专利通过提供氨基葡聚糖来解决dab显色液稳定性差、保质期短的问题。公开号为cn110361245a的中国发明专利通过在缓冲液中添加焦磷酸二氢二
钠保护过氧化氢来增加稳定性。公开号为cn110567785a的中国发明专利通过添加表没食子儿茶酚没食子酸酯或其衍生物来提高dab工作液的稳定性。
7.然而上述专利无法在提高免疫组织化学染色的检测灵敏度的同时，还能够提高dab显色液的保存稳定性和降低成本，因此还有待提高。


技术实现要素：

8.为了在提高免疫组织化学染色的检测灵敏度的同时，还能够提高dab显色液的保存稳定性和降低成本，本技术提供用于dab显色的dab缓冲液和dab染色液试剂盒。
9.第一方面，本技术公开了一种用于dab显色的dab缓冲液，所述dab缓冲液的主要成分为过氧化氢、壬基酚聚氧乙烯醚、硫酸镁和柠檬酸三钠。
10.通过采用上述技术方案，dab缓冲液中的硫酸镁和柠檬酸三钠含有金属离子，能增强dab和过氧化氢之间的电子传递速度，使得dab显色液的反应时间更短、显色效率更高，最终提高了dab显色的灵敏度，进而提高了dab染色液试剂盒的检测灵敏度。壬基酚聚氧乙烯醚能够稳定过氧化氢，使其不易分解，因此能够在被配制后保存更久的时间，相对于现配现用的dab缓冲液来说，更加的节约成本。
11.在一些实施方案中，所述dab缓冲液由过氧化氢、咪唑、壬基酚聚氧乙烯醚、氯烃基二甲基苯甲胺、硫酸镁和柠檬酸三钠混合而成。
12.通过采用上述技术方案，dab缓冲液中的硫酸镁和柠檬酸三钠能增强dab和过氧化氢之间的电子传递速度，使得dab显色液的反应时间更短、显色效率更高，最终提高了dab显色的灵敏度，进而提高了dab染色液试剂盒的检测灵敏度。进一步地，dab缓冲液中的咪唑、壬基酚聚氧乙烯醚和氯烃基二甲基苯甲胺能够更加有效的稳定过氧化氢，因此在dab缓冲液与dab浓缩液按比例混合后，低温储存后对其效果影响极小，提高了dab显色液的保存稳定性，在放置几天之后仍具有较好的染色效果，因此可减少实验人员配制的频次，灵活安排实验。并且本技术公开的dab缓冲液的配制较为简单，并且配制之后可以在几天之内多次使用，不会造成浪费，相对于市面上现有的现配现用很快失效的dab缓冲液来说，不管是较低的市场价格，还是较高的利用率，均能有效的降低成本。
13.在一些实施方案中，所述过氧化氢的体积浓度为0.05-0.3%，所述咪唑的摩尔浓度为30-80mm，所述壬基酚聚氧乙烯醚的质量百分浓度为0.04-0.18%，所述氯烃基二甲基苯甲胺的体积浓度为0.006-0.015%，所述硫酸镁的摩尔浓度为0.5-2.2mm，所述柠檬酸三钠的摩尔浓度为0.6-1.8mm。
14.通过采用上述技术方案，在上述的浓度下的各种组分混合之后得到的dab缓冲液能够更好的延缓过氧化氢的分解速率，提高dab缓冲液的稳定性，从而进一步提高试剂盒的灵敏度，并且使得dab显色液在配制好之后可以放置更长的时间。
15.第二方面， 本技术公开了一种dab染色液试剂盒，包括阻断剂、反应增强液、酶标聚合物igg、dab浓缩液、dab缓冲液和苏木素，所述dab缓冲液为上述所述的用于dab显色的dab缓冲液。
16.在一些实施方案中，所述阻断剂为浓度为1-6%的过氧化氢溶液。
17.在一些实施方案中，所述反应增强液的主要成分为兔抗鼠免疫球蛋白。
18.在一些实施方案中，所述反应增强液的浓度为130-550ug/ml。
19.在一些实施方案中，所述dab浓缩液由1,2-丙二醇、水和dab配制而成。
20.通过采用上述技术方案，浓度为1%-6%的过氧化氢溶液能够在一定时间内失活内源性的过氧化物酶。兔抗鼠免疫球蛋白能够进一步促进结合，使显色更为灵敏。dab浓缩液中的1,2丙二醇可以抑制dab的自发氧化，可以延长配制后的使用时间。
21.在一些实施方案中，所述酶标聚合物igg是通过如下制备方法得到：s1.将3-15mg/ml的羊抗兔抗体、2-10mg/ml的羊抗鼠抗体混合均匀后加入12-26mg/ml的乙二醇壳聚糖多聚物，混合均匀后再加入20-50mg/ml的1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐和3-8mg/ml的n-羟基磺基琥珀酰亚胺，混匀后用0.03-0.2m 的hcl调ph值为2.2-5.4，室温避光反应2-8小时，得到a溶液备用；s2.在18-30mg/ml的聚乙二醇2000溶液中加入6-16mg/ml的过氧化物酶溶液，然后加入2-8mg/ml的聚乙二醇化smcc交联剂，避光反应2-8小时，得到b溶液备用；s3.将上述a、b两种溶液混合，加入1-4mg/ml的聚乙二醇化smcc交联剂，调整ph值为6.5-7.5，避光反应2-6小时，吸附洗脱后即得。
22.通过采用上述技术方案，1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（edac）能激活羧基和胺耦联形成酰胺键，而n-羟基磺基琥珀酰亚胺（nhs）能提高edac耦联反应的效率，nhs可控制并修饰碳二亚胺交联反应，用于与伯胺(—nh2)偶联的羧酸盐(—cooh)活化。将磺基-nhs与含有羧基的分子与碳二亚胺(edac)混合，即可合成衍生物。
23.聚乙二醇化smcc交联剂可与氨基和巯基基团发生反应，通过灵活的peg间隔臂不可逆地交联蛋白或肽，因此smcc交联剂能将聚乙二醇2000分子耦联于过氧化物酶分子上，聚乙二醇间隔臂有助于维持偶联物溶解度。
24.a液和b液混合后，smcc交联剂在蛋白和其他分子中的伯胺(-nh2)与巯氢基(-sh)基团之间进行交联，nhs基团在ph值介于7-9时与过氧化物酶分子中的赖氨酸和n端氨基团发生特异性高效反应，形成稳定的酰胺键。马来酰亚胺基团在ph值为6.5-7.5下与还原巯基反应，形成稳定的硫醚键。上述混合液纯化后即得酶标聚合物igg。
25.此方法制备得到的酶标聚合物igg具有反应灵敏度高，鼠兔通用，无背景和非特异性染色的特点，能够作为本dab试剂盒的二抗使用，使试剂盒的灵敏度和显色度大幅提高。
26.第三方面，本技术公开了一种dab染色液试剂盒的应用方法，所述dab染色液试剂盒的应用方法包括如下步骤：a1：脱蜡：a1.将切好的组织芯片在60-70℃下烘烤25-35min；a2. 烘烤后直接放入二甲苯中脱蜡3次，每次4-6min；a2：水化：b1.脱蜡后的切片依次使用浓度100%酒精水化2次，每次2-4min，使用浓度为95%的酒精水化2-4min，使用浓度为85%的酒精水化2-4min；b2.然后将水化后的切片放入纯化水中浸泡1-3min；a3：抗原热修复：c1.加入ph为9.0的edta修复液，加热至edta修复液开始沸腾后放入水化后的切片，然后使edta修复液间断性持续沸腾20min，然后缓慢冷却至室温；c2.将修复后的切片用蒸馏水浸泡1-3min；
a4：封阻内源性过氧化物酶：d1.甩掉切片上的液体，圈定切片上的待测组织区域；d2.然后将切片用pbst清洗4次，每次1-3min，注意防止干片；d3.每张切片的组织上均匀滴加90-110 ul的阻断剂，在室温孵育8-12 min；d4.洗掉阻断剂，用pbst溶液冲洗4次，每次1-3min；a5：一抗孵育：e1.甩掉pbst溶液，每张切片上均匀滴加100ul的一抗工作液，在室温下孵育28-32min；e2.孵育完成后，用pbst溶液冲4次，每次1-3min；a6：反应增强液孵育：f1.甩掉pbst溶液，每张切片上均匀滴加100ul的反应增强液，在室温下孵育10-20min;f2.孵育完成后，用pbst溶液冲4次，每次1-3min；a7：二抗孵育:g1.甩掉pbst溶液，每张切片上均匀滴加100ul的酶标聚合物igg，在室温下孵育10-20min;g2. 孵育完成后，用pbst溶液冲4次，每次1-3min；a8：dab显色:h1.甩掉pbst溶液，每张切片上均匀滴加150μl使用dab缓冲液和dab浓缩液新鲜配制的dab显色液,在室温下显色4-6min；h2.观察染色结果，然后用自来水浸泡冲洗2-4min；a9：苏木素复染：j1.甩掉组织上的水分，然后滴加150μl的苏木素染液复染，孵育1-3min；j2.然后立即放入自来水中清洗干净，并用自来水浸泡返蓝2-4min；a10：脱水封片：k1.切片返蓝后甩去水分，依次放入浓度为85%的酒精中脱水1-3min，浓度为95%的酒精中脱水1-3min，浓度为100%酒精脱水2次，每次1-3min；k2.取出切片后在60-70℃下烘干8-12min，切片烘干后滴加中性树胶封片。
27.通过采用上述技术方案，本技术公开的dab染色液试剂盒采用上述的应用方法，能够在使用过程中保持较好的使用稳定性，不容易轻易地改变显色的灵敏度，能够达到极高的染色质量。
28.综上所述，本技术包括以下至少一种有益技术效果：1.本技术公开的dab缓冲液中的硫酸镁和柠檬酸三钠能增强dab和过氧化氢之间的电子传递速度，使得dab显色液的反应时间更短、显色效率更高，最终提高了dab显色的灵敏度，进而提高了dab染色液试剂盒的检测灵敏度。进一步地，dab缓冲液中的壬基酚聚氧乙烯醚等组分能够稳定过氧化氢，因此在dab缓冲液与dab浓缩液按比例混合后，低温储存后对其效果影响极小，提高了dab显色液的保存稳定性，在放置几天之后仍具有较好的染色效果，因此可减少实验人员配制的频次，灵活安排实验。并且本技术公开的dab缓冲液的配制较为简单，并且配制之后可以在几天之内多次使用，不会造成浪费，相对于现配现用很快失
效的市面上现有的dab缓冲液来说，不管是较低的市场价格，还是较高的利用率，均能有效的降低成本。
29.2.本技术公开了酶标聚合物igg的制备方法，使用此制备方法制得的酶标聚合物igg具有灵敏度高、特异性好的特点，与上述公开的dab缓冲液和dab浓缩液配合使用能到达到极高的染色质量，并且市场价格较低，具有较好的应用前景。
附图说明
30.图1是本技术中实施例1(a)和对比例7(b)的染色结果；图2是本技术实施例3(a)和对比例3(b)的染色结果；图3是本技术实施例4(a)和对比例4(b)的染色结果；图4是本技术实施例5(a)和对比例5(b)的染色结果；图5是本技术实施例6(a)和对比例6(b)的染色结果；图6是本技术配制好的dab显色液在2-8℃放置0天的染色结果；图7是本技术配制好的dab显色液在2-8℃放置3天的染色结果；图8是本技术配制好的dab显色液在2-8℃放置7天的染色结果；图9是本技术dab显色液(a)和旧配方的dab显色液(b)在配制10秒后的显色结果。
具体实施方式
31.以下结合附图、制备例、实施例和对比例对本技术作进一步详细说明。本技术所用试剂除本技术制备之外均可通过市售得到。
32.制备例1dab染色液试剂盒的制备：1.dab缓冲液的制备方法为：在1000ml纯化水中加入3ml体积浓度为0.3%的过氧化氢、3.4g摩尔浓度为50mm的咪唑、1g质量浓度为0.1%的壬基酚聚氧乙烯醚、100ul体积浓度为0.01%的氯烃基二甲基苯甲胺、0.12g摩尔浓度为1mm的硫酸镁和0.258g摩尔浓度为1mm的柠檬酸三钠，混合均匀。
33.2.阻断剂的制备：阻断剂为浓度3%的过氧化氢溶液。
34.3.反应增强液的制备：市售得到，使用抗体稀释液稀释至320ug/ml。
35.4.酶标聚合物igg的制备：s1.将100ml的9mg/ml羊抗兔抗体、100ml的6mg/ml羊抗鼠抗体混合均匀后加入100ml的18mg/ml乙二醇壳聚糖多聚物，混合均匀后再加入20ml的40mg/ml的1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐和60ml的5mg/ml的n-羟基磺基琥珀酰亚胺，混匀后用0.1m 的hcl调ph值为3.0，室温避光反应6小时，得到a溶液备用；s2.在140ml的25mg/ml的聚乙二醇2000溶液中加入200ml的12mg/ml的过氧化物酶溶液，然后加入250ml的4mg/ml的聚乙二醇化smcc交联剂，避光反应4小时，得到b溶液备用；s3.将上述a、b两种溶液混合，加入800ml的2mg/ml的聚乙二醇化smcc交联剂，调整ph值为7.3，避光反应4小时，将得到的混合物溶液经过离子交换柱层析洗脱后，用蛋白a再次吸附洗脱，最后将洗脱的抗体用稀释液稀释后质检。
36.5.dab浓缩液的制备：将20%的1,2-丙二醇和80%的水混合后加入dab，配制为dab的
质量体积比为2%的溶液。
37.6.苏木素的制备：将1.2g苏木精、50g硫酸铝钾、0.2g碘酸钠、50g水合氯醛和20ml冰乙酸加入1000ml水中配制而成。
38.制备例2制备例2与制备例1的不同之处在于，dab缓冲液的制备方法为：在1000ml纯化水中加入3ml体积浓度为0.3%的过氧化氢、1g质量浓度为0.1%的壬基酚聚氧乙烯醚、0.12g摩尔浓度为1mm的硫酸镁和0.258g摩尔浓度为1mm的柠檬酸三钠，混合均匀。
39.制备例3制备例3与制备例1的不同之处在于，dab缓冲液的制备方法为：在1000ml纯化水中加入3ml体积浓度为0.3%的过氧化氢、0.12g摩尔浓度为1mm的硫酸镁和0.258g摩尔浓度为1mm的柠檬酸三钠，混合均匀。
40.制备例4制备例4与制备例1的不同之处在于，dab缓冲液的制备方法为：在1000ml纯化水中加入3ml体积浓度为0.3%的过氧化氢和1g质量浓度为0.1%的壬基酚聚氧乙烯醚。
41.实施例和对比例实施例1实施例1使用p16抗体，对宫颈组织进行免疫组织化学染色。
42.将制备例1制备得到的dab染色液试剂盒按照如下方法进行使用：a1：脱蜡：a1.将切好的组织芯片在65℃下烘烤30min；a2. 烘烤后直接放入二甲苯中脱蜡3次，每次5min；a2：水化：b1.脱蜡后的切片依次使用浓度100%酒精水化2次，每次3min，使用浓度为95%的酒精水化3min，使用浓度为85%的酒精水化3min；b2.然后将水化后的切片放入纯化水中浸泡2min；a3：抗原热修复：c1.加入ph为9.0的edta修复液，使用电磁炉在1800w下加热至edta修复液开始沸腾后放入水化后的切片，然后降电磁炉调至120w使edta修复液间断性持续沸腾20min，然后缓慢冷却至室温；c2.将修复后的切片用蒸馏水浸泡2min；a4：封阻内源性过氧化物酶：d1.甩掉切片上的液体，用免疫组化笔圈定切片上的待测组织区域；d2.然后将切片用pbst清洗4次，每次1min，注意防止干片；d3.每张切片的组织上均匀滴加100 ul的阻断剂，液体均匀覆盖整个组织，在室温孵育10 min；d4.洗掉阻断剂，用pbst溶液冲洗4次，每次1min；a5：一抗孵育：e1.甩掉pbst溶液，每张切片上均匀滴加100ul的一抗工作液，液体均匀覆盖整个组织，在室温下孵育30min；
e2.孵育完成后，用pbst溶液冲4次，每次1min；a6：反应增强液孵育：f1.甩掉pbst溶液，每张切片上均匀滴加100ul的反应增强液，液体均匀覆盖整个组织，在室温下孵育15min;f2.孵育完成后，用pbst溶液冲4次，每次1min；a7：二抗孵育:g1.甩掉pbst溶液，每张切片上均匀滴加100ul的酶标聚合物igg，液体均匀覆盖整个组织，在室温下孵育15min;g2. 孵育完成后，用pbst溶液冲4次，每次1min；a8：dab显色:h1.甩掉pbst溶液，每张切片上均匀滴加150μl使用dab缓冲液和dab浓缩液新鲜配制的dab显色液, dab缓冲液和dab浓缩液的体积之比为20：1，在室温下显色5min；h2.观察染色结果，一般显色时间不超过10min，然后用自来水浸泡冲洗3min；a9：苏木素复染：j1.甩掉组织上的水分，然后滴加150μl的苏木素染液复染，孵育1min；j2.然后立即放入自来水中清洗干净，并用自来水浸泡返蓝3min；a10：脱水封片：k1.切片返蓝后甩去水分，依次放入浓度为85%的酒精中脱水1min，浓度为95%的酒精中脱水1min，浓度为100%酒精脱水2次，每次1min；k2.取出切片后在65℃下烘10min，切片烘干后滴加中性树胶封片。
43.实施例2实施例2与实施例1的不同之处在于，实施例2对应使用制备例2制备得到的dab染色液试剂盒。
44.实施例3实施例3与实施例1的不同之处在于，实施例3使用p120抗体，对乳腺癌组织进行免疫组织化学染色。
45.实施例4实施例4与实施例1的不同之处在于，实施例4使用ttf-1抗体，对肺腺癌组织进行免疫组织化学染色。
46.实施例5实施例5与实施例1的不同之处在于，实施例5使用ck20抗体，对人体的结肠组织进行免疫组织化学染色。
47.实施例6实施例6与实施例1的不同之处在于，实施例6使用inhibin抗体，对人体胎盘组织进行免疫组织化学染色。
48.对比例1对比例1与实施例1的不同之处在于，对比例1对应使用制备例3制备得到的dab染色液试剂盒。
49.对比例2
对比例2与实施例1的不同之处在于，对比例2对应使用制备例4制备得到的dab染色液试剂盒。
50.对比例3对比例3与实施例1的不同之处在于，对比例3使用市售的迈新公司货号为kit-0014的dab染色液。
51.试剂盒组成如下：试剂1：内源性过氧化物酶阻断剂试剂2：酶标羊抗小鼠/兔igg聚合物试剂3a：加强型dab缓冲液（1x）试剂3b：加强型dab底物（20x）试剂3c：dab色原（20x）对比例3使用p120抗体，对乳腺癌组织进行免疫组织化学染色。
52.具体使用方法如下：1.脱蜡：（1）准备好的切片置于65℃烘箱中烤片2小时。
53.（2）烤完片后直接放入二甲苯中脱蜡2次，每次5min。
54.2、水化：（1）脱蜡后的切片依次按顺序使用浓度100%酒精水化2次，每次3min，使用浓度95%酒精水化2min，使用浓度85%酒精水化2min。
55.（2）然后切片放入蒸馏水中浸泡2min。
56.3、抗原热修复（1）在不锈钢锅中加入ph为9.0的edta修复液，使切片能完全浸没在溶液中。
57.（2）加入ph为9.0的edta修复液，使用电磁炉在1800w下加热至edta修复液开始沸腾后放入水化后的切片，然后降电磁炉调至120w使edta修复液间断性持续沸腾20min，然后缓慢冷却至室温。
58.（3）将修复后的切片用蒸馏水浸泡2min。
59.4.封阻内源性过氧化物酶（1）甩掉切片上的液体，用免疫组化笔圈定切片上的待测组织区域。
60.（2）然后将切片用pbst清洗4次，每次1min，注意防止干片。
61.（3）每张切片组织上加内源性过氧化物酶阻断剂2滴（约100ul），涂抹均匀覆盖整个组织，室温孵育10min。
62.（4）时间到后洗掉阻断剂，用pbst冲洗4次，每次1min。
63.5.一抗孵育（1）甩掉pbs，每张切片上加相应的一抗工作液2滴（约100ul），涂抹均匀覆盖整个组织，室温孵育60min。
64.（2）孵育完成后，用pbst冲洗4次，每次1min。
65.6.酶标羊抗小鼠/兔igg聚合物孵育（1）轻轻甩掉pbs，每张切片加酶标羊抗小鼠/兔igg聚合物2滴（约100ul），涂抹均匀覆盖整个组织，室温孵育20min。
66.（2）孵育完成后，用pbst冲洗4次，每次1min。
67.7.dab显色（1）轻轻甩掉pbs，每张切片加150μl新鲜配制的dab显色液（dab色原：加强型dab底物：加强型dab缓冲液按1:1:20配制，现配现用），室温显色3～5min。
68.（2）显微镜下观察染色结果，一般显色时间不超过10min，直接用自来水冲洗3min。
69.8.苏木素复染（1）自来水冲洗后，轻轻甩掉组织上的水分，然后滴加100～200μl苏木素染液复染，孵育30秒。
70.（2）时间到后立即放入自来水中清洗干净，并用自来水浸泡返蓝3min。
71.9.脱水封片（1）切片返蓝后甩去水分，依次放入浓度为85%的酒精中脱水1min，浓度为95%的酒精中脱水1min，浓度为100%酒精脱水2次，每次1min。
72.（2）取出切片后在65℃下烘10min，切片烘干后滴加中性树胶封片。
73.对比例4对比例4使用市售的上海基因科技公司货号为gk600505的dab染色液。
74.试剂盒组成如下：非特异性染色阻断剂（a液）酶标羊抗鼠/兔igg聚合物（b液）dab显色液（c1液）显色缓冲液（c2液）对比例4使用ttf-1抗体，对肺腺癌组织进行免疫组化染色。
75.对比例4的使用方法为：1.dab工作液的配制：实验前，按每毫升显色缓冲液（c2液）中加入1滴dab显色剂（c1液）（约40ul）的比例配制dab工作液，混匀后滴加显色，dab工作液应现配现用。配制好的dab工作液需在2小时内使用，如出现沉淀，使用前先混匀。
76.2.常规脱蜡水化：将石蜡切片浸于二甲苯中3次，每次5min。取出切片置于浓度为100％无水乙醇中2次，每次3min。再依次放入浓度为90%、80%、70%的酒精各3分钟。用pbs或tbs冲洗3次，每次3min。
77.3.抗原修复：（1）在不锈钢锅中加入ph为9.0的edta修复液，使切片能完全浸没在溶液中。
78.（2）加入ph为9.0的edta修复液，使用电磁炉在1800w下加热至edta修复液开始沸腾后放入水化后的切片，然后降电磁炉调至120w使edta修复液间断性持续沸腾20min，然后缓慢冷却至室温。
79.（3）将修复后的切片用蒸馏水浸泡2min。
80.4.抗原修复完毕后自然冷却的切片，用pbs或tbs冲洗3次，每次3min。
81.5.取出切片，甩掉并擦干切片上组织周围的液体，滴加非特异性染色阻断剂（a液）（常用3%过氧化氢）于组织上避光孵育10-15min。用pbs或tbs冲洗3次，每次3min。取出切片，甩掉并擦干组织周围的液体（组织切勿干燥）。
82.6.滴加80μl一抗工作液（兔抗或小鼠抗）于组织上，进行孵育（按照各自一抗说明
书操作）。一抗孵育完毕，用tbs或pbs冲洗切片。用pbs或tbs冲洗3次，每次3min，取出切片，甩掉并擦干组织周围的液体（组织切勿干燥）。
83.7.滴加80μl二抗b液(酶标羊抗鼠/兔igg聚合物)于组织上，室温孵育25min。孵育完毕，将切片置入 tbs 或 pbs中，冲洗3次，每次3min，取出切片，甩掉并擦干组织周围的液体（组织切勿干燥）。
84.8.滴加预备好的新鲜的显色剂dab工作液80μl，室温孵育8分钟，或光镜下控制显色。显色完全后，用蒸馏水冲洗终止显色。
85.9.自来水冲洗，苏木素复染。
86.10.使用浓度为70%、80%、90%和100%的酒精脱水，每次3min。取出切片置入二甲苯3次,每次5min。
87.11.切片经过脱水、透明，常规封片。
88.对比例5对比例5使用dab缓冲液的旧配方。
89.dab缓冲液的旧配方配制方法为：在1000ml纯化水中加入1ml体积浓度为0.1%的过氧化氢、3.4g摩尔浓度为50mm的咪唑、1g质量浓度为0.1%的壬基酚聚氧乙烯醚和100ul体积浓度为0.01%的氯烃基二甲基苯甲胺，混合均匀。
90.对比例5的使用方法与实施例1相同。
91.对比例5使用ck20抗体，对人体的结肠组织进行免疫组织化学染色。
92.对比例6对比例6与对比例5的不同之处在于，对比例6使用inhibin抗体，对人体胎盘组织进行免疫组织化学染色。
93.对比例7对比例7与对比例3的不同之处在于，对比例7使用p16抗体，对宫颈组织进行免疫组织化学染色。
94.实施例7将本发明dab染色液试剂盒中的dab浓缩液和dab缓冲液按照1:20稀释配制成dab显色液后在2-8℃分别放置第0天、3天和7天后，使用cd8抗体，对扁桃体组织进行免疫组化染色。
95.性能检测1.在显微镜100x视野下观察上述实施例和对比例的染色结果，结果见附图。
96.从实施例1和对比例7（图1）中p16抗体对宫颈组织进行免疫组织化学染色结果可以看出，与市售的迈新公司货号为kit-0014的dab染色液相比，本发明dab染色液试剂盒的染色强度更强，灵敏度更高。
97.从实施例3和对比例3（图2）中p120抗体的对乳腺癌组织进行免疫组织化学染色结果可知，本发明dab染色液试剂盒的染色强度明显比市售的迈新公司货号为kit-0014的dab染色液更强，染色灵敏度更高，且无背景染色。
98.从实施例4和对比例4（图3）中ttf-1抗体的对肺腺癌组织进行免疫组织化学染色结果可知，本发明dab染色液试剂盒的染色强度明显比市售的上海基因科技公司货号为gk600505的dab染色液更强，染色灵敏度更高，且无背景染色。
99.从实施例5和对比例5（图4）中ck20抗体的对人体的结肠组织进行免疫组织化学染色结果可知，本发明dab染色液试剂盒的染色效果明显优于旧配方的dab染色液，且显色速度更快，所需的显色时间更短。
100.从实施例6和对比例6（图5）中inhibin抗体的对人体胎盘组织进行免疫组织化学染色结果可知，本发明dab染色液试剂盒的染色效果明显优于旧配方的dab染色液，且显色速度更快，所需的显色时间更短。
101.从图6-8可以看出本技术配制好的dab显色液在2-8℃放置0天、3天和7天之后，dab显色液在7天内的显色效果没有显著差异，显色质量非常优秀，没有出现时间长后显色效果显著下降的情况，稳定性良好。
102.从图9可以看出，10秒之后，本技术的dab显色液的显色效果优于旧配方的dab显色液的显色效果，且显色速度更快，所需的显色时间更短。并且，对于旧配方的dab显色液，在放置7天之后已经没有染色效果（阴性）。
103.综上所述，本技术dab染色液试剂盒显色速度更快，显色时间更短，并且配制好的dab显色液稳定性良好。原因在于，本技术dab缓冲液中的金属离子能增强dab和h2o2之间的电子传递速度，使得dab显色液的反应时间更短、显色效率更高，最终提高了dab显色的灵敏度。本技术所公开的dab染色液试剂盒中酶标聚合物igg灵敏度高，并且特异性好，配合试剂盒内的dab浓缩液和缓冲液使用能到达到极高的染色质量，并且市场价格较低，在体外诊断行业中具有很好的应用前景。并且dab缓冲液与dab浓缩液按1:20比例混合后，2-8℃放置7天没有影响，仍具有较好的染色效果，因此可减少实验人员配制的频次，灵活安排实验。因此，本技术dab染色液试剂盒在提高免疫组织化学染色的检测灵敏度的同时，还能够提高dab显色液的保存稳定性和降低成本。
104.以上均为本技术的较佳实施例，并非依此限制本技术的保护范围，故：凡依本技术的结构、形状、原理所做的等效变化，均应涵盖于本技术的保护范围之内。

技术特征：
1.一种用于dab显色的dab缓冲液，其特征在于：所述dab缓冲液的主要成分为过氧化氢、壬基酚聚氧乙烯醚、硫酸镁和柠檬酸三钠。2.根据权利要求1所述的一种用于dab显色的dab缓冲液，其特征在于：所述dab缓冲液由过氧化氢、咪唑、壬基酚聚氧乙烯醚、氯烃基二甲基苯甲胺、硫酸镁和柠檬酸三钠混合而成。3.根据权利要求2所述的一种用于dab显色的dab缓冲液，其特征在于：所述过氧化氢的体积浓度为0.05-0.3%，所述咪唑的摩尔浓度为30-80mm，所述壬基酚聚氧乙烯醚的质量百分浓度为0.04-0.18%，所述氯烃基二甲基苯甲胺的体积浓度为0.006-0.015%，所述硫酸镁的摩尔浓度为0.5-2.2mm，所述柠檬酸三钠的摩尔浓度为0.6-1.8mm。4.一种dab染色液试剂盒，包括阻断剂、反应增强液、酶标聚合物igg、dab浓缩液、dab缓冲液和苏木素，其特征在于：所述dab缓冲液为权利要求1-3任一所述的用于dab显色的dab缓冲液。5.根据权利要求4所述的一种dab染色液试剂盒，其特征在于：所述阻断剂为浓度为1-6%的过氧化氢溶液。6.根据权利要求4所述的一种dab染色液试剂盒，其特征在于：所述反应增强液的主要成分为兔抗鼠免疫球蛋白。7.根据权利要求6所述的一种dab染色液试剂盒，其特征在于：所述反应增强液的浓度为130-550ug/ml。8.根据权利要求4所述的一种dab染色液试剂盒，其特征在于：所述dab浓缩液由1,2-丙二醇、水和dab配制而成。9.根据权利要求4所述的一种dab染色液试剂盒，其特征在于：所述酶标聚合物igg是通过如下制备方法得到：s1.将3-15mg/ml的羊抗兔抗体、2-10mg/ml的羊抗鼠抗体混合均匀后加入12-26mg/ml的乙二醇壳聚糖多聚物，混合均匀后再加入20-50mg/ml的1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐和3-8mg/ml的n-羟基磺基琥珀酰亚胺，混匀后用0.03-0.2m 的hcl调ph值为2.2-5.4，室温避光反应2-8小时，得到a溶液备用；s2.在18-30mg/ml的聚乙二醇2000溶液中加入6-16mg/ml的过氧化物酶溶液，然后加入2-8mg/ml的聚乙二醇化smcc交联剂，避光反应2-8小时，得到b溶液备用；s3.将上述a、b两种溶液混合，加入1-4mg/ml的聚乙二醇化smcc交联剂，调整ph值为6.5-7.5，避光反应2-6小时，吸附洗脱后即得。

技术总结
本申请涉及免疫组织化学染色领域，具体涉及用于DAB显色的DAB缓冲液和DAB染色液试剂盒。本申请公开用于DAB显色的DAB缓冲液，主要成分为过氧化氢、壬基酚聚氧乙烯醚、硫酸镁和柠檬酸三钠。DAB缓冲液中金属离子能增强DAB和过氧化氢之间的电子传递速度，提高显色灵敏度。壬基酚聚氧乙烯醚能稳定过氧化氢，使其保存更久，节约成本。本申请还公开DAB染色液试剂盒，包括阻断剂、反应增强液、酶标聚合物IgG、DAB浓缩液、DAB缓冲液和苏木素，以及上述用于DAB显色的DAB缓冲液。本申请的DAB染色液试剂盒在提高免疫组织化学染色的检测灵敏度的同时，还能够提高DAB显色液的保存稳定性和降低成本。成本。


技术研发人员：胡杰锋 刘恒生 汪鹏 李德强
受保护的技术使用者：杭州百殷生物科技有限公司
技术研发日：2023.05.31
技术公布日：2023/9/9