Hungatella属菌株在制备芒果苷元中的应用

hungatella属菌株在制备芒果苷元中的应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，涉及hungatella属菌株在制备芒果苷元中的应用。


背景技术：

2.碳苷是一类结构特殊的苷类化合物，由于其糖基直接以c-c键连接在苷元上，因此碳苷具有溶解度小、结构较稳定和不易被水解的共性。芒果苷是一种重要的碳苷，但其口服生物利用度仅为1.2％，而其c-去糖基化产物—芒果苷元(norathyriol)的生物利用度是30.4％，远远高于芒果苷。同时，去糖基化不但明显改善了芒果苷的溶解性，且芒果苷元的药理活性比芒果苷更强、更广泛。芒果苷元作为芒果苷的活性代谢产物，具有广泛的药理作用，如抗氧化、抑制蛋白酪氨酸磷酸酶1b活性、降血糖、抗肿瘤、降尿酸、抗痛风等。相比于芒果苷，芒果苷元因其更高的生物利用度和更好的生物活性而具有更好的药物先导化合物潜质。
3.与化学法相比，生物法具有良好的化学选择性、区域选择性和立体选择性，具有反应速率快、产物转化率高、反应条件温和、对环境友好、转化过程简单、周期短和成本低等优点。采用微生物转化法有望高效裂解c-c糖苷键，为碳苷的c-去糖基化应用奠定基础。


技术实现要素：

4.本发明所要解决的技术问题是如何制备芒果苷元。
5.为了解决上述技术问题，本发明提供了hungatella sp.cpcc g00020，已于2021年11月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为cgmcc no.23958。
6.本发明还提供了用于制备芒果苷元的菌剂。
7.本发明所提供的用于制备芒果苷元的菌剂含有hungatella sp.cpcc g00020。
8.上述菌剂的活性成分可为hungatella sp.cpcc g00020或/和hungatella sp.cpcc g00020的代谢物，上述菌剂的活性成分还可含有其他生物成分或非生物成分，上述菌剂的其他活性成分本领域技术人员可根据菌剂的效果确定。
9.上述菌剂中，所述菌剂还可包括载体。所述载体可为固体载体或液体载体。
10.上述菌剂中，所述菌剂的剂型可为多种剂型，包括但不限于液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂等。
11.所述菌剂具体可按照如下方法制备：在液体发酵培养基中培养hungatella sp.cpcc g00020，收集发酵液，该发酵液即为菌剂。
12.示例性的，所述菌剂的制备方法具体可为：将hungatella sp.cpcc g00020接种到脑心浸液(bhi)液体培养基，静置培养，收集发酵液。
13.示例性的，所述菌剂的制备方法具体可为：将hungatella sp.cpcc g00020单菌落接种到10ml bhi液体培养基，静置培养，收集发酵液。
14.示例性的，所述静置培养的时间具体可为：16小时。
15.示例性的，所述静置培养的培养温度具体可为：37℃。
16.本发明还提供了hungatella sp.cpcc g00020或所述菌剂在制备芒果苷元中的应用。
17.所述应用中，原料为芒果苷。
18.所述应用中，原料也可为含有芒果苷的植物材料。
19.本发明还提供了hungatella sp.cpcc g00020或所述菌剂在以芒果苷或含有芒果苷的植物材料为原料制备芒果苷元中的应用。
20.本发明还提供了hungatella sp.cpcc g00020或所述菌剂在将芒果苷转化为芒果苷元中的应用。
21.本发明还提供了一种制备芒果苷元的方法，包括如下步骤：以芒果苷或含有芒果苷的植物材料为原料，采用hungatella sp.cpcc g00020或所述菌剂进行生物转化，得到芒果苷元。
22.示例性的，所述生物转化的时间可为：8-24小时。
23.示例性的，所述生物转化的反应体系中，芒果苷的浓度可为4.3mm或0.43mm。
24.示例性的，所述生物转化的方法为：将0.5ml所述菌剂接种至10ml含芒果苷的bhi液体培养基中，静置培养。
25.示例性的，所述静置培养的培养温度具体可为：37℃。
26.本发明还提供了hungatella属菌株在将碳苷进行c-去糖基化中的应用。
27.本发明还提供了hungatella属菌株在以芒果苷或含有芒果苷的植物材料为原料制备芒果苷元中的应用。
28.本发明还提供了hungatella属菌株在将芒果苷转化为芒果苷元中的应用。
29.本发明还提供了一种制备芒果苷元的方法，包括如下步骤：以芒果苷或含有芒果苷的植物材料为原料，采用hungatella属菌株进行生物转化，得到芒果苷元。
30.本发明提供的制备芒果苷元的方法为微生物转化法，不但具有良好的化学选择性、区域选择性和立体选择性，也具有反应速率快、产物转化率高、反应条件温和、对环境友好、转化过程简单、周期短和成本低等优点。本发明有望高效裂解c-c糖苷键，为碳苷的c-去糖基化应用奠定基础。本发明对于芒果苷元及其下游产品的生产领域，具有重大的应用推广价值。
附图说明
31.图1为菌株cpcc g00020在rca培养基上37℃培养5天的照片。
32.图2为菌株cpcc g00020在bprma培养基上四区划线照片。
33.图3为菌株cpcc g00020的革兰氏染色图。
34.图4为基于菌株的cpcc g00020 16s rrna基因分析的系统进化树。
35.图5为实施例2的步骤二中转化产物中芒果苷元的lc/ms分析结果。
36.图6为实施例2的步骤三中转化产物中芒果苷元的hplc分析的色谱图。
37.图7为实施例3中分离纯化过程的色谱图。
38.图8为实施例3中纯化产物的hplc分析的色谱图。
39.图9为实施例3中纯化产物的1h-nmr分析和
13
c-nmr分析结果。
具体实施方式
40.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
41.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
42.如无特殊说明，以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
43.芒果苷，化学式为c
19h18o11
，cas号为4773-96-0，结构式见式(ⅰ)。
[0044][0045]
芒果苷元，化学式为c
13
h8o6，cas号为3542-72-1，结构式见式(ⅱ)。
[0046][0047]
bhi琼脂培养基(ph7.4
±
0.2)：脱水小牛脑浸粉12.5g/l，脱水牛心浸粉5.0g/l，d-葡萄糖2.0g/l，蛋白胨10.0g/l，氯化钠5.0g/l，磷酸氢二钠2.5g/l，琼脂15.0g/l；余量为水。
[0048]
bhi液体培养基(ph7.4
±
0.2)：脱水小牛脑浸粉12.5g/l，脱水牛心浸粉5.0g/l，d-葡萄糖2.0g/l，蛋白胨10.0g/l，氯化钠5.0g/l，磷酸氢二钠2.5g/l；余量为水。
[0049]
如无特殊说明，实施例中的静置培养的培养条件均为：温度：37℃；气体条件：n
2 90％，h
2 5％，co
2 5％。
[0050]
实施例1、hungatella属菌株的获得、鉴定和保藏
[0051]
一、菌株的获得
[0052]
1、制备培养物
[0053]
采集6份健康且未经任何药物处理的大鼠粪便。于无菌条件下分别取1g样品，加入10ml生理盐水，震荡混匀，静置培养72小时。然后，加入芒果苷使其在体系中的浓度为0.1mm，继续培养72小时。
[0054]
2、筛选具有将芒果苷转化为芒果苷元的活性培养物
[0055]
完成步骤1后，取2ml培养物，加入2ml水饱和正丁醇，进行萃取，浓缩干燥有机相，所得残渣用200μl甲醇溶解，然后取60μl进行hplc分析。
[0056]
hplc参数如下：
[0057]
色谱柱：安捷伦xdb-c18(4.6
×
150mm，5μm)；
[0058]
检测波长：258nm；柱温：35℃；
b.2
t
菌株聚在同一个稳定的进化分支上，且与菌株hungatella effluvii ub-b.2
t
亲缘关系最近。
[0079]
综合上述结果，将菌株cpcc g00020鉴定为hungatella sp.，即hungatella sp.cpcc g00020。
[0080]
三、菌株的保藏
[0081]
hungatella sp.cpcc g00020，已于2021年11月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为cgmcc no.23958。
[0082]
实施例2、hungatella sp.cpcc g00020将芒果苷转化为芒果苷元的活性验证一、微生物转化过程的建立
[0083]
1、将hungatella sp.cpcc g00020划线接种于bhi琼脂培养基，静置培养3天。
[0084]
2、完成步骤1后，挑取单菌落，接种到装有10ml bhi液体培养基的带盖螺口试管中，静置培养16小时，得到种子液。
[0085]
3、将0.5ml步骤2得到的种子液接种至装有10ml含芒果苷的bhi液体培养基的带盖螺口试管中，静置培养，得到转化产物(转化产物指的是完成培养后的整个体系)。培养过程中，每间隔4小时取样，培养总时间为24小时，0时刻取样作对照。含芒果苷的bhi液体培养基是将芒果苷加入bhi液体培养基得到的；芒果苷在培养基中的浓度分别设置为0.43mm或4.30mm。
[0086]
二、转化产物中芒果苷元的结构鉴定
[0087]
取1ml步骤一所得转化产物(芒果苷在培养基中的浓度设置为0.43mm的处理组，培养时间为24小时)，加入1ml水饱和正丁醇，涡旋振荡10min，然后4000rpm离心15min，收集有机相，38℃减压浓缩以去除溶剂，将剩余物溶解于250μl甲醇，然后进行lc/ms分析。
[0088]
主要色谱条件如下：
[0089]
色谱柱：安捷伦xdb-c18(4.6
×
150mm，5μm)；
[0090]
进样方式：自动进样器直接进样；检测波长：258nm；柱温：35℃；
[0091]
流动相：a相或者b相或者a相和b相的混合物；b相为0.2％(体积比)乙酸水溶液；a相为乙腈；流动相流速：1ml/min；
[0092]
洗脱过程：0-5min，a相占流动相的体积分数为10％，相应的b相占流动相的体积分数为90％；5-20min，a相占流动相的体积分数由10％线性上升至30％，相应的b相占流动相的体积分数由90％线性下降至70％；20-30min，a相占流动相的体积分数由30％线性上升至100％，相应的b相占流动相的体积分数由70％线性下降至0％。
[0093]
主要质谱条件如下：
[0094]
离子源：esi；扫描范围：100-1000m/z；离子源喷射电压：4.5kv；毛细管电压：45v；毛细管温度：200℃；鞘气(氮气)流速：40个单位，进样方式：自动进样器直接进样；检测方式：全扫描一级质谱正、负离子检测。
[0095]
结果见图5。图5中：a为转化产物的总离子流图，箭头示准分子离子流；b为转化产物的质谱图，箭头示准分子离子峰。esi m/z 261.09[m+h]
+
是芒果苷元的准分子离子峰，该产物即为芒果苷c-去糖基化后所得碳苷元。
[0096]
三、转化产物中芒果苷元的含量分析
[0097]
取1ml步骤一所得转化产物，加入1ml水饱和正丁醇，涡旋振荡10min，然后4000rpm离心15min，收集有机相，38℃减压浓缩以去除溶剂，将剩余物溶解于250μl甲醇，然后进行hplc分析。
[0098]
hplc参数如下：
[0099]
色谱柱：安捷伦xdb-c18(4.6
×
150mm，5μm)；
[0100]
检测波长：258nm；柱温：35℃；
[0101]
流动相：a相或者b相或者a相和b相的混合物；b相为0.2％(体积比)乙酸水溶液；a相为乙腈；流动相流速：1ml/min；
[0102]
洗脱过程：0-5min，a相占流动相的体积分数为10％，相应的b相占流动相的体积分数为90％；5-20min，a相占流动相的体积分数由10％线性上升至30％，相应的b相占流动相的体积分数由90％线性下降至70％；20-30min，a相占流动相的体积分数由30％线性上升至100％，相应的b相占流动相的体积分数由70％线性下降至0％。
[0103]
采用峰面积归一化法计算底物的相对转化率；
[0104]
相对转化率＝产物峰面积/(底物峰面积+产物峰面积)*100％；
[0105]
产物峰即芒果苷元的峰；底物峰即芒果苷的峰。
[0106]
采用外标一点法计算转化产物中芒果苷元的产量。
[0107]
当芒果苷的浓度是0.43mm时：经过4小时的生物转化，1/3的底物被转化；经过8小时的生物转化，芒果苷元的产量接近65mg/l；经过24小时的生物转化，所有底物被转化，芒果苷的转化率达到99％(基本上将所有芒果苷转化为相应的芒果苷元)，转化产物中芒果苷元的产量不低于100mg/l。当芒果苷的浓度是4.3mm时：经过24小时的生物转化，转化产物中芒果苷元的产量接近350mg/l。
[0108]
生物转化(芒果苷在培养基中的浓度设置为0.43mm的处理组)的hplc分析见图6。图6中：a为芒果苷标准品的色谱图；b为0时刻的色谱图，箭头示芒果苷；c为转化24小时后的转化产物的色谱图，箭头示芒果苷元。
[0109]
实施例3、hungatella sp.cpcc g00020对芒果苷生物转化产物的制备
[0110]
一、hungatella sp.cpcc g00020对芒果苷的生物转化
[0111]
1、将hungatella sp.cpcc g00020划线接种于bhi琼脂培养基，静置培养3天。
[0112]
2、完成步骤1后，挑取单菌落，接种到装有10ml bhi液体培养基的带盖螺口试管中，静置培养16小时，得到种子液。
[0113]
3、将2.5ml步骤2得到的种子液接种至装有50ml含芒果苷的bhi液体培养基的带盖螺口试管中，静置培养24小时，得到转化产物(转化产物指的是完成培养后的整个体系)。含芒果苷的bhi液体培养基是将芒果苷加入bhi液体培养基得到的；芒果苷在培养基中的浓度设置为0.43mm。
[0114]
通过多个重复处理，得到750ml转化产物。
[0115]
二、生物转化产物的分离纯化
[0116]
取750ml步骤一制备的转化产物，用乙酸乙酯萃取并收集乙酸乙酯相(共进行3次萃取，每次萃取加入3倍体积的乙酸乙酯，萃取后收集乙酸乙酯相；合并三次收集的乙酸乙酯相)，38℃减压浓缩以去除溶剂，将剩余物溶解于10ml 70％(体积百分含量)甲醇水溶液，然后用0.45μm微孔滤膜过滤并收集滤液。
[0117]
取滤液，通过制备型中压液相色谱法(mplc)分离纯化目标产物。
[0118]
色谱参数如下：
[0119]
色谱仪：江苏汉邦ns4000系列制备型中压液相色谱仪；
[0120]
色谱柱：绿百草制备型silgreen-c18色谱柱(250
×
4.6mm，5μm)；
[0121]
流动相：由48体积份甲醇、0.2体积份乙酸和51.8体积份水组成；
[0122]
流动相流速：4ml/min；进样量：1ml。
[0123]
分离纯化过程的色谱图见图7，箭头示目标峰。
[0124]
收集目标峰对应的过柱后溶液，38℃减压浓缩以去除溶剂，得到粉末状产物。
[0125]
750ml步骤一制备的转化产物进行步骤二后，得到约54mg粉末状产物。
[0126]
三、制备产物的色谱分析
[0127]
将步骤二获得的粉末状产物的甲醇溶液进行hplc分析(参数同实施例2的步骤三中的hplc参数)，结果见图8，箭头示目标产物。
[0128]
四、制备产物的结构鉴定
[0129]
将步骤二获得的粉末状产物的二甲基亚砜-d6(dmso-d6)溶液进行1h-nmr分析和
13
c-nmr分析，结果见图9。图9中：a为
13
c-nmr谱图，b为1h-nmr谱图。该结果与已报道已知化合物——芒果苷元的nmr数据一致。
[0130]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

技术特征：
1.菌株，其特征在于：所述菌株为hungatella sp.cpcc g00020，其保藏编号为cgmcc no.23958。2.用于制备芒果苷元的菌剂，所述菌剂含有权利要求1所述的菌株。3.权利要求1所述菌株或权利要求2所述菌剂在制备芒果苷元中的应用。4.权利要求1所述菌株或权利要求2所述菌剂在以芒果苷或含有芒果苷的植物材料为原料制备芒果苷元中的应用。5.权利要求1所述菌株或权利要求2所述菌剂在将芒果苷转化为芒果苷元中的应用。6.一种制备芒果苷元的方法，包括如下步骤：以芒果苷或含有芒果苷的植物材料为原料，采用权利要求1所述菌株或权利要求2所述菌剂进行生物转化，得到芒果苷元。7.hungatella属菌株在将碳苷进行c-去糖基化中的应用。8.hungatella属菌株在以芒果苷或含有芒果苷的植物材料为原料制备芒果苷元中的应用。9.hungatella属菌株在将芒果苷转化为芒果苷元中的应用。10.一种制备芒果苷元的方法，包括如下步骤：以芒果苷或含有芒果苷的植物材料为原料，采用hungatella属菌株进行生物转化，得到芒果苷元。

技术总结
本发明公开了Hungatella属菌株在制备芒果苷元中的应用。本发明提供了Hungatella sp.CPCC G00020，保藏登记号为CGMCC No.23958。本发明还提供了Hungatella sp.CPCC G00020或相应菌剂在将芒果苷转化为芒果苷元中的应用。本发明提供的制备芒果苷元为微生物转化法，反应速率快、产物转化率高、反应条件温和、对环境友好、转化过程简单、周期短、成本低。本发明对于芒果苷元及其下游产品的生产领域，具有重大的应用推广价值。具有重大的应用推广价值。


技术研发人员：余利岩 陶小宇 刘万仓 柏菁璘 方晓梅 庞旭 张涛 苏静
受保护的技术使用者：中国医学科学院医药生物技术研究所
技术研发日：2022.03.01
技术公布日：2023/9/11