一种负载抗原多肽的白蛋白递送系统及其制备方法和应用与流程

1.本发明属于医学生物材料技术领域，尤其涉及一种负载多肽的递送系统，具体涉及一种负载多肽的白蛋白递送系统及其制备方法和应用。


背景技术：

2.肿瘤多肽疫苗已在临床上被证明能够有效实现个性化肿瘤免疫治疗，通过肿瘤特异性过表达的肿瘤相关抗原，或是肿瘤发生发展中产生的肿瘤新生抗原，来激活人体自身的免疫系统来杀灭肿瘤细胞。然而，多肽的体内稳定性较差、半衰期短，且难以通过细胞膜，在给药时需要借助医学影像注射于淋巴结附近才能发挥作用，从而限制了多肽疫苗的临床应用。
3.纳米药物是将药物分子负载于纳米材料中，能够显著提高药物的生物安全性、体内靶向性，增加药物在靶细胞中的摄取能力，并且延长体内半衰期，已有多种负载化疗药物的纳米药物成功上市或处在临床研究阶段。对于多肽抗原而言，将其负载于纳米递送系统中亦是提高多肽体内稳定性与抗原递呈细胞摄取的有效策略。
4.现有的多肽药物纳米递送系统的制备方法是依靠两亲性高分子聚合物材料与多肽的疏水或静电作用，通过自组装形成纳米颗粒，并将多肽分子封装在纳米颗粒当中。然而，对于个性化多肽抗原而言，不同多肽的等电点、亲疏水性等理化特性差异巨大，运用上述技术方法进行包载会导致包封率各不相同，不仅提高了生产成本，更是严重影响制剂的质量控制与批次间的差异，以及多肽在体内的生物学作用。另外，高分子材料的使用也面临着巨大的安全隐患。
5.白蛋白作为人体内源性的物质具有极佳的生物安全性，是理想的药物递送载体。目前，用白蛋白包载药物分子主要亦是通过疏水作用，亦或是药物分子本身与白蛋白的结合能力。例如，用来包载小分子化疗药物——紫杉醇的白蛋白纳米药物已经成功上市，用于乳腺癌的治疗，能够显著提高药物的疗效和降低毒副作用。然而，这种包载机制也无法对亲水性较好的分子，如多肽，进行高效包载，且制备工艺较为复杂。因而，另外一种白蛋白纳米递送系统的制备方法是利用戊二醛作为交联剂，将白蛋白互相交联形成固相纳米颗粒。该技术虽然简化了工艺步骤，但是戊二醛本身具有很强的毒性，且制备时间较长，通常需要过夜反应。


技术实现要素：

6.鉴于现有技术的上述缺陷，本发明供一种负载抗原多肽的白蛋白递送系统及其制备方法和应用，采用的具体技术方案如下：
7.在本发明的第一方面，提供一种负载抗原多肽的白蛋白递送系统，主要由抗原多肽、交联剂、白蛋白制备而成，其特征在于，所述交联剂两端均有氨基反应性。
8.在一些具体实施方案中，所述交联剂两端均为琥珀酰亚胺酯(nhs)基团或琥珀酰亚胺酯基团衍生物，琥珀酰亚胺酯基团如式i所示：
[0009][0010]
式i中，r为c
nh2n
，其中n为1～10。
[0011]
在一些具体实施方案中，所述交联剂为含有二硫键的生物可降解的交联剂，包括二硫双(琥珀酰亚胺丙酸酯)(dsp)、3,3
’‑
二硫双(磺基琥珀酰亚胺丙酸酯)(dtssp)中的一种或一种以上。磺基的引入使dtssp具有强水溶性。
[0012]
在一些具体实施方案中，所述交联剂为不含有二硫键的生物可降解的交联剂，包括双琥珀酰亚胺辛二酸酯(dss)、二(磺基琥珀酰亚胺)辛二酸酯(bs3)中的一种或以上。磺基的引入使bs3具有强水溶性。
[0013]
在一些具体实施方案中，所述抗原多肽选自卵清白蛋白ova的cd8表位短肽(siinfekl)(以下简称ova肽)、mc38新抗原多肽dtx31、lmo7中的一种。
[0014]
多肽也可使用其他任意多肽。
[0015]
在一些具体实施方案中，所述白蛋白选自多个不同物种的血清白蛋白，具体为选自牛血清白蛋白(bsa)、人血清白蛋白(hsa)、小鼠血清白蛋白(msa)中的一种。
[0016]
在本发明的第二方面，提供一种负载抗原多肽的白蛋白递送系统的制备方法，包括如下步骤：
[0017]
(一)将抗原多肽与交联剂用有机溶剂溶解后形成溶液，室温下反应；
[0018]
(二)将白蛋白溶解于溶剂中形成白蛋白水溶液，加入有机溶剂，搅拌；
[0019]
(三)混合步骤(一)、步骤(二)的溶液，搅拌一段时间；
[0020]
(四)除去步骤(二)中的有机溶剂，用冻干保护剂的水溶液稀释。
[0021]
在一些具体实施方案中，所述负载抗原多肽的白蛋白递送系统的制备方法，包括如下步骤：
[0022]
(一)将物质的量比为1:5～1:40的抗原多肽与交联剂用有机溶剂溶解，制成浓度为1～10mg/ml的抗原多肽溶液，室温反应30～60分钟；
[0023]
(二)将白蛋白溶解于溶剂中形成浓度为5～25mg/ml的白蛋白水溶液；加入与白蛋白水溶液体积比为1:0-1:5的有机溶剂，室温搅拌5～30分钟；
[0024]
(三)混合步骤(一)、步骤(二)的溶液，白蛋白:交联剂:抗原多肽的物质的量比为1:5～40:1～8，25℃下搅拌2小时，或4℃下搅拌16小时。
[0025]
(四)除去步骤(二)中的有机溶剂，用含有1～10％冻干保护剂的水溶液稀释。
[0026]
步骤(二)中加入有机溶剂使白蛋白溶液变性，加入的量能够影响白蛋白多肽制剂的粒径。
[0027]
在一些具体实施方案中，所述步骤(一)中有机溶剂为二甲亚砜；所述步骤(二)和步骤(四)中的有机溶剂为乙醇；所述步骤(二)中的溶剂包括去离子水、nacl溶液、磷酸盐缓冲液中的一种；所述冻干保护剂含有糖类物质，糖类物质选自海藻糖、蔗糖、甘露糖、乳糖、麦芽糖和甘露醇中的一种或一种以上。
[0028]
在本发明的第三方面，提供所述一种负载抗原多肽的白蛋白递送系统在制备肿瘤免疫治疗产品中的应用。
[0029]
与现有技术相比，本发明具备如下有益效果：
[0030]
1、通过小分子交联剂化学负载抗原多肽，使抗原多肽的负载效率相较于传统的物理包载的包封率显著提升，并实现不同理化性质的抗原多肽的高效负载。
[0031]
2、相比于现有使用戊二醛交联的制备技术，本发明使用小分子交联剂使反应时间更短，避免了戊二醛的潜在毒性。
[0032]
3、现有技术所采用的聚合物材料或者脂质材料面临潜在的生物安全性问题，本发明所采用的是白蛋白纳米递送系统，运用药物辅料级的血清白蛋白即可制备，粒径均一，具有良好的生物相容性和安全性。
[0033]
4、利用白蛋白分子的淋巴结靶向能力，该递送系统有着高效的淋巴结迁移能力，并且在抗原递呈细胞中的摄取能力是裸肽的10倍以上，能够实现抗原多肽在体内的高效递送与呈递。
[0034]
以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
[0035]
图1是负载抗原多肽的白蛋白递送系统的制备示意图。图1示意图采用的交联剂为dsp，白蛋白溶液中加入的有机溶剂为乙醇。
[0036]
图2是负载ova多肽的hsa纳米颗粒高分辨透射电镜照片。
[0037]
图3是负载抗原多肽的白蛋白递送系统在dc细胞中的细胞摄取。
[0038]
图4是负载抗原多肽的白蛋白递送系统在dc细胞中细胞摄取的平均荧光强度。
[0039]
图5是负载抗原多肽的白蛋白递送系统的体内淋巴结靶向性评价。
[0040]
图6是负载ova多肽的白蛋白递送系统在过表达ova的mc38荷瘤小鼠模型中的肿瘤生长曲线。
[0041]
图7是负载ova多肽的白蛋白递送系统在过表达ova的mc38荷瘤小鼠模型中实验终点的肿瘤照片。图中编号分别是每只小鼠的耳标编号和肿瘤体积(单位：mm3)。
具体实施方式
[0042]
为了使发明实现的技术手段、创造特征、达成目的和功效易于明白了解，下结合具体图示，进一步阐述本发明。但本发明不仅限于以下实施的案例。
[0043]
须知，本说明书所附图式所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。
[0044]
实施例1通过交联剂化学连接方法制备负载抗原多肽的白蛋白递送系统本实施例示出了本发明的使用化学交联剂制备负载抗原多肽的白蛋白纳米颗粒的示例性方法。所用的示例性白蛋白是牛血清白蛋白(bsa)和人血清白蛋白(hsa)，交联剂为二硫双(琥珀酰亚
胺丙酸酯)(dsp)，抗原多肽为ova多肽。
[0045]
负载抗原多肽的白蛋白递送系统的制备方法，包括如下步骤：
[0046]
(一)将抗原多肽与交联剂用有机溶剂二甲亚砜溶解后形成溶液，室温下反应30分钟；
[0047]
(二)将白蛋白溶解于不同盐浓度和ph的磷酸盐缓冲液中形成白蛋白水溶液；加入有机溶剂乙醇，室温下搅拌15分钟；
[0048]
(三)向白蛋白溶液中缓慢滴加入不同比例的抗原多肽-交联剂溶液，搅拌，在室温下反应2小时或4℃反应16小时，用高压微射流均质进行均质；
[0049]
(四)用超滤管进行浓缩并除去溶液中的游离多肽、乙醇，并将溶液更换为pbs。
[0050]
采用间接法检测包封率，用高效液相色谱(hplc)检测超滤液中游离多肽含量，包封率计算方法：包封率(％)＝(投料总多肽量-超滤液中游离多肽量)/投料总多肽量*100％。
[0051]
采用纳米粒度仪检测颗粒尺寸和粒径分布。
[0052]
其他实验条件和结果如表1、表2所示。
[0053]
表1负载抗原多肽的bsa递送系统及粒径、包封率检测结果
[0054][0055]
表2负载抗原多肽的hsa递送系统及粒径、包封率检测结果
[0056][0057]
如表1和表2所示，负载抗原多肽的白蛋白递送系统的粒径尺寸与反应溶液的ph值、盐浓度、白蛋白的浓度、白蛋白溶液和乙醇体积比都有关。在一些实施方案中，白蛋白溶液中加入乙醇后进行白蛋白-交联剂-多肽的反应时，所制备的白蛋白递送系统为100nm～300nm的纳米颗粒。图2为负载ova多肽的hsa纳米颗粒的高分辨透射电镜照片，对应表2中的试验品1。在另一些实施方案中，白蛋白溶液中不加入乙醇即进行白蛋白-交联剂-多肽的反应后，所制备的白蛋白递送系统为750nm～1500nm的微米颗粒。
[0058]
综上，运用本方法制备的示例性负载抗原多肽的白蛋白递送系统具有粒径均一、包封率较高的特点。
[0059]
实施例2负载抗原多肽的白蛋白递送系统冷冻保护剂的研究
[0060]
该实施例展示了用本方法制备的负载抗原多肽的白蛋白递送系统使用不同的冷冻保护剂在冻干-复溶前后的粒径尺寸和分散度。表3中的试验品来自实施例1的表1中的试验品1。
[0061]
将用本方法制备的负载抗原多肽的白蛋白递送系统的药物制剂溶液用超滤更换成不同的冷冻保护剂溶液，然后冻干并复溶。用粒度仪检测冻干-复溶前后的粒径尺寸和分散度。
[0062]
表3负载抗原多肽的白蛋白递送系统冷冻保护剂选择对粒径尺寸和分散度的影响
[0063][0064]
如表3所示，用本发明的方法制备的负载多肽的白蛋白递送系统能够兼容多种冷冻保护剂，包括蔗糖、甘露糖和海藻糖。多种粒径尺寸的药物制剂溶液在加入冷冻保护剂并冻干-复溶后，粒径尺寸和分散度pdi均没有发生显著的增加。
[0065]
实验例1负载抗原多肽的白蛋白递送系统的细胞摄取实验
[0066]
本实验例中比较了负载lmo7荧光肽的白蛋白递送系统与游离多肽在树突状细胞(dc细胞)中的细胞摄取能力。
[0067]
将dc2.4细胞按2
×
105细胞/孔的密度铺到12孔板中，每孔添加500μl dmem完全培养基(含10％ fbs、100u/ml青霉素、100u/ml链霉素)，在37℃、5％ co2培养箱中孵育过夜。
[0068]
将游离的荧光肽、负载荧光肽的白蛋白(白蛋白-多肽)纳米颗粒(实施例1表1中的试验品8)和微米颗粒(实施例1表1中的试验品10)按照多肽浓度为50μg/ml的工作浓度分别加入到每孔细胞中，轻轻混合后在37℃、5％ co2培养箱中孵育4小时。先除去培养基，再用pbs洗1～2次，之后每孔加150μl 0.25％胰蛋白酶-edta，在37℃、5％ co2培养箱中孵育2分钟。轻轻敲打细胞板使大部分细胞脱落，再加入150μl dmem完全培养基以终止胰酶消化。收集细胞，1500rpm离心5分钟。用500μl含有2％ fbs的1
×
pbs重悬细胞。最后用流式细胞仪检测带有荧光的细胞比例和荧光强度。
[0069]
如图3和图4所示，白蛋白-多肽纳米颗粒和微米颗粒在dc细胞中的细胞摄取能力相较游离多肽有显著提高。白蛋白-多肽纳米颗粒摄取阳性的细胞比例为游离多肽的14.5倍，而白蛋白-多肽微米颗粒摄取阳性的细胞比例为游离多肽的16.0倍。白蛋白-多肽纳米颗粒摄取的细胞平均荧光强度为游离多肽的46.7倍，而负白蛋白-多肽微米颗粒摄取的细胞平均荧光强度为游离多肽的16.9倍。
[0070]
综上，本发明的方法所制备的负载抗原多肽的白蛋白递送系统能够实现抗原多肽在抗原递呈细胞的高效递送。
[0071]
实验例2负载抗原多肽的白蛋白递送系统的体内淋巴结靶向性实验
[0072]
本实验例中，验证了用本发明的方法制备的负载抗原多肽的白蛋白递送系统在小鼠体内的淋巴结靶向能力。
[0073]
采用实施例1表1中的试验品1，首先制备了cy5.5荧光标记的负载抗原多肽的白蛋白递送系统。将白蛋白-抗原多肽纳米颗粒分散在pbs溶液中，一边搅拌一边滴加浓度为10mg/ml的cy5.5-琥珀酰亚胺酯的二甲亚砜溶液。其中，白蛋白与cy5.5-琥珀酰亚胺酯的物质的量比为1:2。继续在室温下搅拌反应2小时，将cy5.5标记后的纳米颗粒用透析的方法(mwco 100k)将未标记上的游离cy5.5-琥珀酰亚胺酯除去，并将溶液更换为生理盐水。用超滤(mwco 100k)将溶液样品浓缩至多肽浓度为0.5mg/ml。
[0074]
取6周龄的c57bl/6小鼠4只，以50μg多肽/只的剂量，在小鼠的尾巴根部皮下注射。另取一只6周龄的c57bl/6小鼠作为未给药的空白对照。24小时后，用小动物活体成像系统对小鼠进行荧光成像。然后，将小鼠麻醉处死，解剖腋窝淋巴结和腹股沟淋巴结，进行离体拍摄，并进行荧光定量分析。
[0075]
如图5所示，cy5.5荧光标记的白蛋白-多肽纳米颗粒在小鼠皮下注射24小时后在腹股沟淋巴结和腋窝淋巴结都有明显的富集。证明本发明的方法所制备的负载多肽的白蛋白递送系统具有优秀的体内淋巴结迁移和靶向能力。
[0076]
实验例3负载抗原多肽的白蛋白递送系统的体内抑瘤效果实验
[0077]
bsa-ova微米颗粒来自实施例1表1中的试验品9；
[0078]
hsa-ova微米颗粒来自实施例1表2中的试验品2；
[0079]
hsa-ova纳米颗粒来自实施例1表2中的试验品1；
[0080]
hsa-ova溶液的制备方法参照实施例1表1的试验品5，白蛋白溶液:乙醇体积变为1:0.5，其他制备条件相同。
[0081]
将每个组别按ova多肽与polyic佐剂质量比4:1分别进行混合。
[0082]
取6周龄的c57bl/6小鼠，分为5组，每组10只，分别用bsa-ova微米颗粒、hsa-ova微米颗粒、hsa-ova纳米颗粒、hsa-ova溶液混合polyic佐剂，以及单独使用polyic进行皮下免疫，每天一次，连续四天，剂量为每只小鼠每剂50μg ova多肽和12.5μg polyic佐剂。在第四次免疫后的第四天，于每只小鼠皮下接种6
×
105过表达ova蛋白的mc38结肠癌细胞，并于接种肿瘤当天、第七天与第十四天进行后三次相同剂量的皮下免疫。连续观察测量肿瘤生长，于接种肿瘤后的第28天将实验动物麻醉处死，取各免疫组的肿瘤组织。
[0083]
如图6和图7所示，相较于polyic对照，溶液形式的hsa-ova偶联物具有一定的肿瘤抑制能力，但肿瘤仍有显著的生长趋势。相较而言，负载ova多肽的白蛋白微米制剂与纳米制剂具有显著的体内抑瘤效果。
[0084]
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

技术特征：
1.一种负载抗原多肽的白蛋白递送系统，主要由抗原多肽、交联剂、白蛋白制备而成，其特征在于，所述交联剂两端均有氨基反应性。2.根据权利要求1所述的负载抗原多肽的白蛋白递送系统，其特征在于，所述交联剂两端均为琥珀酰亚胺酯基团或琥珀酰亚胺酯基团衍生物，所述琥珀酰亚胺酯基团如式i所示：式i中，r为c
n
h
2n
，其中n为1～10。3.根据权利要求1或2任一项所述的负载抗原多肽的白蛋白递送系统，其特征在于，所述交联剂为含有二硫键的生物可降解的交联剂，包括二硫双(琥珀酰亚胺丙酸酯)、3,3
’‑
二硫双(磺基琥珀酰亚胺丙酸酯)中的一种或一种以上。4.根据权利要求1或2任一项所述的负载抗原多肽的白蛋白递送系统，其特征在于，所述交联剂为不含有二硫键的生物可降解的交联剂，包括双琥珀酰亚胺辛二酸酯、二(磺基琥珀酰亚胺)辛二酸酯中的一种或以上。5.根据权利要求1所述的负载抗原多肽的白蛋白递送系统，其特征在于，所述抗原多肽选自卵清白蛋白ova的cd8表位短肽、mc38新抗原多肽dtx31、lmo7中的一种。6.根据权利要求1所述的负载抗原多肽的白蛋白递送系统，其特征在于，所述白蛋白选自牛血清白蛋白、人血清白蛋白、小鼠血清白蛋白中的一种。7.根据权利要求1所述的负载抗原多肽的白蛋白递送系统的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(一)将抗原多肽与交联剂用有机溶剂溶解后形成溶液，室温下反应；(二)将白蛋白溶解于溶剂中形成白蛋白水溶液，加入有机溶剂，搅拌；(三)混合步骤(一)、步骤(二)的溶液，搅拌一段时间；(四)除去步骤(二)中的有机溶剂，用冻干保护剂的水溶液稀释。8.根据权利要求7所述的负载抗原多肽的白蛋白递送系统的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(一)将物质的量比为1:5～1:40的抗原多肽与交联剂用有机溶剂溶解，制成浓度为1～10mg/ml的抗原多肽溶液，室温反应30～60分钟；(二)将白蛋白溶解于溶剂中形成浓度为5～25mg/ml的白蛋白水溶液；加入与白蛋白水溶液体积比为1:0-1:5的有机溶剂，室温搅拌5～30分钟；(三)混合步骤(一)、步骤(二)的溶液，白蛋白:交联剂:抗原多肽的物质的量比为1:5～40:1～8，25℃下搅拌2小时，或4℃下搅拌16小时。(四)除去步骤(二)中的有机溶剂，用含有1～10％冻干保护剂的水溶液稀释。9.根据权利要求7或8任一项所述的负载抗原多肽的白蛋白递送系统的制备方法，其特征在于，所述步骤(一)中有机溶剂为二甲亚砜；所述步骤(二)和步骤(四)中的有机溶剂为乙醇；所述步骤(二)中的溶剂包括去离子水、nacl溶液、磷酸盐缓冲液中的一种；所述冻干
保护剂含有糖类物质，糖类物质选自海藻糖、蔗糖、甘露糖、乳糖、麦芽糖和甘露醇中的一种或一种以上。10.根据权利要求1所述的负载抗原多肽的白蛋白递送系统在制备肿瘤免疫治疗产品中的应用。

技术总结
本发明公开了一种负载抗原多肽的白蛋白递送系统及其制备方法和应用，制备方法如下：(一)将抗原多肽与交联剂用有机溶剂溶解后形成溶液，室温反应；(二)将白蛋白溶解于溶剂中形成白蛋白水溶液，加入有机溶剂；(三)混合上述两个步骤中的溶液，搅拌一段时间；(四)除去步骤(二)中的有机溶剂，用冻干保护剂的水溶液稀释。本发明的负载抗原多肽的白蛋白递送系统应用于制备肿瘤免疫治疗产品。本发明使抗原多肽的包封率显著提升，能够实现不同理化性质的抗原多肽的高效负载和高效递送，具有良好的生物相容性和安全性。物相容性和安全性。物相容性和安全性。


技术研发人员：陈应之 李庆辉 许田 朱一娜 李飞洁 陈鑫
受保护的技术使用者：杭州星肽原生物技术有限公司
技术研发日：2023.05.29
技术公布日：2023/9/12