中药活性成分麦角醇在制备冠状病毒药物中的应用

1.本发明涉及药物应用技术领域，特别是涉及中药活性成分麦角醇在制备冠状病毒药物中的应用。


背景技术：

2.冠状病毒因病毒包膜上的刺突向四周伸出呈冠状，就像日冕或花冠，因此而得名。冠状病毒在自然界分布很广泛,可以感染人,也可以感染动物。冠状病毒可能会随患者的飞沫、粪便或尿液等进行传播，当他人吸入了含病毒的飞沫，或用手摸了被病毒污染的物品后，再触摸自身黏膜，如揉眼睛、抠鼻孔、摸嘴巴等，就可能感染冠状病毒。
3.时至今日，临床上仍无安全、可靠的治疗药物。
4.随着研究的深入，科学家们发现sars-cov-2为包膜病毒，其刺突糖蛋白(spike,s)主要与宿主细胞受体血管紧张素转化酶2(ace2)结合，从而入侵宿主细胞，s蛋白主要包括s1和s2两个亚基，分别负责与宿主细胞的吸附与融合。因此，以s和ace2等为靶点是发现新冠病毒入侵抑制剂的重要策略。
5.麦角醇(lysergol)是麦角碱家族的一种生物碱，cas：602-85-7。麦角醇的分子结构式为c
16h18
n2o，分子质量为254.33，具有抗菌(pmid:23290001)、抗焦虑或抗精神分裂(pmid:24410373)等作用。目前，尚未发现麦角醇抗新冠病毒入侵的研究报道。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供中药活性成分麦角醇在制备冠状病毒药物中的应用，提供一种可抗冠状病毒的药物成分，安全、有效地抵抗不同分型冠状病毒入侵宿主细胞。
7.为实现上述目的，本发明提供了中药活性成分麦角醇在制备冠状病毒药物中的应用，麦角醇用于制备冠状病毒预防药物和抑制入侵药物。
8.优选的，所述冠状病毒为人类冠状病毒229e(hcov-229e)、人类冠状病毒nl63(hcov-nl63)、人类冠状病毒oc43(hcov-oc43)、人类冠状病毒hku1(hcov-hku1)、中东呼吸综合症冠状病毒(mers-cov)、重症急性呼吸综合症冠状病毒(sars-cov)、新型冠状病毒(sars-cov-2)中的一种或多种。
9.优选的，所述新型冠状病毒包括原始株和变异株。
10.优选的，所述变异株为阿尔法变异株(alpha)、贝塔变异株(beta)、伽马变异毒株(gamma)、德尔塔变异株(delta)、厄普西隆变异株(epsilon)、埃塔变异株(eta)、艾欧塔变异株(lota)、卡帕变异株(kappa)、奥密克戎变异株(omicron)、泽塔变异株(zeta)、缪变异株(mu)、拉姆达变异株(lambda)中的一种或多种。
11.优选的，所述麦角醇的结构式为
12.优选的，所述麦角醇在药物中的浓度为0.1nm-100μm。
13.优选的，所述麦角醇在药物中的浓度为1nm-10μm。
14.优选的，所述药物可以制成注射液、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、膏剂、霜剂、喷剂、滴丸或针剂冻干粉。
15.优选的，所述麦角醇来源于牵牛花科植物、番薯中。
16.因此，本发明采用上述成分的中药活性成分麦角醇在制备冠状病毒药物中的应用，其有益效果为：
17.1、本发明的麦角醇在制备冠状病毒药物中的应用中作用机制明确，且对新型冠状病毒原始株病毒和变异株病毒入侵宿主细胞具有显著的抑制作用；
18.2、1nm-10μm浓度麦角醇安全、无毒，对宿主细胞活力无影响。
19.下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
附图说明
20.图1是麦角醇与新型冠状假病毒原始株s蛋白结合示意图；
21.图2是麦角醇与新型冠状假病毒原始株s蛋白结合a处放大图；
22.图3是麦角醇与新型冠状假病毒omicron株s蛋白结合示意图；
23.图4是麦角醇与新型冠状假病毒omicron株s蛋白结合b处放大图；
24.图5是麦角醇与ace2蛋白结合示意图；
25.图6是麦角醇对抑制新型冠状假病毒原始株(左)和omicron株(右)感染效果的组合图；
26.图7是麦角醇对细胞活力影响的柱状图。
具体实施方式
27.以下通过附图和实施例对本发明的技术方案作进一步说明。
28.通过下面的实施例可以更详细的解释本发明，公开本发明的目的旨在保护本发明范围内的一切变化和改进，本发明并不局限于下面的实施例。
29.实施例1
30.以新型冠状假病毒原始株s蛋白为靶点进行分子对接
31.s1、在pdb蛋白质结构数据库(https://www.rcsb.org)下载新型冠状假病毒原始株s蛋白结构(pdbid：7dzw)。
32.s2、在pubchem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)下载麦角醇3d格式。
33.s3、利用autodock软件对新型冠状假病毒原始株s蛋白模型添加氢原子和电荷，添加原子类型为ad4类型，设置好对接盒子后，进行分子对接。
34.如图1和图2所示，利用autodock软件分析了麦角醇与新型冠状假病毒原始株s蛋
白的结合情况，包括结合位置、结合能、结合化学键等。分子对接结果显示结合能为-6.8kcal/mol，提示麦角醇与新型冠状假病毒原始株s蛋白具有明显的结合潜能。
35.实施例2
36.以新型冠状假病毒omicron株s蛋白为靶点进行分子对接
37.s1、在pdb蛋白质结构数据库(https://www.rcsb.org)下载新型冠状假病毒omicron株s蛋白结构(pdbid：7tgw)。
38.s2、在pubchem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)下载麦角醇3d格式。
39.s3、利用autodock软件对新型冠状假病毒omicron株s蛋白模型添加氢原子和电荷，添加原子类型为ad4类型，设置好对接盒子后，进行分子对接。
40.如图3和图4所示，利用autodock软件分析了麦角醇与新型冠状假病毒omicron株s蛋白的结合情况，包括结合位置、结合能、结合化学键等。分子对接结果显示结合能为-8.2kcal/mol，提示麦角醇与新型冠状假病毒omicron株s蛋白具有明显的结合潜能。
41.实施例3
42.以ace2蛋白为靶点进行分子对接
43.s1、在pdb蛋白质结构数据库(https://www.rcsb.org)下载ace2蛋白结构(pdbid：1r42)。
44.s2、在pubchem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)下载麦角醇3d格式。
45.s3、利用autodock软件对ace2蛋白模型添加氢原子和电荷，添加原子类型为ad4类型，设置好对接盒子后，进行分子对接。
46.如图5所示，利用autodock软件分析了麦角醇与ace2蛋白的结合情况，包括结合位置、结合能、结合化学键等。分子对接结果显示结合能为-7.5kcal/mol，提示麦角醇与ace2蛋白具有明显的结合潜能。
47.实施例4
48.新型冠状假病毒体系的构建
49.本假病毒体系基于慢病毒三质粒包装体系，包括目的质粒(phage-ef1α-luciferase-bsd)、辅助质粒(pmd2.g)和(r8.74)，将pmd2.g质粒中包膜糖蛋白水疱性口炎病毒(vsv-g)用新冠病毒s蛋白替代，可形成模拟新冠病毒感染的假病毒。
50.s1、将原始株、omicron株s序列密码子优化，再去掉s蛋白尾部19个氨基酸，加上flag标签序列，将优化后带有flag标签的s片段插入pmd2.g辅助质粒载体，构建pmd2.g-原始s质粒和pmd2.g-omicrons质粒。
51.s2、分别将pmd2.g-原始s质粒和pmd2.g-omicrons质粒与目的质粒和辅助质粒共同转染至hek293ft细胞，待48小时收集上清液，得到新型冠状假病毒原始株和新型冠状假病毒omicron株，冻存后备用于感染宿主细胞。
52.实施例5
53.检测麦角醇抗新型冠状假病毒原始株入侵能力
54.s1、将稳定过表达人源ace2的人类肺癌来源a549细胞以3x103个细胞/孔密度接种于96孔板，贴壁后，实验组每孔孵育不同浓度溶于dmso的麦角醇，麦角醇浓度在1nm-10μm范围内。以与实验组使用量相同的dmso作为对照组，并设置仅有与实验组使用量相同的dmso的空白组。
55.10μm浓度麦角醇药物溶液的dmso含量为1
‰
。同时设置dmso对照组和空白组，dmso对照组是指a549细胞培养于含1
‰
浓度dmso的培养基，空白组是指无a549细胞，仅有含1
‰
浓度dmso的培养基。
56.s2、12小时后将实验组、对照组和空白组的培养换为75ul不同浓度麦角醇和75ul新型冠状假病毒原始株混合液，孵育48小时。
57.s3、使用萤火虫报告基因试剂盒测试萤火虫酶活性，在波长560nm处检测实验组、对照组和空白组的吸光度od值，dmso对照组和实验组每个药物浓度均有6个重复。
58.按照下述公式计算新型冠状假病毒原始株入侵宿主细胞的感染率：
59.感染率＝(麦角醇实验组od值-空白组od值)/(dmso对照组od值-空白组od值)*100％。
60.如图6(左)所示，麦角醇在1nm-10μm范围内对新型冠状假病毒原始株入侵具有明显抑制作用，且具有浓度依赖性。
61.1nm麦角醇可有效抑制15.23％新型冠状假病毒原始株的入侵；10nm麦角醇可有效抑制26.43％新型冠状假病毒原始株的入侵；100nm麦角醇可有效抑制28.66％新型冠状假病毒原始株的入侵；1μm麦角醇可有效抑制38.98％新型冠状假病毒原始株的入侵；10μm浓度麦角醇可有效抑制44.21％新型冠状假病毒原始株的入侵。
62.实施例6
63.检测麦角醇抗新型冠状假病毒omicron株入侵能力
64.s1、将稳定过表达人源ace2的人类肺癌来源a549细胞以3x103个细胞/孔密度接种于96孔板，贴壁后，实验组每孔孵育不同浓度溶于dmso的麦角醇，麦角醇浓度在1nm-10μm范围内。以与实验组使用量相同的dmso作为对照组，并设置仅有与实验组使用量相同的dmso的空白组。
65.10μm浓度麦角醇药物溶液的dmso含量为同时设置dmso对照组和空白组，dmso对照组是指a549细胞培养于含浓度dmso的培养基，空白组是指无a549细胞，仅有含浓度dmso的培养基。
66.s2、12小时后将实验组、对照组和空白组的培养换为75ul不同浓度麦角醇和75ul新型冠状假病毒omicron株混合液，孵育48小时。
67.s3、使用萤火虫报告基因试剂盒测试萤火虫酶活性，在波长560nm处检测实验组、对照组和空白组的吸光度od值，dmso对照组和实验组每个药物浓度均有4个重复。
68.并按照下述公式计算新型冠状假病毒omicron株入侵宿主细胞的感染率：
69.感染率＝(麦角醇实验组od值-空白组od值)/(dmso对照组od值-空白组od值)*100％。
70.如图6(右)所示，麦角醇在1nm-10μm范围内对新型冠状假病毒omicron株入侵具有明显抑制作用，且具有浓度依赖性。
71.1nm麦角醇可有效抑制22.09％新型冠状假病毒omicron株的入侵；10nm麦角醇可有效抑制37.76％新型冠状假病毒omicron株的入侵；100nm麦角醇可有效抑制42.30％新型冠状假病毒omicron株的入侵；1μm麦角醇可有效抑制45.43％新型冠状假病毒omicron株的入侵；10μm浓度麦角醇可有效抑制48.04％新型冠状假病毒omicron株的入侵。
72.实施例7
73.mtt方法检测麦角醇对宿主细胞活力的影响
74.s1、将稳定过表达人源ace2的人类肺癌来源a549细胞以3x103个细胞/孔密度接种于96孔板，在细胞培养箱内培养12小时。将培养基换为含有不同浓度溶于dmso的麦角醇培养基作为实验组，麦角醇浓度在1nm-10μm范围内。以与实验组使用量相同的dmso作为对照组，并设置仅有与实验组使用量相同的dmso的空白组。
75.10μm浓度麦角醇药物溶液的dmso含量为同时设置dmso对照组和空白组，dmso对照组是指a549细胞培养于含浓度dmso的培养基，空白组是指无a549细胞，仅有含浓度dmso的培养基。
76.s2、继续孵育72小时，dmso对照组和麦角醇实验组每个药物浓度均有4个重复。
77.s3、再向实验组、对照组和空白组每孔加入20ulmtt溶液(5mg/ml)，继续培养4小时，吸走含有mtt溶液的培养基。加入100uldmso溶液，振荡15分钟，在酶标仪波长490nm处检测实验组、对照组和空白组的吸光度。
78.按照下述公式计算麦角醇对宿主细胞活力的影响：
79.细胞活力百分率＝(麦角醇实验组od值-空白组od值)/(dmso对照组od值-空白组od值)*100％。
80.如图7所示，麦角醇在1nm-10μm范围内对宿主细胞活力均无影响，说明1nm-10μm有效浓度内，麦角醇无毒，不影响宿主细胞的生长。
81.最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其进行限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而这些修改或者等同替换亦不能使修改后的技术方案脱离本发明技术方案的精神和范围。

技术特征：
1.中药活性成分麦角醇在制备冠状病毒药物中的应用，其特征在于：麦角醇用于制备冠状病毒预防药物和抑制入侵药物。2.根据权利要求1所述的中药活性成分麦角醇在制备冠状病毒药物中的应用，其特征在于：所述冠状病毒为人类冠状病毒229e、人类冠状病毒nl63、人类冠状病毒oc43、人类冠状病毒hku1、中东呼吸综合症冠状病毒、重症急性呼吸综合症冠状病毒、新型冠状病毒中的一种或多种。3.根据权利要求2所述的利格列汀在制备冠状病毒药物中的应用，其特征在于：所述新型冠状病毒包括原始株和变异株。4.根据权利要求3所述的利格列汀在制备冠状病毒药物中的应用，其特征在于：所述变异株为阿尔法变异株、贝塔变异株、伽马变异毒株、德尔塔变异株、厄普西隆变异株、埃塔变异株、艾欧塔变异株、卡帕变异株、奥密克戎变异株、泽塔变异株、缪变异株、拉姆达变异株中的一种或多种。5.根据权利要求1所述的中药活性成分麦角醇在制备冠状病毒药物中的应用，其特征在于：所述麦角醇的结构式为6.根据权利要求1所述的中药活性成分麦角醇在制备冠状病毒药物中的应用，其特征在于：所述麦角醇在药物中的浓度为0.1nm-100μm。7.根据权利要求6所述的中药活性成分麦角醇在制备冠状病毒药物中的应用，其特征在于：所述麦角醇在药物中的浓度为1nm-10μm。8.根据权利要求1所述的中药活性成分麦角醇在制备冠状病毒药物中的应用，其特征在于：所述药物可以制成注射液、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、膏剂、霜剂、喷剂、滴丸或针剂冻干粉。9.根据权利要求1所述的中药活性成分麦角醇在制备冠状病毒药物中的应用，其特征在于：所述麦角醇来源于牵牛花科植物、番薯中。

技术总结
本发明公开了中药活性成分麦角醇在制备冠状病毒药物中的应用，麦角醇用于制备冠状病毒预防药物和抑制入侵药物。本发明采用上述成分的中药活性成分麦角醇在制备冠状病毒药物中的应用，麦角醇在制备冠状病毒药物中应用时作用机制明确，且对新型冠状病毒原始株病毒和变异株病毒入侵宿主细胞具有显著的抑制作用。变异株病毒入侵宿主细胞具有显著的抑制作用。变异株病毒入侵宿主细胞具有显著的抑制作用。


技术研发人员：费腾 姚璎珈 张蕴涵 李泽旭
受保护的技术使用者：东北大学
技术研发日：2023.05.04
技术公布日：2023/9/12