IL27Rα结合分子及使用方法与流程

il27r
α
结合分子及使用方法
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求2020年8月5日提交的美国临时申请号63/061,562、2020年9月15日提交的美国临时申请号63/078,745和2021年1月11日提交的美国临时申请号63/135,884的优先权权益，其公开通过引用全文纳入本文以用于所有目的。
技术领域
3.本发明涉及生物活性分子、组合物及其使用方法，所述生物活性分子包括特异性结合至il27受体α(il27rα)的胞外结构域的单域抗体，所述组合物包括这种单域抗体。


背景技术：

4.细胞因子il-27是一种异二聚体细胞因子，由两个非共价连接的亚基p28和ebi3组成。p28亚基属于4-螺旋束细胞因子家族，而ebi3是可溶性细胞因子受体的可能的最短形式，具有两个典型的细胞因子结合结构域(pflanz s,等,immunity.2002年6月；16(6):779-90)。
5.白细胞介素-27受体(il27r)是白细胞介素-27(il27)的一种i型细胞因子受体。il27r是一种异二聚体，由il27rα亚基和糖蛋白130(il6rb)构成。il27由抗原呈递细胞表达，并诱导免疫系统中不同群体的t细胞分化。il27对il27r的结合起始了几种jak家族激酶的胞内信号转导，这些激酶诱导stat1和stat3的磷酸化。在激活的t细胞中，il27主要通过stat3[23]发出信号，而在记忆b细胞中，它主要通过stat3发出信号。il27已显示出促炎和抗炎特性，促炎或抗炎反应受表达il27r的细胞的环境影响。
[0006]
il27rα亚基(也称为tccr-或wsx-1受体)是il27受体的专有亚基。成熟的(去除信号肽的)il27rα是604个氨基酸的多肽，具有484个氨基酸的胞外结构域。il27rα的胞外结构域有5个结构域：d1-d5。d1和d2是主要的细胞因子结合结构域，而iii型纤连蛋白(fn3)结构域d3、d4和d5在较小程度上参与配体识别。基于结构分析，当il27配体结合时，fn3结构域对复合物中的结合没有贡献。虽然结构域d1和d2是高度保守的，但fn3结构域的序列更可变。
[0007]
il27表现出对il27ra亚基的高(纳摩尔)亲和力。[il27/il27rα]复合物与il27ra缔合，以完成il27受体信号转导复合物。gp130对[il27/il27rα]复合物的结合比il-27和il-27r之间的相互作用弱得多。(pflanz s,等,j immunol.2004年2月15日；172(4):2225-31)，这在共享细胞因子受体亚基方面某种程度上是经典的。由于各个受体的
‘
c’形，il-27r的d5结构域和gp130的d6结构域在膜处紧密接近。这是受体复合物能够在两种受体的胞内结构域引发jak结合所需要的。
[0008]
尽管单克隆抗体是用于检测和定量蛋白质的最广泛的试剂，但单克隆抗体是约150kda的大分子，其大小可能潜在地限制了其在与多个试剂竞争近表位识别的试验中的使用。一类独特的免疫球蛋白，含有重链结构域，但缺乏轻链结构域(通常称为重链”抗体(hcab))存在于骆驼科动物中，包括单峰骆驼、双峰驼、野生双峰驼，美洲驼、羊驼、骆马和原驼，以及软骨鱼类，如鲨鱼。hcab的分离的可变结构域区域被称为vhh(反映其“可变-重-重”结构的缩写)或(ablynx)。单域vhh抗体具有体积小(～12-14kd)、分子量约为常规哺乳动物igg类抗体的十分之一的优点，这有助于这些vhh分子与靶标的抗原决定簇的结合，而常规单克隆igg形式可能无法接近这些决定簇(ingram等.,2018)。此外，vhh单域抗体通常具有高热稳定性特征，有助于将药剂分布到难以或不可能维持冷链的地理区域。这些性质，特别是结合不需要重/轻链配对(如igg抗体的情况)和简单制造(如在细菌表达系统中)的简单噬菌体展示发现方法，使得vhh单域抗体在多种应用中有用，包括成像剂和治疗剂的开发。


技术实现要素：

[0009]
本发明提供了特异性结合至il27ra的多肽。
[0010]
本发明提供了特异性结合il27ra的胞外结构域的多肽。
[0011]
本发明提供了一种il27ra结合分子，其特异性结合至人il27ra(hil27ra)的胞外结构域。
[0012]
在一些实施方式中，il27ra结合分子包括单域抗体(sdab)，其特异性结合至人il27ra的胞外域。
[0013]
在一些实施方式中，il27ra结合分子是sdab，sdab包含一组cdr，对应于cdr1、cdr2和cdr3，如下表1的行所示。
[0014]
在一些实施方式中，il27ra结合分子包含如下表1的行中所述的cdr1、cdr2和cdr3，其中cdr1、cdr2和cdr3相对于下表1的行中所述的序列可各自独立地包含至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的序列同一性，或具有0、1、2或3个氨基酸变化，任选保守的氨基酸变化。
[0015]
在一些实施方式中，il27ra结合分子由下述单域抗体(sdab)组成、任选地基本由下述单域抗体组成、或任选地包括：与seq id no:2-25中任一多肽序列具有至少80％、或者至少85％、或者至少90％、或者至少95％、或者至少98％、或者至少99％同一性(或除了1、2、3或4个氨基酸是任选的保守氨基酸取代之外是相同的)或100％的同一性的单域抗体(sdab)，如下表1所示。
[0016]
[0017]
[0018]
[0019]
[0020]
[0021]
[0022]
[0023][0024]
在一些实施方式中，将前文的cdr组纳入人源化vhh框架中以提供“人源化”sdab il27ra结合分子。
[0025]
本发明还提供了用于制备本发明的il27ra结合分子的化学或重组过程的方法。
[0026]
本发明还提供了编码il27ra结合分子的核酸。下表2提供了编码如本文所述的il27ra结合分子的dna序列的示例。
[0027]
[0028]
[0029]
[0030]
[0031]
[0032]
[0033]
[0034]
[0035]
[0036]
[0037]
[0038][0039]
在一些实施方式中，il27ra是鼠il27ra。
[0040]
在一些实施方式中，il27ra结合分子包括单域抗体(sdab)，其特异性结合至小鼠或鼠il27ra(mil27ra)的胞外结构域。
[0041]
在一些实施方式中，il27ra结合分子是sdab，sdab包含一组cdr，对应于cdr1、cdr2和cdr3，如下表3的行所示。
[0042]
在一些实施方式中，il27ra结合分子包含如下表3的行中所述的cdr1、cdr2和cdr3，其中cdr1、cdr2和cdr3相对于下表3的行中所述的序列可各自独立地包含至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的序列同一性，或具有
0、1、2或3个氨基酸变化，任选保守的氨基酸变化。
[0043]
在一些实施方式中，il27ra结合分子由下述单域抗体组成、任选地基本由下述单域抗体组成、或任选地包括：与如下表3所示的seq id no:122、126、130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、170和174中任一项的多肽序列具有至少80％、或者至少85％、或者至少90％、或者至少95％、或者至少98％、或者至少99％同一性(或除了1、2、3或4个氨基酸是任选的保守取代之外是相同的)或100％的同一性的单域抗体(sdab)。
[0044]
[0045]
[0046]
[0047]
[0048]
[0049]
[0050]
[0051][0052]
在一些实施方式中，将前文的cdr组纳入人源化vhh框架中以提供“人源化”sdab il27rα结合分子。
[0053]
本发明还提供了用于制备本发明的il27rα结合分子的化学或重组过程的方法。
[0054]
本发明还提供了编码il27ra结合分子的核酸。下表4提供了编码hil27ra结合分子的dna序列的例子，如上表3中所述。
[0055]
[0056]
[0057]
[0058]
[0059]
[0060]
[0061]
[0062][0063]
本发明进一步提供重组病毒和非病毒载体，其包含编码本发明的il27rα结合分子或本发明的il27rα结合分子的cdr的核酸。
[0064]
本发明还提供包含重组病毒和非病毒载体的宿主细胞，所述载体包含本发明的il27rα结合分子或本发明的il27rα结合分子的cdr的核酸。
[0065]
本发明还提供包含重组病毒和非病毒载体的宿主细胞，所述载体包含本发明的il27rα结合分子或本发明的il27rα结合分子的cdr的核酸。
[0066]
本发明还提供包含本发明的il27rα结合分子的试剂盒。
[0067]
在另一方面，本发明提供了用于鉴定表达il27rα的细胞的构建体，其中il27rα结合分子任选地通过化学或多肽接头偶联至一种或多种成像剂。本发明还提供了上述用于鉴定对象中表达il27rα的细胞的使用方法，所述方法包括向需要治疗的对象给予有效量的偶联至成像剂的il27rα结合分子，并评估对象是否存在偶联至il27rα结合分子的成像剂。
[0068]
另一方面，本发明提供了il27rα结合分子，其在体内被修饰以延长作用持续时间，其中il27rα结合分子偶联至一个或多个运载体分子。
[0069]
本发明提供了il27rα结合分子，其包括特异性结合il27rα胞外结构域的多肽序列，以及其用于分离、耗竭或富集生物样品中表达il27rα的细胞的使用方法。
具体实施方式
[0070]
引言
[0071]
为了使本发明更容易被理解，下文以及整个说明书中对某些术语和短语进行了定义。本文提供的定义是非限制性的，应根据本领域技术人员的知识阅读。
[0072]
在描述本发明的方法和组合物之前，应理解，本发明不限于所述的方法或组合物，因为它们当然可能变化。
[0073]
提供数值范围时，也应视作具体公开了该范围的上限和下限之间以下限单位十分
之一为间隔的各中间数值，除非上下文另有明确说明。本发明还包括设定范围内任何设定数值或中间数值和该设定范围内任何其它设定数值或中间数值之间的较小范围。取决于设定范围内任何明确排除的限值，所述范围可独立地包含或排除这些较小范围的上下限，本发明也包括这些较小范围不包含限值、包含任一或两个限值的各范围。设定范围包含一个或两个限值时，本发明也包括排除所述限值之一个或两个的范围。
[0074]
除非另有说明，本文所用的所有科技术语与本发明所属领域普通技术人员所理解的通常含义相同。虽然也可采用与本文所述类似或等同的任何方法和材料实施或测试本发明，但在此描述一些潜在和优选的方法和材料。本文提及的所有出版物均通过引用纳入本文，以公开和描述与所引用出版物相关的方法和/或材料。
[0075]
应注意，本文和所附权利要求书所用的单数形式"一个"、"一种"和"所述"包括复数含义，除非上下文另有明确说明。因此，例如，提到"细胞"包括多个这样的细胞，提到"所述肽"包括本领域技术人员已知的一或多个肽及其等同物，例如多肽，等等。
[0076]
提供本文讨论的出版物仅针对其在本技术提交日之前的公开。本文中所有内容均不应解释为承认本发明不能凭借在先发明而先于这些出版物。此外，所提供的出版日期可能与实际公开日期不同，这可能需要单独确认。
[0077]
应理解，在本公开内容中，根据单字母或三字母代码提及氨基酸。为了方便阅读者，单字母和三字母氨基酸代码在下表5中提供：
[0078][0079][0080]
科学文献中描述了分子生物学的标准方法(参见，例如，sambrook和russell(2001)《分子克隆》(molecular cloning)，第3版，冷泉港实验室出版社(cold spring harbor laboratory press)，纽约冷泉港；和ausubel,等(2001)《新编分子生物学指南》(current protocols in molecular biology),卷1-4，约翰威利父子公司(john wiley and sons,inc.)纽约州纽约，其描述了在细菌细胞中克隆和dna定点诱变(卷1)、哺乳动物细胞中和酵母中的克隆(卷2)、糖偶联物和蛋白质表达(卷3)，以及生物信息学(卷4))。科学文献描述了用于蛋白质纯化的方法，包括免疫沉淀、层析、电泳、离心和结晶，以及化学分析、化学修饰、翻译后修饰、融合蛋白的生产和蛋白糖基化(参见，例如，coligan,等(2000)
《新编蛋白质科学方案》(current protocols in protein science),卷.1-2,约翰威利父子公司(john wiley and sons,inc.),ny)。
[0081]
定义
[0082]
除非另有说明，下述术语意在具有如下含义。在整个说明书中定义了其他术语。
[0083]
激活：本文所用术语“激活”用于指受体或受体复合物以反映直接和/或通过参与多组分信号转导级联产生的生物学效应，该生物学效应是对配体的结合响应，由激动剂配体结合至受体产生的。
[0084]
活性：如本文所用术语“活性”是针对分子而言，以描述分子相对于测试系统(例如，试验)的特性或生物学或化学特性(例如该分子结合至另一分子的程度)或材料或细胞的物理学特性(例如细胞膜电位的改变)。这种生物学功能的例子包括但不限于生物剂的催化活性、刺激胞内信号转导的能力、基因表达、细胞增殖、调节免疫学活性(如炎症反应)的能力。“活性”通常表示为每个单元的测试试剂的生物活性水平，例如[催化活性]/[mg蛋白质]、[免疫活性]/[mg蛋白质]，活性的国际单位(iu)，[stat5磷酸化]/[mg蛋白质]、[增殖]/[mg蛋白质]、噬斑形成单位(plaque forming units)(pfu)等。如本文所用，术语增殖活性指促进细胞增殖和复制的活性，其包括在肿瘤疾病、炎症性疾病、纤维化、发育异常、细胞转化、转移和血管生成中观察到的失调的细胞分裂。
[0085]
给药/给予：术语“给予”和“施用”在本文中可互换使用，指的是接触对象的行为，包括用试剂与对象体外、体内和/或离体的细胞、组织、器官或生物流体接触(例如，il27rα结合分子或表达il27rα结合分子的工程改造细胞、化疗剂、抗体或包含上述一种或多种的药物制剂)。试剂的给予可以通过多种本领域认可的方法中的任一种实现，包括但不限于局部给予、血管内注射(包括静脉或动脉内输注)、皮内注射、皮下注射、肌内注射、腹膜内注射、颅内注射、瘤内注射、经皮、经粘膜、离子电渗透递送(iontophoretic delivery)、淋巴管内注射、胃内输注、前列腺内注射、膀胱内输注(如：膀胱)、吸入(例如呼吸道吸入器，包括干粉吸入器)、眼内注射、腹内注射、病灶内注射、卵巢内注射、脑内输注或注射、脑室内注射(icvi)等。术语“给予”包括试剂与细胞、组织或器官的接触，以及试剂与液体的接触，其中液体与细胞、组织或器官接触。
[0086]
亲和力：如本文所用术语“亲和力”是指第一分子(例如配体)特异性结合至第二分子(例如受体)的程度，以平衡解离常数(kd)衡量，其为分子与其靶标之间的解离速率常数(k
off
)和分子与其靶标之间的缔合速率常数(k
on
)的比率。
[0087]
激动剂：如本文所用，术语“激动剂”是指特异性结合至第二试剂(“靶标”并与靶标相互作用以引起或促进靶标激活的增加的第一试剂。在一些情况下，激动剂是受体蛋白的激活剂，可以调节细胞激活、增强激活、使细胞对第二试剂的激活敏感、或上调一个或多个基因、蛋白质、配体、受体、生物学途径，其可能导致细胞增殖或导致细胞周期停止，或导致细胞死亡(如通过凋亡)的途径的表达。在一些实施方式中，激动剂是结合至受体并改变受体状态，导致生物学反应的试剂，其模拟受体的内源配体的作用。术语“激动剂”包括部分激动剂、完全激动剂和超级激动剂。当激动剂导致所研究的受体诱发的基本完全的生物响应(即与天然存在的配体/受体结合相互作用有关的响应)时，可将这种激动剂描述为“完全激动剂”，或者，激动剂也可以被描述为部分激动剂。"超级激动剂"是能够产生大于靶受体的内源性激动剂的最大响应的激动剂，因此具有超过天然配体的100％的活性。超级激动剂通
常是合成分子，在比较试验中以类似的浓度评估时，在分子的天然存在形式的可评估的定量或定性参数中，其表现出大于110％、或者大于120％、或者大于130％、或者大于140％、或者大于150％、或者大于160％、或者大于170％的响应。应该注意的是，与完全激动剂相关的生物效应可能在程度和/或种类上与部分或超级激动剂的那些生物效应不同。与激动剂相反，拮抗剂可以特异性地结合至受体，但不导致通常由受体启动的信号级联，并且可以改变激动剂在该受体上的作用。反向激动剂是指产生与激动剂方向相反的药理反应的药剂。
[0088]
拮抗剂：如本文所用，术语“拮抗剂”或“抑制剂”是指与激动剂一种或多种作用相对的分子。拮抗剂可以防止、减少、抑制或中和激动剂的活性，而且拮抗剂也可以防止、抑制或减少靶标(如靶受体)的组成型活性，即使没有鉴定的激动剂。抑制剂是减少、阻断、防止、延迟激活、失活、脱敏或下调，例如，基因、蛋白质、配体、受体、生物学途径(包括免疫检查点途径)或细胞的分子。
[0089]
抗体：如本文所用，术语“抗体”统称指：(a)糖基化的或非糖基化的免疫球蛋白，其特异性结合至靶分子，和(b)其免疫球蛋白衍生物，包括但不限于抗体片段，例如单域抗体。在一些实施方式中免疫球蛋白衍生物与其来源的免疫球蛋白竞争结合至靶分子。术语抗体不限于来自任何特定物种(包括鼠、人、马、骆驼)的免疫球蛋白、软骨鱼(包括但不限于鲨鱼)的抗体。术语“抗体”包括可从天然来源或用抗原免疫后从动物身上分离的抗体，以及工程改造的抗体，包括单克隆抗体、双特异性抗体、三特异性、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、cdr移植的、饰面(veneered)的或去免疫化的(例如，去除t细胞表位)抗体、骆驼源化的(在vhh的情况下)，或非免疫球蛋白支架中包含抗体的结合结构域(如cdr)的分子。术语"抗体"应解释为不限于任何特定的合成方式，包括可从天然来源分离的天然存在的抗体，以及通过"重组"手段制备的工程改造抗体分子，所述工程改造的抗体分子包括从转人免疫球蛋白基因的转基因动物或由其制备的杂交瘤分离的抗体，从转化了导致抗体表达的核酸构建体的宿主细胞中分离出的抗体，从组合抗体文库(包括噬菌体展示文库)中分离出的抗体。在一个实施方式中，“抗体”是igg1，igg2，igg3或igg4类的哺乳动物免疫球蛋白。在一些实施方式中，该抗体是“全长抗体”，其包括提供结合和效应功能的可变和恒定结构域。如本文所用术语“单域抗体”(sdab)是指由单体可变抗体结构域组成的抗体片段，其能够特异性地结合至抗原并与其所衍生自的亲本抗体竞争结合。术语“单域抗体”包括scfv和vhh分子。如本文所用，术语“vhh”是指衍生自骆驼科动物抗体的单域抗体，通常获取自骆驼科(包括骆驼、美洲驼和羊驼)的免疫(参见，例如hamers-casterman,等(1993)nature 363:446-448)。vhh也可以称为重链抗体或作为单域抗体也可以来源于非哺乳动物来源，例如从软骨鱼(包括但不限于鲨鱼)的ignar抗体免疫中获得的vhh。
[0090]
生物样品：如本文所用，术语“生物样品”或“样品”表示获自(或源自)对象的样品。举例而言，生物样品包括选自下组的材料：体液、血液、全血、血浆、血清、粘液分泌物、唾液、脑脊液(csf)、支气管肺泡灌洗液(balf)、眼液(如玻璃体液、房水)、淋巴液、淋巴结组织、脾脏组织、骨髓、肿瘤组织，包括来自这些组织中一种或多种的富集的或细胞类型特异性富集的免疫球蛋白的部分。
[0091]
il27rα细胞：术语“il27rα细胞”、“表达il27rα的细胞”、“il27rα阳性细胞”和“il27rα+”细胞在本文中可以互换使用，指细胞膜的胞外表面上表达和展示il27rα抗原的细胞。类似地，术语“il27rα阴性细胞”、“il27rα-细胞”在本文中可以互换使用，描述细胞膜
上不表达或展示il27rα抗原的细胞。
[0092]
cdr:如本文所用，术语“cdr”或“互补决定区”是指在重链和轻链免疫球蛋白多肽的可变区内发现的非连续抗原结合位点。cdr已由kabat等，j.biol.chem.252:6609-6616(1977)；kabat等，(1991)u.s.美国卫生及公共服务部,题为“免疫学热门蛋白质序列(sequences of proteins ofimmunological interest)”(本文中也称为“kabat 1991”或“kabat”)；由chothia等，j.mol.biol.196:901-917(本文中也称为“chothia”)；以及maccallum等，(1996)j.mol.biol.262:732-745描述，其中定义包括当彼此比较时氨基酸残基的重叠或子集。不过，述及抗体或移植抗体或其变体的cdr定义意在落在本文定义或所用术语范围之内。在本发明的上下文中，除非另有说明，cdr位置的编号是根据kabat或kabat和chothia编号法的混杂提供的。
[0093]
相当的：如本文所用，术语“相当的”用于描述可评价的定量或定性参数的两个测量结果的差异程度。例如，当可评价的定量参数的第一测量结果和该可评价参数的第二测量结果没有偏离本领域技术人员将会认为两个结果之间不会产生统计学显著性差异的范围，那么这两个测量将被视为“相当的”。在一些情况下，如果一个测量结果偏离另一个测量结果少于35％、或者少于30％、或者少于25％、或者少于20％、或者少于15％、或者少于10％、或者少于7％、或者少于5％、或者少于4％、或者少于3％、或者少于2％或者少于1％，则测量结果可被视为“相当的”。在特定的实施方式中，如果一个测量结果偏离参考标准少于15％、或者少于10％、或者少于5％，则该测量结果与参考标准是相当的。
[0094]
保守氨基酸取代：如本文所用，术语“保守氨基酸取代”是指将给定氨基酸改变为具有类似生物化学特性(例如电荷、疏水性和大小)的不同氨基酸的氨基酸替代。例如，以下各组中的氨基酸可以被认为是彼此的保守氨基酸：(1)疏水性氨基酸：丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、脯氨酸和甘氨酸；(2)极性氨基酸：谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸和半胱氨酸；(3)碱性氨基酸：赖氨酸和精氨酸；和(4)酸性氨基酸：天冬氨酸和谷氨酸。
[0095]
来源于：如本文所用术语“来源于”，在氨基酸序列的上下文中意为表示多肽或核酸具有基于参考多肽或核酸的序列，不意在被限制为制备蛋白质或核酸的来源或方法。举例而言，术语“来源于”包括参考氨基酸或dna序列的同源物或变体。
[0096]
有效浓度(ec):如本文所用，术语“有效浓度”或其缩写“ec”互换使用表示试剂的浓度为足以使测试系统中给定参数产生变化的量。缩写“e”指的是当测试系统被暴露于测试试剂时，测试系统中观察到的给定生物学效应的量级。当反应的量级以测试试剂的浓度(“c”)的因数表示时，使用缩写“ec”。在生物系统的环境下，术语e
最大
指的是在响应于激活测试试剂的饱和浓度中观察到的给定生物学效应的最大量级。当提供带下标的缩写ec(例如，ec
40
、ec
50
等)时，下标是指在该浓度观察到生物学反应的e
最大值
的百分比。例如，在测试系统中，响应于此测试试剂，测试试剂足以导致可测量的生物学参数减少这种可测量的生物学参数的最大水平的30％的浓度，针对此生物学参数，其被称为该测试试剂的“ec
30”。类似地，术语“ec
100”用于表示试剂的有效浓度，该浓度使得可测量参数对该试剂产生最大(100％)反应。类似地，术语ec
50
(其通常用于药代动力学领域)是指足以导致可测量参数半最大(约50％)改变的试剂浓度。术语“饱和浓度”是指在标准温度和压力的条件下，测试试剂能够溶于标准体积的特定溶剂(例如水)的最大可能量。在药代动力学中，药物的饱和浓度通常用
于表示足以使所有可用受体被药物占据的药物浓度，而ec
50
是给予半最大效应的药物浓度。
[0097]
富集的：如本文所用的术语“富集的”是指对样品进行非天然操作，以使感兴趣的物质(例如分子或细胞)以以下情形存在：(a)比物质在起始样品，如生物样品，(例如在该样品中分子天然存在或在给药后存在)中的浓度高(例如，至少高3倍、或者至少高5倍、或者至少高10倍、或者至少高50倍、或者至少高100倍、或者至少高1000倍)；或(b)浓度高于制备该分子的环境(例如，在重组修饰的细菌或哺乳动物细胞中)。
[0098]
胞外结构域：如本文所用术语"胞外结构域"或其缩写"ecd"是指细胞质膜外侧的细胞表面蛋白质部分(例如细胞表面受体)。细胞表面蛋白可以是跨膜蛋白、细胞表面或膜关联蛋白。
[0099]
同一性：对于多肽或dna序列本文所用的术语"同一性"是指两个分子之间的亚单位序列同一性。当两个分子中的亚单位位置被相同的单体亚单位(即相同的氨基酸残基或核苷酸)占据时，那么这两个分子在该位置是相同的。两个氨基酸或两个核苷酸序列之间的相似性是相同位置的量的直接函数。通常，比对序列以获得最高阶匹配。如有必要，可以用已公开的技术和广泛使用的计算机程序来计算同一性，例如blast 2.0算法，描述于altschul等(1990)j.mol.biol.215:403-410和altschul,等(1977)nucleic acids res.25:3389-3402。进行blast分析的软件可从国家生物技术信息中心(national center for biotechnology information)(ncbi)网站公开获得。此算法包括：首先通过鉴定查询序列中长度为w的短字来鉴定高评分序列对(hsp)，与数据库序列中长度相同的字比对时它们能匹配或满足一些正值的阈值评分“t”。t称为相邻字评分阈值(altschul等，同上)。这些初始相邻字命中(word hit)用作启动搜索的种子，以便找到含有它们的较长hsp。然后，沿各序列在两个方向上延伸该字命中，直到提高累积的比对评分。就核苷酸序列而言，采用参数“m”(一对匹配残基的奖励评分；总是》0)和“n”(错配残基的罚分；总是《0)计算累积评分。就氨基酸序列而言，用评分矩阵计算累积评分。出现以下情况时中止字命中在各个方向上的延伸：(a)累积比对评分比其最大获得值降低x；由于一个或多个负评分残基比对的累积，累积评分变为零或零以下；或者(b)达到任一序列的末端。blast算法参数“w”、“t”和“x”确定该比对的灵敏度和速度。blastn程序(用于核苷酸序列)功能类似但采用的默认值如下：字长(“w”)28，期望值(“e”)10，m＝1，n＝-2，以及比较两条链。就氨基酸序列而言，blastp程序使用如下默认值：字长(w)为3，期望值(e)为10和blosum62评分矩阵(参见henikoff和henikoff,(1989)pnas(usa)89:10915-10919)。
[0100]
以足以产生响应/反应/缓解(response)的量：如本文所使用的短语“以足以产生反应/响应/缓解(response)的量”用于指在对于测试系统应用测试试剂之前(如基线水平)和之后足以提供所测指标水平的可检测的变化的测试试剂的量。在一些实施方式中，测试系统是细胞、组织或生物体。在一些实施方式中，测试系统是体外测试系统，例如荧光试验。在一些实施方式中，测试系统是体内系统，其涉及在将测试剂应用于细胞、组织或生物体之前和之后测量反映生物功能的细胞、组织或生物体的参数水平的变化。在一些实施方式中，该指标反映了在试验中评估的细胞的生物功能或发育状态，以响应于一定量的测试试剂的给予。在一些实施方式中，测试系统涉及在将一种或多种测试试剂应用于细胞、组织或生物体之前和之后测量反映生物功能的细胞、组织或生物体的指示剂水平的变化。术语“足以产生反应的量”可以是足以治疗有效的量，但也可能多于或少于治疗有效量。
[0101]
抑制剂：如本文所用术语“抑制剂”是减少、阻断、防止、延迟激活、失活、脱敏或下调的分子，例如，基因、蛋白质、配体、受体或细胞。抑制剂也可以被定义为减少、阻断或失活细胞或生物体的组成型活性的分子。
[0102]
胞内结构域：如本文所用术语"胞内结构域"或其缩写"icd"是指细胞质膜内的细胞表面蛋白质部分(例如细胞表面受体)。icd可以包含跨膜蛋白或膜关联蛋白的整个胞内部分，或胞内蛋白。
[0103]
分离的：如本文所使用的术语“分离的”是指感兴趣的多肽，如果是天然存在的，其环境与它可能天然存在的环境不同。“分离的”意指包括在样品中的多肽，其基本上富集了感兴趣的多肽和/或感兴趣的多肽被部分或基本上纯化了。如果多肽不是天然存在的，“分离的”表示该多肽已经从其通过合成的环境中分离出来，例如从包含工程改造以表达该多肽的细胞的重组细胞培养物中分离出来，或通过来自固相合成方式产生的溶液。
[0104]
kabat编号：本文所用的术语"kabat编号"是本领域公认的术语，指的是对免疫球蛋白的重链和轻链区域中比其他氨基酸残基更可变的氨基酸残基(例如，高变的(hypervariable))进行编号的系统(kabat,等,(1971)ann.ny acad.sci.190:382-93；kabat,等,(1991)《免疫学感兴趣的蛋白质的序列》(sequences of proteins of immunological interest),第五版，美国卫生与公共服务部，nih出版号91-3242)。如本文所用术语“chothia编号”是本领域公认的术语，指基于结构环区的位置编号氨基酸残基的系统(chothia等1986,science 233:755-758；chothia和lesk 1987,jmb 196:901-917；chothia等1992,jmb 227:799-817)。出于本公开的目的，除非另有特别说明，抗体可变区域中cdr2和3的定位遵循kabat编号或简称为"kabat"。抗体可变区域中cdr1的定位遵循kabat和chothia编号方案的混杂。
[0105]
配体：如本文所用，术语“配体”是指特异性结合受体并导致受体变化的分子，其使得受体的活性发生改变或在表达受体的细胞中发生反应。在一个实施方式中，术语“配体”是指可以作为受体的激动剂或拮抗剂的分子或其复合物。如本文所用，术语“配体”包括天然和合成的配体。“配体”也包括小分子，细胞因子和抗体的肽模拟物。配体和受体的复合物被称为“配体-受体复合物”。配体可以包括多蛋白或融合蛋白的一个结构域(例如，或抗体/配体融合蛋白的结构域)
[0106]
调节：如本文所用，术语“调节”、“调制”等是指测试试剂在系统(包括生物系统或生化途径)中引起反应的能力，可以是积极或消极的，也可以是直接或间接的。术语调节剂包括激动剂(包括部分激动剂、完全激动剂和超级激动剂)和拮抗剂。
[0107]
核酸：术语“核酸”、“核酸分子”、“多核苷酸”等在本文中可互换使用，并且是指任何长度的核苷酸的聚合形式，即脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或其类似物。多核苷酸的非限制性例子包括线性和环形核酸、信使rna(mrna)、互补dna(cdna)、重组多核苷酸、载体、探针、引物等。
[0108]
操作性地连接：在本文中使用术语“操作性地连接”指的是分子之间的关系，通常是多肽或核酸，它们被安排在构建体中，使得各组分分子的功能得以保留，尽管操作性连接可能导致构建体中单独组成部分的活性被正向或负向地调控。例如，聚乙二醇(peg)分子操作性连接至野生型蛋白，可能导致构建体中该蛋白的生物活性相对于野生型分子降低，但两者仍被视为操作性地连接。当术语“操作性地连接”用于指编码不同功能的多个核酸序列
在组合成单个核酸分子的关系时，例如，当使用重组技术将其引入细胞时，提供能够在细胞中实现特定核酸序列的转录和/或翻译的核酸。例如，如果它导致前蛋白的表达，编码信号序列的核酸序列可以被认为操作性地连接至编码多肽的dna，由此信号肽促进多肽分泌；如果它影响序列的转录，启动子或增强子被认为操作性地连接至编码序列；或如果它被定位以促进翻译，核糖体结合位点被认为操作性地连接至编码序列。通常，在核酸分子的上下文中，术语"操作性地连接"意为被连接的核酸序列是连续的，在分泌型前导或分子的相关联亚结构域的上下文中，其为连续的并且处于阅读段。然而，某些遗传元件，如增强子，可以在一定距离处发挥功能，不需要与它们产生作用的序列连续，但可以被认为操作性地连接。
[0109]
亲本多肽：如本文所用，术语"亲本多肽"或"亲本蛋白"互换使用以表示第二多肽(例如衍生物、突变蛋白或变体)的来源，相对于第一"亲本"多肽，第二蛋白经修饰。在一些情况下，亲本多肽是蛋白的野生型或天然存在形式。在一些情况下，亲本多肽可以经修饰，形成进一步修饰的天然存在的蛋白。术语“亲本多肽”可以指多肽自身或包含亲本多肽的组合物(例如糖基化的或peg化形式和/或包含亲本多肽的融合蛋白)。
[0110]
部分激动剂：如本文所用，术语“部分激动剂”是指特异性结合结合至并激活给定受体的分子，但相对于完全激动剂，它只具有部分激活受体。部分激动剂可以同时表现激动和拮抗作用。例如，当完全激动剂和部分激动剂同时存在时，部分激动剂作为竞争性拮抗剂，通过与完全激动剂竞争对受体的结合，相对于在不存在部分激动剂的情况下受体与完全激动剂的接触，导致受体激活净减少。当内源性配体存在的数量不足时，对象中的部分激动剂可用于激活受体以提供所需的亚最大反应，或者当内源性配体数量过多时，它们可减少对受体的过度刺激。部分激动剂产生的最大反应(e
最大
)被称为其固有活性，当完全激动剂产生100％的反应时，可以用百分比表示其固有活性。在给定的试验系统中以类似浓度评估时，部分激动剂可以具有参考多肽的活性的大于10％但低于100％、或大于20％但小于100％、或大于30％但小于100％、或大于40％但小于100％、或大于50％但小于100％、或大于60％但小于100％、或大于70％但小于100％、或大于80％但小于100％、或大于90％但小于100％。
[0111]
多肽：如本文所用术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文可互换使用，并且指任何长度的氨基酸的聚合形式，其可以包括遗传编码的或非遗传编码的氨基酸，化学或生物化学修饰的或衍生的氨基酸，和具有修饰的多肽主链的多肽。术语多肽包括融合蛋白，包括但不限于具有异源氨基酸序列的融合蛋白；具有异源和同源前导序列的融合蛋白；具有或不具有n-末端甲硫氨酸残基的融合蛋白；具有促进纯化的氨基酸序列(例如螯合肽)的融合蛋白；具有免疫学标签蛋白的融合蛋白；包含具有免疫学活性多肽片段(例如抗原性白喉或破伤风毒素或毒素片段)的肽的融合蛋白等等。
[0112]
受体：如本文所用，术语“受体”是指具有特异性结合配体的结构域的多肽，该配体的结合导致该多肽的至少一种生物学特性的改变。在一些实施方式中，受体是细胞膜关联蛋白，其包括胞外结构域(ecd)和膜关联结构域，后者用于将ecd锚定至细胞表面。在细胞表面受体的一些实施方式中，受体是跨膜多肽，其包括由通常称为跨膜结构域(transmembrane domain)(tm)的跨膜的结构域(membrane spanning domain)连接的胞内结构域(icd)和胞外结构域(ecd)。同源配体结合至受体导致受体的构象变化，从而产生可测量的生物学效应。在一些情况下，如果受体是包括ecd、tm和icd的跨膜多肽，配体结合至
ecd导致由icd的一个或多个结构域介导的可测量的胞内生物学效应，以响应于配体结合至ecd。在一些实施方式中，受体是多组分复合物的组分，以促进胞内信号转导。例如，配体可以结合细胞表面受体，该受体不单独与任何胞内信号转导相关联，但在配体结合后促进异源多聚体(包括异二聚体、异三聚体等)或同源多聚体(例如同二聚体、同三聚体、同四聚体等)复合物的形成，导致细胞中可测量的生物学效应，例如胞内信号转导级联(例如jak/stat途径)的激活。在一些实施方式中，受体是跨膜单链多肽，其包括ecd、tm和icd结构域，其中ecd、tm和icd结构域来源于相同或不同的天然存在的受体变体或其合成功能性等同物。
[0113]
重组：如本文所用，术语“重组的”用作形容词指使用重组dna技术修饰多肽、核酸或细胞的方法。“重组蛋白”是指使用重组dna技术产生的蛋白，通常在蛋白名称前缩写为小写“r”，以表示产生蛋白的方法(例如重组产生的人生长激素通常缩写为“rhgh”。类似地，如果细胞经修饰，通过使用重组dna技术纳入(例如转染、转导、感染)外源核酸(例如ssdna、dsdna、ssrna、dsrna、mrna、病毒或非病毒载体、质粒、黏粒等)，则细胞被称为“重组细胞”。用于重组dna技术的技术和方案是本领域众所周知的，例如，可以在sambrook等(1989)《分子克隆：实验室手册》(molecular cloning:a laboratory manual)(第2版,冷泉港实验室出版社,纽约州普莱恩维尤)中和其他标准分子生物学实验手册中找到。
[0114]
反应/响应/缓解：术语“反应/响应/缓解”，例如，细胞、组织、器官或生物体的反应，包括可评估的生化或生理参数(例如，浓度、密度、粘附性、增殖、激活、磷酸化、迁移、酶活、基因表达水平、基因表达率、能量消耗率(rate of energy consumption)、分化水平或状态)的定量或定性变化，其中该变化与激活、刺激或处理相关，或与外源试剂接触或内部机制(如遗传编程)相关。在某些情况下，术语“激活”、“刺激”等是指由内部机制以及外部或环境因素调节的细胞激活；而术语“抑制”、“下调”等则是指相反的效果。“反应/响应/缓解”可以在体外评估，例如通过使用试验系统、表面等离子体共振、酶活、质谱、氨基酸或蛋白质测序技术。“反应/响应/缓解”可以体内定量评估，通过评估客观生理参数，例如体温、体重、肿瘤体积、血压、x-射线或其他成像技术的结果，或通过报告的主观感受(幸福、抑郁、忧虑或疼痛)的改变定性评估。在一些实施方式中，cd3激活的原代人t细胞的增殖水平可以在生物发光试验中评估，该试验产生与存在的atp的量成比例的发光信号，而atp与存在于培养物中的活细胞的量成比例，如crouch,等(1993)j.immunol.methods 160:81
–
8所述，或使用市售可得的试验，例如2.0细胞活力实验或3d细胞活力试剂盒，其可商购自普洛麦格公司(promega corporation)，麦迪逊wi 53711，货号g9241和g9681，基本根据制造商提供的说明书进行。在一些实施方式中，响应于测试试剂的给予的t细胞的激活水平可以通过所述流式细胞术方法测定，如通过stat(例如stat1、stat3、stat5)磷酸化水平测定，根据本领域众所周知的方法。
[0115]
显著减少的结合：如本文所用，术语“表现出显著减少的结合”用于相较于第一分子的亲本形式，第一分子(例如配体或抗体)的变体对于第二分子(例如受体或抗原)表现出显著减少的亲和力。如果变体抗体对抗原的亲和力，如果变体对受体的天然形式的结合为该变体所来源于的亲本抗体的小于20％、或小于约10％、或小于约8％、或小于约6％、或小于约4％、或小于约2％、或小于约1％、或小于约0.5％，则对于抗体变体，抗体变体“表现出显著减少结合”。类似地，如果变体配体结合至受体的亲和力为该变体配体所来源于的亲本
配体的亲和力的小于20％、或小于约10％、或小于约8％、或小于约6％、或小于约4％、或小于约2％、或小于约1％、或小于约0.5％，则对于变体配体，变体配体“表现出显著减少结合”。类似地，如果变体受体结合的亲和力为该变体受体所来源于的亲本受体的小于20％、或小于约10％、或小于约8％、或小于约6％、或小于约4％、或小于约2％、或小于约1％、或小于约0.5％，则对于变体受体，变体配体“表现出显著减少结合”。
[0116]
一种或多种小分子：术语“小分子”指的是分子量小于约10kda、小于约2kda或小于约1kda的化学化合物(通常是药学活性化合物)小分子包括但不限于无机分子、有机分子、包含无机组分的有机分子、包含放射性原子的分子和合成分子。术语“小分子”是制药业普通技术人员所熟知的术语，通常用于区分有机化学化合物和生物制剂。
[0117]
特异性结合：如本文所用的术语“特异性结合”是指对于第二分子，第一分子表现出亲和性/亲和力的程度。在结合对(如配体/受体、抗体/抗原)的上下文中，当结合对的第一分子不以显著量结合至样品中存在的其他组分时，就称作结合对的第一分子特异性结合至结合对的第二分子。当结合对的第一分子对第二分子的亲和力比第一分子对样品中存在的其他组分的亲和力至少大2倍、或至少大5倍、或至少大10倍、或至少大20倍、或至少大100倍时，结合对的第一分子被称为特异性结合至结合对的第二分子。在结合对中的第一分子是抗体的特定实施方式中，如果抗体和抗原之间的平衡解离常数(kd)大于约106m、或者大于约108m、或者大于约10
10
m、或者大于约10
11
m、大于约10
12
m，例如通过scatchard分析确定，则该抗体特异性结合至抗原(或蛋白质、抗原、配体或受体的抗原决定簇(表位))(munsen,等(1980)analyt.biochem.107:220-239)。在一个实施方式中，其中配体是结合il27rα的sdab，受体包括il27rα，如果结合il27rα的sdab/il27rαecd的平衡解离常数大于约105m、或大于约106m、或大于约107m、或大于约108m、或大于约109m、或大于约10
10
m、或大于约10
11
m，则结合il27rα的sdab特异性结合。特异性结合可使用本领域已知的技术进行评估，包括但不限于竞争elisa、放射性配体结合试验(例如，饱和结合、斯卡查德图(scatchard plot)、非线性曲线拟合程序和竞争结合试验)；非放射性配体结合试验(例如，荧光偏振(fluorescence polarization)(fp)、荧光共振能量转移(fret)；液相配体结合试验(例如，实时聚合酶链式反应(rt-qpcr)和免疫沉淀)；和固相配体结合试验(例如，多孔板试验、珠上配体结合试验、柱上配体结合试验和过滤试验)和表面等离子体共振试验(参见，例如，drescher等(2009),methods mol biol 493:323-343，使用市售可得的仪器例如biacore 8k、biacore 8k+、biacore s200、biacore t200(cytiva,100results way,马萨诸塞州马尔伯勒01752)。在一些实施方式中，本发明提供特异性结合至il27rα同种型的分子(例如结合il27rα的sdab)如本文所用，il27rα结合分子对il27rα的结合亲和力，可通过表面等离子体共振(“spr”)测定和/或定量结合亲和力。在评估il27rα结合分子对il27rα的结合亲和力时，可以固定结合对的任一成员，并在流动相中提供结合对的另一元件。在一些实施方式中，其上要固定感兴趣蛋白的传感器芯片与促进感兴趣蛋白结合的物质偶联，例如氮三乙酸(nta)衍生的表面等离子体共振传感器芯片(例如，可从cytiva全球生命科学解决方案美国有限责任公司(cytiva global life science solutions usa llc)，马萨诸塞州马尔伯勒，获得的传感器芯片nta，目录号br100407)，作为抗his标签抗体(例如可从cytiva，马萨诸塞州马尔伯勒，商购的抗组氨酸cm5芯片)、蛋白a或生物素。因此，为了评估结合，经常需要修饰蛋白质以提供与偶联至芯片表面的物质的结合。例如，通过纳入包含多组氨酸序列
(例如6xhis或8xhis)的螯合肽以保留在与nta偶联的芯片上来评估结合对的一个成员。在一些实施方式中，il27rα结合分子可以固定在芯片上，可以在流动相中提供il27rα(或其ecd片段)。或者，il27rα(或其ecd片段)可以固定在芯片上，可以在流动相中提供il27rα结合分子。在任一情况下，应注意，一些固定在涂覆的spr芯片上的蛋白质的修饰可能会干扰待用spr评估的结合对的一个或两个组分的结合特性。在这种情况下，可能需要切换结合对的可移动和结合元件，或者使用具有结合剂的芯片，所述结合剂促进待评估蛋白质的非干扰偶联。或者，当使用spr评估il27rα结合分子对il27rα的结合亲和力时，il2rb结合分子可以通过c末端加入多聚-his序列(例如6xhis或8xhis)衍生并固定在nta衍生的传感器芯片上，在流动相中提供了正在评估其配体的结合亲和力的il27rα受体亚基。将多聚-his序列纳入到通过重组dna技术产生的il27rα结合分子的c末端的方法是生物技术相关领域的技术人员熟知的。在一些实施方式中，使用spr的il27rα结合分子对il27rα的结合亲和力基本上符合实施例的教导。
[0118]
对象：术语“受体”、“个体”、“对象”和“患者”在本文中可互换使用，并指任何需要诊断、处理或治疗的哺乳动物对象，特别是人。用于治疗目的的"哺乳动物"是指被分类为哺乳动物的任何动物，包括人、家养和农场动物、非人灵长类动物，以及动物园、运动或宠物动物，例如狗、马、猫、奶牛、绵羊、山羊、猪等。在一些实施方式中，哺乳动物为人。
[0119]
基本上纯的：如本文所用，术语“基本上纯的”表示组合物的组分占组合物总含量的大于约50％、或大于约60％、或大于约70％、或大于约80％、或大于约90％、或大于约95％。“基本上纯的”蛋白质占组合物总含量的大于约50％、或大于约60％、或大于约70％、或大于约80％、或大于约90％、或大于约95％。
[0120]
t-细胞：如本文所用术语“t-细胞”或“t细胞”以其常规意义使用，是指在胸腺中分化的淋巴细胞，拥有特定细胞表面抗原受体,包括一些控制细胞介导的免疫和体液免疫的起始或抑制的淋巴细胞和其他裂解携带抗原细胞的淋巴细胞。在一些实施方式中，t细胞包括但不限于原初cd8
+
t细胞、细胞毒性cd8
+
t细胞、原初cd4
+
t细胞、辅助t细胞，例如th1、th2、th9、th11、th22、t
fh
；调节性t细胞，例如tr1、treg、诱导型treg；记忆性t细胞，例如中心记忆t细胞、效应记忆t细胞、nkt细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(til)和此类t细胞的工程改造变体，包括但不限于car-t细胞、重组修饰til和tcr-工程改造细胞。在一些实施方式中，t细胞是表达il27rα同种型的t细胞，可互换地称为il27rα细胞、il27rα+细胞、il27rαt细胞或il27rα+t细胞)。
[0121]
末端/末端的：如本文在多肽结构的上下文中使用，“n-末端”(或“氨基末端”)和“c-末端”(或“羧基末端”)分别指多肽的极氨基端和羧基端，而术语“n-末端的”和“c-末端的”分别指多肽的氨基酸序列中朝向n-末端和c-末端的相对位置，并可分别包括n-末端和c-末端残基。“近邻n-末端的”是指连续多肽序列中第一氨基酸残基相对于第二氨基酸残基的位置，第一氨基酸距多肽的n-末端更近。“近邻c-末端的”是指连续多肽序列中第一氨基酸残基相对于第二氨基酸残基的位置，第一氨基酸距多肽的c-末端更近。
[0122]
跨膜结构域：术语"跨膜结构域"或"tm"是指跨膜多肽(例如跨膜受体)的多肽结构域，当该跨膜多肽与细胞膜相关联时，该结构域嵌入细胞膜中，并与跨膜多肽的胞外结构域(ecd)和胞内结构域(icd)以肽基键连接(peptidyl linkage)。跨膜结构域可以与胞外和/或胞内结构域中的一个或两个同源(天然相关联)或异源(不天然相关联)。在一些实施方式
中，在受体是包括源自第一亲本受体的胞内结构域和源自第二不同亲本受体的第二胞外结构域的嵌合受体的情况下，嵌合受体的跨膜结构域是通常与衍生嵌合受体的亲本受体的icd或ecd相关联的跨膜结构域。
[0123]
治疗/处理：术语“治疗”、“疗法”、“处理”等是指，对应于对象患有疾病、病症或病状或其症状的诊断，对于对象起始的行动过程(例如使对象接触包含结合il27rα的sdab的药物组合物，单独地或与补充剂组合)，起始该行动过程以暂时或永久地消除、减少、抑制、减轻或改善以下至少之一：(a)困扰对象的疾病、紊乱或病症的根本原因；和/或(b)与这种疾病、紊乱或病症相关的至少一种症状。在一些实施方式中，治疗包括对患有疾病的对象采取的行动过程，其中该行动过程导致对象的疾病被抑制(例如，阻止疾病、病症或病状的发展或改善与此相关的一个或多个症状)。
[0124]
treg细胞或调节性t细胞。本文可互换的术语“调节性t细胞”、“treg细胞”或“treg”是指cd4
+
t细胞的类型，其能够抑制其他t细胞的反应，包括但不限于效应t细胞(t
eff
)。treg细胞通常特征在于表达cd4(cd4+)、il2受体的cd25亚基(cd25+)和转录因子叉头盒p3(foxp3+)(sakaguchi,annu rev immunol 22,531-62(2004)。在一些情况下，术语“常规cd4
+
t细胞”是用于区分非-treg cd4
+
t细胞和cd4
+
treg。
[0125]
变体：术语"变体"、"蛋白质变体"或"变体蛋白质"或"变体多肽"在本文中可互换使用，指的是由于至少一个氨基酸修饰、取代或缺失而与亲本多肽不同的多肽。该亲本多肽可以是天然存在的或野生型(wt)多肽，也可以是wt多肽的修饰形式。术语变体多肽可以指多肽本身、包含多肽的组合物或编码其的核酸序列。在一些实施方式中，相较于亲本多肽，变体多肽包括约1至约10个，或约1至约8个、或约1至约7个、或约1至约5个、或约1至约4个、或约1至约3个、或1至2个氨基酸修饰、取代或缺失，或者单一氨基酸氨基酸修饰、取代或缺失。变体可以与其所衍生的亲本多肽有至少约99％的同一性、或至少约98％的同一性、或至少约97％的同一性、或至少约95％的同一性、或至少约90％的同一性。
[0126]
野生型："野生型"或"wt"或"天然"在本文中是指在自然界中存在的氨基酸序列或核苷酸序列，包括等位基因变异。野生型蛋白质，多肽，抗体，免疫球蛋白，igg等具有未经人工修饰的氨基酸序列或核苷酸序列。
[0127]
il27rα
[0128]
本发明的il27rα结合分子特异性结合il27rα的胞外结构域。
[0129]
人il27rα
[0130]
在一个实施方式中，特异性结合至人il27rα受体亚基(hil27rα)的胞外结构域。hil27rα表达为636个氨基酸的前体，其包含32个氨基酸的n-末端信号序列，信号序列在翻译后被裂解，以提供604个氨基酸的成熟蛋白质。经典全长酸hil27rα前体(包含信号肽)是636个氨基酸的多肽，具有氨基酸序列：
[0131]
mrggrgapfwlwplpklallpllwvlfqrtrpqgsagplqcygvgplgdlncsweplgdlgapselhlqsqkyrsnktqtvavaagrswvaipreqltmsdkllvwgtkagqplwppvfvnletqmkpnaprlgpdvdfseddpleatvhwapptwpshkvlicqfhyrrcqeaawtllepelktipltpveiqdlelatgykvygrcrmekeedlwgewspilsfqtppsapkdvwvsgnlcgtpggeeplllwkapgpcvqvsykvwfwvggrelspegitcccslipsgaewarvsavnatswepltnlslvcldsasaprsvavssiagstellvtwqpgpgeplehvvdwardgdpleklnwvrlppgnlsallpgnftvgvpyritvtavsasglasassvwgfreelaplvgptlwrlqdappgtpaiawgevprhqlrghlthytl
caqsgtspsvcmnvsgntqsvtlpdlpwgpcelwvtastiagqgppgpilrlhlpdntlrwkvlpgilflwglfllgcglslatsgrcyhlrhkvlprwvwekvpdpansssgqphmeqvpeaqplgdlpileveemepppvmessqpaqatapldsgyekhflptpeelgllgpprpqvla
[0132]
(seq id no:1)
[0133]
为了本发明的目的，如本文所述的人il27rα多肽的氨基酸残基的编号是根据该经典序列(uniprot参考号q6uwb1,seq id no:1)的编号进行的。seq id no:1的氨基酸1-32被鉴定为hil27rα的信号肽，seq id no:1的氨基酸33-516被鉴定为胞外结构域，seq id no:1的氨基酸517-537被鉴定为跨膜结构域，并且seq id no:1的氨基酸538-636被鉴定为胞内结构域。
[0134]
为了产生结合至il27rα的ecd的抗体的目的，可以用hil27rα的胞外结构域进行免疫。hil27rα的胞外结构域是484个氨基酸的多肽，序列为：
[0135]
qgsagplqcygvgplgdlncsweplgdlgapselhlqsqkyrsnktqtvavaagrswvaipreqltmsdkllvwgtkagqplwppvfvnletqmkpnaprlgpdvdfseddpleatvhwapptwpshkvlicqfhyrrcqeaawtllepelktipltpveiqdlelatgykvygrcrmekeedlwgewspilsfqtppsapkdvwvsgnlcgtpggeeplllwkapgpcvqvsykvwfwvggrelspegitcccslipsgaewarvsavnatswepltnlslvcldsasaprsvavssiagstellvtwqpgpgeplehvvdwardgdpleklnwvrlppgnlsallpgnftvgvpyritvtavsasglasassvwgfreelaplvgptlwrlqdappgtpaiawgevprhqlrghlthytlcaqsgtspsvcmnvsgntqsvtlpdlpwgpcelwvtastiagqgppgpilrlhlpdntlrwk
[0136]
(seq id no:192).
[0137]
小鼠il27rα
[0138]
在一个实施方式中，特异性结合至小鼠或鼠il27rα受体亚基(mil27rα)的胞外结构域。mil27rα表达为623个氨基酸的前体，其包含24个氨基酸的n-末端信号序列，信号序列在翻译后被裂解，以提供599个氨基酸的成熟蛋白质。经典全长酸mil27rα前体(包含24个氨基酸的信号肽)是623个氨基酸的多肽，具有氨基酸序列：
[0139]
mnrlrvarltplelllslmslllgtrphgspgplqcysvgplgilncsweplgdletppvlyhqsqkyhpnrvwevkvpskqswvtipreqftmadklliwgtqkgrplwssvsvnletqmkpdtpqifsqvdiseeatleatvqwappvwppqkvlicqfrykecqaetwtrlepqlktdgltpvemqnlepgtcyqvsgrcqvengypwgewssplsfqtpfldpedvwvsgtvcetsgkraallvwkdprpcvqvtytvwfgagditttqeevpcckspvpawmewavvspgnstswvpptnlslvclapesapcdvgvssadgspgikvtwkqgtrkpleyvvdwaqdgdsldklnwtrlppgnlstllpgefkggvpyritvtavysgglaaapsvwgfreelvplagpavwrlpddppgtpvvawgevprhqlrgqathytfciqsrglstvcrnvssqtqtatlpnlhlgsfklwvtvstvagqgppgpnlslhlpdnrirwkalpwflslwglllmgcglslastrclqarclhwrhkllpqwiwervpdpansnsgqpyikevslpqppkdgpileveevelqpvvespkasapiysgyekhflptpeelgllv
[0140]
(seq id no:193)
[0141]
为了本发明的目的，如本文所述的mil27rα多肽的氨基酸残基的编号是根据该经典序列(uniprot参考号o70394,seq id no:193)的编号进行的。seq id no:193的氨基酸1-24被鉴定为mil27rα的信号肽，seq id no:193的氨基酸23-510被鉴定为胞外结构域，seq id no:193的氨基酸511-531被鉴定为跨膜结构域，并且seq id no:193的氨基酸532-623被鉴定为胞内结构域。
[0142]
为了产生结合至il27rα的ecd的抗体的目的，可以用mil27rα的胞外结构域进行免疫。mil27rα受体的胞外结构域是486个氨基酸的多肽，序列为：
[0143]
trphgspgplqcysvgplgilncsweplgdletppvlyhqsqkyhpnrvwevkvpskqswvtipreqftmadklliwgtqkgrplwssvsvnletqmkpdtpqifsqvdiseeatleatvqwappvwppqkvlicqfrykecqaetwtrlepqlktdgltpvemqnlepgtcyqvsgrcqvengypwgewssplsfqtpfldpedvwvsgtvcetsgkraallvwkdprpcvqvtytvwfgagditttqeevpcckspvpawmewavvspgnstswvpptnlslvclapesapcdvgvssadgspgikvtwkqgtrkpleyvvdwaqdgdsldklnwtrlppgnlstllpgefkggvpyritvtavysgglaaapsvwgfreelvplagpavwrlpddppgtpvvawgevprhqlrgqathytfciqsrglstvcrnvssqtqtatlpnlhlgsfklwvtvstvagqgppgpnlslhlpdnrirwk
[0144]
(seq id no:194)
[0145]
il27rα结合分子和单域抗体
[0146]
在一些实施方式中，本发明的il27rα结合分子是单域抗体(sdab)。本发明涉及il27rα结合分子，其包括特异性结合人il27rα同种型(hil27rα)的胞外结构域的单域抗体(sdab)，其在所有表达il27rα细胞中有发现。
[0147]
单域抗体(sdab)是包含单个单体可变抗体结构域的抗体。像全长抗体一样，sdab能够特异性结合抗原决定簇。结合hil27rα的vhh单域抗体可从分离自骆驼科哺乳动物(例如骆驼、美洲驼、单峰驼、羊驼和骆马)的重链抗体中工程改造而来，所述骆驼科哺乳动物用hil27rα胞外结构域或其免疫活性片段免疫。sdab和vhh的描述可以见于例如de greve等,(2019)curr opin biotechnol.61:96-101；ciccarese,等,(2019)front genet.10:997:chanier和chames(2019)《抗体》(antibodies)(basel)8(1)；和de vlieger,等(2018)《抗体》(antibodies)(basel)8(1)。或者，hil27rα单域抗体可从分离自软骨鱼的ignar重链抗体分离的重链抗体工程改造而来，所述软骨鱼用hil27rα的胞外结构域或其免疫活性片段免疫。也可以通过从来自其他哺乳动物物种的免疫球蛋白g(igg)同种型中裂解二聚体可变结构域获得结合hil27rα的sdab，所述哺乳动物物种包括用hil27rα胞外结构域或其免疫活性片段免疫的人、大鼠、兔。尽管目前对sdab的大多数研究都是基于重链可变结构域，但来自轻链的sdab也已被证明特异性结合包含抗原免疫序列的靶蛋白。moller等,jbiol chem.285(49):38348
–
38361,2010。
[0148]
在一些实施方式中，sdab是vhh。vhh是一种具有单个单体重链可变抗体结构域的sdab。与传统抗体类似，vhh能够特异性结合特定抗原。示例性vhh具有约12-15kda的分子量，其比由两条重链和两条轻链构成的传统哺乳动物抗体(150-160kda)小得多。vhh可以在骆驼科哺乳动物(如骆驼、美洲驼、单峰驼、羊驼和骆马)中发现或产生，其天然地缺乏轻链。
[0149]
本发明提供il27rα结合分子，其包含相对于seq id no:2-25的任一个多肽具有至少75％、或80％、或90％、或95％、或98％、或99％、或100％同一性的多肽。
[0150]
本发明提供il27rα结合分子，其包含相对于seq id no:61-74的任一个多肽具有至少75％、或80％、或90％、或95％、或98％、或99％、或100％同一性的多肽。
[0151]
本发明提供包含如本文提供的表1的行中所述的cdr1、cdr2和cdr3的il27rα结合分子。在一些实施方式中，cdr1、cdr2和cdr3相对于本文提供的表1的行中所述的序列可以各自地、独立地包含至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的序列同一性，或具有0、1、2或3个氨基酸变化，任选保守的氨基酸变化。
[0152]
本发明提供包含如本文提供的表3的行中所述的cdr1、cdr2和cdr3的il27rα结合分子。在一些实施方式中，cdr1、cdr2和cdr3相对于本文提供的表3的行中所述的序列可以各自地、独立地包含至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的序列同一性，或具有0、1、2或3个氨基酸变化，任选保守的氨基酸变化。
[0153]
实验
[0154]
本发明的单域抗体通过用il27rα受体的胞外结构域免疫从骆驼获得。本发明的本发明的il27rαvhh分子基本上根据实施例的教导产生。简言之，在数周的时间内，通过皮下注射含有重组产生的融合蛋白的佐剂组合物，用人il27rα和小鼠il27rα的ecd依次免疫骆驼，所述融合蛋白包含il27rα的胞外结构域、人igg1铰链域和人igg1重链fc。免疫后，从适当大小的vhh-铰链-ch2-ch3物种的血液样品中提取的rna被转录以产生dna序列，其经消化以鉴定被分离的包含编码vhh结构域的核酸序列的约400bp片段。分离的序列用限制性内切酶消化，以便于插入噬菌体载体中，与编码his-标签的序列在框内，并转化到大肠杆菌中以生成噬菌体文库。对噬菌体文库进行多轮生物淘选(bio-panning)，以鉴定结合至il27rα的ecd的vhh(人或小鼠，视情况而定)。以96孔板形式分离单个噬菌体克隆用于周质提取物elisa(pe-elisa)，并通过比色测定确认选择性结合。分离并测序显示出与il27rα抗原特异性结合的il27rα结合分子，并分析序列以鉴定vhh序列、cdr和鉴定独特的vhh克隆型。如本文所用，术语“克隆型”是指来源于同一b细胞祖细胞的结合分子的集合，特别是属于同一种系家族、具有相同cdr3长度且在cdr3序列中具有70％或更高同源性的抗原结合分子集合。表1中提供了显示出与hil27rαecd抗原特异性结合的vhh分子(抗-人il27rαvhh)和从这些vhh分离的cdr。表3中提供了显示出与mil27rαecd抗原特异性结合的vhh分子(抗-小鼠il27rαvhh)和从这些vhh分离的cdr。表2和表4分别提供了编码表1和表3的vhh的核酸序列。
[0155]
为了更全面地表征结合特性并评估根据上述生成的vhh分子的结合亲和力，每个人vhh克隆型的代表性示例都经过表面等离子体共振分析，基本上根据本文实施例5的教导。这些spr研究的结果总结在下表6中。
[0156]
[0157][0158]
*当r
最大
》100时，缔合和离解动力学常数都可能被抑制。如果存在，这种效应很可能在动力学比率中被抵消，即亲和力常数。
[0159]
如表6所示的数据所示，上述il27rαvhh结合分子表现出特异性结合至抗原并提供了对il27rα抗原的一系列亲和力。
[0160]
在一些情况下，由于来自各种哺乳动物物种的il27rα受体的胞外结构域之间的序列或结构相似性，用来源于第一哺乳动物物种的il27rα的抗原(例如，hil27rα-ecd)进行免疫可以提供特异性结合一种或多种其他哺乳动物物种的il27rα受体的抗体。这种抗体被称为“交叉反应性的”。例如，用人源抗原(如hil27rα-ecd)免疫骆驼可能会产生与鼠和人受体交叉反应的抗体。对于来源于其他哺乳动物物种的受体的抗体交叉反应性的评估，本领域技术人员可以容易地通过，例如，使用与本文别处所述的结合亲和力和/或特异性结合的评估相关的方法测定，例如流式细胞术或spr。因此，术语“人il27rαvhh”或“hil27rαvhh”的使用仅表示用于免疫vhh来源的骆驼的il27rα抗原的种类是人il27rα(例如，hil27rα、ecd、seq id no:192)，但不应理解为限制vhh对其他哺乳动物物种的hil27rα分子的特异性结合亲和力。类似地，术语“小鼠il27rαvhh”或“mil27rα”的使用仅表示用于免疫vhh来源的骆驼的il27rα抗原的种类是鼠il27rα(例如，mil27rα、ecd、seq id no:194)，但不应理解为限制vhh对其他哺乳动物物种的il27rα分子的特异性结合亲和力。
[0161]
单域抗体的修饰型
[0162]
cdr移植sdab
[0163]
在一些实施方式中，本发明的结合il27rα的sdab是cdr移植的结合il27rα的sdab。如saerens等(2005)j.mol biol 352:597-607中所述，可将从抗体、重链抗体和衍生自其的sdab获得的cdr移植到替代框架上，以产生cdr移植的sdab。在一些实施方式中，本发明提供了一种il27rα结合分子，其包含cdr移植的结合il27rα的sdab，所述cdr移植的结合il27rα的sdab包括一组cdr1、2和3，如上表3的行所示。
[0164]
嵌合和人源化sdab
[0165]
任何框架区均可与本文所述的cdr一起使用。在一些实施方式中，结合il27rα的sdab是嵌合sdab，其中cdr来源于一种物种(例如，骆驼)，而框架和/或恒定区来源于另一物种(例如人或小鼠)。在特定实施方式中，框架区是人或人源化序列。因此，来源于结合il27rα的vhh的人源化的结合il27rα的sdab被认为在本发明的范围内。骆驼科单域抗体的人源化技术在本领域中是众所周知的。参见，例如vincke,等(2009)《骆驼类单域抗体人源化的一般策略和通用人源化纳米体支架的鉴定》(general strategy to humanize a camelid single-domain antibody and identification of a universal humanized nanobody scaffold)j.biol.chem.284(5)3273-3284。
[0166]
在一些实施方式中，本文所述的vhh可以是人源化的，以包含人框架区。可用于制
备人源化vhh的人种系的例子包括但不限于vh3-23(例如uniprot id:p01764)、vh3-74(例如uniprot id:a0a0b4j1x5)、vh3-66(例如uniprot id:a0a0c4dh42)、vh3-30(例如uniprot id:p01768)、vh3-11(例如uniprot id:p01762)和vh3-9(例如uniprot id:p01782)。
[0167]
包含其他试剂的il27rα结合分子
[0168]
在一些实施方式中，本发明的il27rα结合分子包含il27rα单域抗体(sdab)，其偶联到一种或多种其他生物活性剂，包括但不限于治疗剂、化学、光学或放射活性剂，包括它们的组合。至少一种此类生物、化学、光学或放射性活性剂的偶联赋予了结合il27rα的sdab额外的生物或化学特性，该组合提供了具有额外或替代用途的il27rα结合分子。
[0169]
例如，其他试剂可以是选自以下的一种或多种分子：免疫调节剂(例如，免疫原)；改善水溶性的分子(例如水溶性聚合物和亲水性分子如糖)；延长体内半衰期的运载体分子(例如peg化、fc融合或酰化)；产生用于检测试验的抗体(例如，表位标签)，提高纯化的容易性(例如，螯合肽，如多聚-his标签)；向特定细胞或组织类型提供选择性靶向il27rα结合分子的靶向结构域；治疗剂(例如包括小分子或多肽剂的治疗剂)；对光学或电磁传感器可见的试剂(例如放射性核苷酸或荧光试剂)。在一些实施方式中，接头是可裂解接头或不可裂解的接头。如本文所设想的在il27rα结合分子中使用可裂解接头有助于在il27rα结合分子内化时将治疗剂释放到胞内胞质中。在il27rα结合分子消化时,不可裂解的接头将允许释放，或者il27rα结合分子可以与不需要从抗体释放的试剂(例如成像剂)一起使用。
[0170]
在一些实施方式中，其中il27rα结合分子包含结合il27rα的sdab，其与经由接头连接的其他试剂稳定缔合。接头是il27rα结合分子的两个元件之间的共价连接(例如，结合hil27rα的vhh和peg聚合物)。接头可以是共价键、化学接头或肽接头。合适的接头包括“柔性接头”，其长度通常足以允许结合il27rα的sdab与一种或多种连接的试剂之间有一些移动。化学接头的实例包括芳基乙炔、含有2-10个单体单元的乙二醇寡聚物、二胺、二酸、氨基酸或其组合。在一些实施方式中，接头是肽接头。合适的肽接头可以容易地选择，可以是任何合适的长度，例如1个氨基酸(如gly)、2、3、4、5、6、7、8、9、10、10-20、20-30、30-50或超过50个氨基酸。合适的肽接头是本领域已知的，并且包括例如含有柔性氨基酸残基如甘氨酸和丝氨酸的肽接头。柔性接头的例子包括甘氨酸聚合物(g)n、甘氨酸-丝氨酸聚合物、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物和其他柔性接头。甘氨酸和甘氨酸-丝氨酸聚合物是相对非结构化的，因此可以用作组分之间的中性系连(tether)。柔性接头的其他例子包括甘氨酸聚合物(g)n、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物、甘氨酸-丝氨酸聚合物。甘氨酸和甘氨酸-丝氨酸聚合物是相对非结构化的，因此可以用作组分之间的中性系连(tether)。这些接头序列的多聚体(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、10-20、20-30或30-50)可以连接在一起，以提供柔性接头，可用于将异源氨基酸序列偶联至本文公开的结合il27rα的sdab。在一些实施方式中，接头具有式(gggs)n、(gggsg)n、(ggggs)n、(ggs)ng或(ggsg)n(seq id no:201)，其中n是选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的整数。
[0171]
免疫调节剂
[0172]
在一些实施方式中，本发明的il27rα结合分子操作性地连接至免疫调节剂(免疫偶联物)。可以偶联至本发明的结合hil27rα的sdab的免疫调节剂包括但不限于灭活病毒颗粒、灭活细菌毒素如白喉类毒素、破伤风、霍乱或白细胞毒素分子、灭活的细菌和树突细胞。这种免疫偶联物可用于促进针对il27rα或表达il27rα的细胞的免疫反应。
[0173]
flag标签
[0174]
在一些实施方式中，本发明的il27rα结合分子操作性地连接至抗原标签，例如flag序列。如本文所述，flag序列可被生物素化、高特异性的抗-flag抗体识别(参见例如，blanar等(1992)science 256:1014和leclair,等(1992)pnas-usa 89:8145)。在一些实施方式中，结合il27rα的sdab多肽进一步包括c-末端的c-myc表位标签。
[0175]
螯合肽
[0176]
在一些实施方式中，本发明的il27rα结合分子操作性地连接至一个或多个过渡金属螯合多肽序列。纳入这种过渡金属螯合结构域促进纯化固定化金属亲和层析(imac)，如smith等1986年2月11日授权的美国专利第4,569,794号所述。在本il27rα结合分子的实践中有用的过渡金属螯合多肽的例子描述于smith等(同上)以及dobeli等的1995年5月10日授权的美国专利第5,320,663号，其中的全部教导通过引用纳入此处。在本il27rα结合分子的实践中有用的具体过渡金属螯合多肽是包含3-6个连续的组氨酸残基的多肽，例如6-组氨酸(his)6肽，在本领域经常被称为“his-标签”。除了为重组蛋白提供纯化“柄”或促进spr传感器芯片上的固定化，这种h il27rα结合分子与螯合肽的偶联还有助于将过渡金属离子作为动力学惰性或动力学不稳定复合物靶向递送至表达il27rα的细胞，基本上根据anderson等的教导(1995年8月8日授权的美国专利号5,439,829和hale,j.e(1996)analytical biochemistry 231(1):46-49。过渡金属离子是报告分子，例如荧光化合物或放射性试剂，包括放射成像剂或治疗剂。
[0177]
运载体分子
[0178]
在一些实施方式中，本发明的结合il27rα的sdab可偶联至一个或多个运载体分子。运载体分子通常是大的、缓慢代谢的大分子，其提供体内稳定和/或延长的作用时间，以将这些分子与用于制备药物制剂的常规运载体分子区分开来，如下所述。可纳入il27rα结合分子的体内运载体的实例，但不限于：蛋白质(包括但不限于人血清白蛋白)；脂肪酸(酰化)；多糖(包括但不限于(n-和o-连接的)糖、琼脂糖(sepharose)、琼脂糖(agarose)、纤维素或纤维素)；多肽氨基酸共聚物；，酰化，或多聚唾液酸化、聚乙二醇(peg)聚合物。
[0179]
水溶性聚合物
[0180]
在一些实施方式中，结合il27rα的sdab偶联至一个或多个水溶性聚合物。在本il27rα结合分子实践中有用的水溶性聚合物的例子包括聚乙二醇(peg)、聚丙二醇(ppg)、多糖(聚乙烯吡咯烷酮、乙二醇和丙二醇的共聚物、聚(氧乙基化多元醇)、聚烯烃醇(polyolefinic alcohol)、多糖、聚-α-羟基酸、聚乙烯醇(pva)、聚磷腈、聚噁唑啉(polyoxazoline)(poz)、聚(n-丙烯酰吗啉)，或其组合。
[0181]
聚乙二醇
[0182]
在一个实施方式中，运载体分子是聚乙二醇(“peg”)聚合物。peg聚合物与蛋白质的偶联(peg化)是延长生物制剂血清半衰期的一种成熟方法。peg化的多肽还可以称为单聚乙二醇化、二聚乙二醇化、三聚乙二醇化(等)，以表示分别包含附接至多肽的一个、两个、三个(或更多)peg部分的多肽。在一些实施方式中，peg可以直接地共价附接至sdab(例如，通过赖氨酸侧链、半胱氨酸的巯基或n-末端胺)或任选地在peg和sdab之间采用接头。在一些实施方式中，il27rα结合分子包含多于一个peg分子，每个peg分子附接至不同的氨基酸残基上。在一些实施方式中，sdab可以通过将非天然氨基酸与非天然存在的氨基酸侧链纳入
来修饰，以促进位点特异性peg化。在其他实施方式中，半胱氨酸残基可以在sdab内的一个或多个位置被取代，以促进经由半胱氨酸巯基侧链的位点特异性peg化。
[0183]
在某些情况下，本发明的il27rα结合分子具有n-末端谷氨酰胺(“1q”)残基。已观察到n-末端谷氨酰胺残基在生理条件下或接近生理条件下自发环化形成焦谷氨酸(pe)。(参见例如，liu,等(2011)j.biol.chem.286(13):11211
–
11217)。在一些实施方式中，焦谷氨酸的形成使n-末端peg偶联复杂化，特别是当醛化学用于n-末端peg化时。因此，当peg化本发明的il27rα结合分子时，特别是当使用醛化学时，在1位(例如，1q)具有氨基酸的il27rα结合分子在1位被替代性氨基酸取代或在1位缺失(例如，des-1q)。在一些实施方式中，本发明的il27rα结合分子包含选自q1e和q1d组的氨基酸取代。
[0184]
适合偶联至多肽序列的peg通常在室温溶于水，并且具有通式
[0185]
r(o-ch
2-ch2)no-r,
[0186]
其中r是氢或保护基团，例如烷基或烷醇基，其中n是1-1000的整数。当r是保护基团时，其通常具有1-8个碳。peg可以是直链或支链的。本发明考虑了支化peg衍生物，“星形-peg(star-peg)”和多臂peg。
[0187]
il27rα结合分子中使用的peg的分子量不限于任何特定范围。il27rα结合分子的peg组分可以具有大于约5kda、大于约10kda、大于约15kda、大于约20kda、大于约30kda、大于约40kda、或大于约50kda的分子量。在一些实施方式中，分子量为约5kda至约10kda、约5kda至约15kda、约5kda至约20kda、约10kda至约15kda、约10kda至约20kda、约10kda至约25kda或约10kda至约30kda。直链或支链peg分子的分子量从约2,000至约80,000道尔顿，或者约2,000至约70,000道尔顿，或者约5,000至约50,000道尔顿，或者约10,000至约50,000道尔顿，或者约20,000至约50,000道尔顿，或者约30,000至约50,000道尔顿，或者约20,000至约40,000道尔顿，或者约30,000至约40,000道尔顿。在il27rα结合分子的一个实施方式中，peg为包含两个20kd臂的40kd支链peg。
[0188]
本发明还考虑了il27rα结合分子，其包含大于一个peg部分，其中peg具有不同的大小值，因此在特定的比率下存在多种不同的peg。例如，在peg化il27rα结合分子的制备中，一些组合物包含单、二、三和四peg化sdab偶联物的混合物。在一些组合物中，单-peg化物质的百分比为18-25％，双-peg化物质的百分比为50-66％，三聚乙二醇化物质的百分比为12-16％，四聚乙二醇化物质的百分比多至5％。这种复合组合物可以通过本领域已知的反应条件和纯化方法生产。层析可用于分辨偶联物的馏分，然后鉴定包含具有例如附接所需数量的peg的偶联物的馏分，从未修饰的蛋白质序列和具有附接其他数量peg的偶联物中纯化出来。
[0189]
peg化经常发生在多肽n-末端的α-氨基基团，赖氨酸残基侧链上的ε氨基基团和组氨酸残基侧链上的咪唑基团。由于大多数重组多肽具有单个α基团和若干ε基团和咪唑基团，根据接头的化学性质，可以产生许多位置异构体。
[0190]
两种广泛使用的第一代激活的单甲氧基peg(mpeg)是琥珀酰亚胺基碳酸酯peg(sc-peg；参见，例如，zalipsky,等(1992)biotehnol.appl.biochem15:100-114)和苯并三唑碳酸酯peg(btc-peg；参见，例如dolence,等美国专利号5,650,234)，其优选与赖氨酸残基反应以形成氨基甲酸酯连接，但也已知与组氨酸和酪氨酸残基反应。使用peg-醛接头通过还原性胺化靶向多肽的n-末端单个位点。
[0191]
peg可以通过末端反应性基团(“间隔子")结合至本发明的il27rα结合分子，该基团在一个或多个多肽序列的游离氨基或羧基与聚乙二醇之间介导结合。具有可结合至游离氨基基团的间隔子的peg包括n-羟基琥珀酰亚胺聚乙二醇，它可以通过用n-羟基琥珀酰亚胺激活聚乙二醇的琥珀酸酯来制备。
[0192]
在一些实施方式中，通过纳入带有独特侧链的非天然氨基酸以促进特定位点的peg化来促进sdab的peg化。将非天然氨基酸纳入多肽以提供功能部分以实现此类多肽的位点特异性peg化是本领域中已知的。参见，例如ptacin,等,(pct国际申请号pct/us2018/045257，2018年8月3日提交并公开于2019年2月7日，国际公开号wo 2019/028419al。
[0193]
peg化il27rα结合分子的peg部分可以是直链的或支链的。本发明考虑了支化peg衍生物，“星形-peg(star-peg)”和多臂peg。本发明的实践中有用的具体实施方式peg包括10kda直链peg-醛(例如，me-100al、nof美国公司(nof america corporation)，北百老汇(one north broadway)，纽约州白原市(white plains,ny)10601usa)、10kda直链peg-nhs酯(例如，me-100cs,me-100as,me-100gs,me-100hs,nof)、20kda直链peg-醛(例如me-200al,nof、20kda直链peg-nhs酯(例如，me-200cs,me-200as,me-200gs,me-200hs,nof)、20kda 2-臂支链peg-醛，该20kda peg-醛，其包含两个10kda直链peg分子(例如，gl2-200al3,nof)、20kda 2-臂支链peg-nhs酯，该20kda peg-nhs酯，其包含两个10kda直链peg分子(例如，gl2-200ts,gl200gs2,nof)、40kda 2-臂支链peg-醛，该40kda peg-醛，其包含两个20kda直链peg分子(例如，gl2-400al3)、40kda 2-臂支链peg-nhs酯，该40kda peg-nhs酯，其包含两个20kda直链peg分子(例如，gl2-400al3,gl2-400gs2,nof)、直链30kda peg-醛(例如，me-300al)和直链30kda peg-nhs酯。
[0194]
fc融合体
[0195]
在一些实施方式中，运载体分子是fc分子或其单体亚基。在一些实施方式中，二聚体fc分子可以被工程改造为具有“杵臼(knob-into-hole)修饰”。杵臼修饰更全面地描述于ridgway,等(1996)《蛋白质工程改造》(protein engineering)9(7):617-621和1998年3月24日授权的美国专利号5,731,168、2010年1月5日授权的美国专利号7,642,228、2010年4月13日授权的美国专利号7,695,936以及2012年7月10日授权的美国专利号8,216,805。杵臼修饰是指在ch3结构域中两个免疫球蛋白重链之间界面的修饰，其中：i)在第一条重链的ch3结构域中，氨基酸残基被具有较大侧链的氨基酸残基(例如，酪氨酸或色氨酸)替代，从表面产生突起(“杵”)和ii)在第二条重链的ch3结构域中，氨基酸残基被具有较小侧链的氨基酸残基(如丙氨酸或苏氨酸)替代，从而在第二ch3结构域的界面内产生空腔(“臼”)，其中第一ch3结构域的突出侧链(“杵”)被第二ch3结构域中的空腔接收。在一个实施方式中，“杵臼修饰”包括抗体重链之一中的氨基酸取代t366w和任选地氨基酸取代s354c，和另一个抗体重链中的氨基酸取代t366s、l368a、y407v和任选地y349c。此外，fc结构域可以通过在一
条链上的s354和第二条链上的y349位置引入半胱氨酸残基进行修饰，从而在fc区的两个抗体重链之间产生稳定的二硫键(carter,等(2001)immunol methods 248,7-15)。杵臼形式用于促进在具有“杵”修饰的第一fc单体上第一多肽(例如结合il27rα的sdab)的表达和在具有“臼”修饰的第二fc单体上的第二多肽的表达，以促进异二聚体多肽偶联物的表达。
[0196]
靶向结构域
[0197]
在一些实施方式中，il27rα结合分子被提供为具有多肽序列(“靶向结构域”)的多价(例如，二价)融合蛋白的组分，以促进选择性地结合到特定的表达特异性结合至这种靶向域的细胞表面分子的细胞类型或组织，任选地在结合il27rα的sdab序列和融合蛋白的靶向结构域序列之间纳入接头分子。
[0198]
在il27rα结合分子的一些实施方式中，il27rα结合分子可通过将靶向结构域纳入到il27rα结合分子的结构中而靶向特定细胞类型细胞。如本文所用，术语靶向结构域是指特异性结合至靶细胞表面上表达的分子的部分。靶向结构域可以是与靶细胞表面上表达的一种或多种细胞表面分子(例如t细胞受体)特异性结合的任何部分。在一些实施方式中，靶细胞是t细胞。在一些实施方式中，靶细胞是il27rα+t细胞。
[0199]
在一些实施方式中，靶向结构域是受体的配体。在一些实施方式中，靶向结构域是t细胞表面上表达的受体的配体。在一些实施方式中，配体是细胞因子。在一些实施方式中，细胞因子包括但不限于由白细胞介素、干扰素及其功能衍生物组成的组。在一些实施方式中，细胞因子包括但不限于下组：il2、il3、il4、il7、il9、il12、il15、il18、il21、il22、il23、il27、il28、il34及其修饰形式或片段，其结合至t细胞表面上表达的它们的同源配体。在一些实施方式中，细胞因子包括但不限于下组：干扰素α、干扰素a2b、干扰素γ或干扰素λ及其修饰形式或片段，其结合至t细胞表面上表达的它们的同源配体。
[0200]
另一方面，本发明提供了多价结合分子，所述多价结合分子包括：(a)il27rα结合分子和(b)特异性结合第二细胞表面分子的胞外结构域的第二结合分子，其中il27rα结合分子和第二结合分子任选地通过化学或多肽接头操作性地连接。在一些实施方式中，本发明的il27rα结合分子可用于制备gonzalez等在2018年10月4日公布为wo 2018/182935 a1的pct/us2018/021301中描述的多价结合分子。在一些方面，第二结合分子特异性结合到以下胞外结构域：(i)激活细胞中jak/stat通路的细胞因子受体的成分；(ii)受体酪氨酸激酶；或(iii)tnfr超家族成员。在一些实施方式中，第二表面分子是酪氨酸激酶，选自：egfr、erbb2、erbb3、erbb4、insr、igf1r、insrr、pdgfrα、pdgfrβ、csf1r/fms、ckit、flt-3/flk2、vegfr1、vegfr2、vegfr3、fgfr1、fgfr2、fgfr3、fgfr4、ptk7/cck4、trka、trkb、trkc、ror1、ror2、musk、met、ron、axl、mer、tyro3、tie1、tie2、epha1-8、epha10、ephb1-4、ephb6、ret、ryk、ddr1、ddr2、ros、lmr1、lmr2、lmr3、alk、ltk、surtk106/styk1。在一些实施方式中，第二表面分子是tnfr超家族成员，选自：tnfr1(tnfrsf1a)、tnfr2(tnfrsf1b；tnfrsf2)、41-bb(tnfrsf9)；aitr(tnfrsf18)；bcma(tnfrsf17)、cd27(tnfrsf7)、cd30(tnfrsf8)、cd40(tnfrsf5)、死亡受体1(tnfrsf10c)、死亡受体-3(tnfrsf25)、死亡受体4(tnfrsf10a)、死亡受体5(tnfrsf10b)、死亡受体-6(tnfrsf21)、诱饵受体-3(tnfrsf6b)、诱饵受体2(tnfrsf10d)、edar、fas(tnfrsf6)、hvem(tnfrsf14)、ltbr(tnfrsf3)、ox40(tnfrsf4)、rank(tnfrsf11a)、taci(tnfrsf13b)、troy(tnfrsf19)、xedar(tnfrsf27)、骨保护素(tnfrsf11b)、tweak受体(tnfrsf12a)、baff受体(tnfrsf13c)、ngf受体(tnfrsf16)。
[0201]
在一些实施方式中，靶向结构域是特异性结合至与肿瘤细胞相关联的细胞表面分子(例如，肿瘤细胞受体的同源配体)的多肽，其选自下组：gd2、bcma、cd19、cd33、cd38、cd70、gd2、il3ra2、cd19、间皮素、her2、epcam、muc1、ror1、cd133、cea、egrfrviii、psca、gpc3、pan-erbb和fap。
[0202]
在一些实施方式中，il27rα结合分子的靶向结构域是抗体(如上文所定义，包括例如vhh、scfv等)。可以纳入作为il27rα0结合分子的靶向结构域的抗体的例子包括但不限于下组：抗-gd2抗体、抗-bcma抗体、抗-cd19抗体、抗-cd33抗体、抗-cd38抗体、抗-cd70抗体、抗-gd2抗体和il3ra2抗体、抗-cd19抗体、抗-间皮素抗体、抗-her2抗体、抗-epcam抗体、抗-muc1抗体、抗-ror1抗体、抗-cd133抗体、抗-cea抗体、抗-psma抗体、抗-egrfrviii抗体、抗-psca抗体、抗-gpc3抗体、抗-pan-erbb抗体和抗-fap抗体。
[0203]
抗体或其抗原结合片段也可与另一抗体连接以形成例如双特异性或多特异性抗体
[0204]
标记物
[0205]
在一些实施方式中，本发明的il27rα结合分子操作性地连接至标记物。在一些实施方式中，掺入标记物以便于用作成像剂、诊断剂或用于细胞分选程序。术语标记物包括但不限于荧光标记物、生物活性酶标记物、放射性同位素(例如放射性离子)、核磁共振活性标记物、发光标记物或磁性化合物。在一个实施方式中，结合il27rα的sdab(例如结合il27rα的vhh)分子与成像标记物稳定缔合(例如共价、配位共价)。术语成像标记物用于描述多种化合物中的任何一种，其特征在于有助于使用诊断程序鉴定、追踪和/或定位结合il27rα的sdab(或其代谢物)。成像标记物的例子包括但不限于荧光化合物、放射性化合物和对成像方法不透明的化合物(例如，x射线、超声)。用作成像标记物的放射性化合物的例子包括但不限于：锝-99m(
99m
tc)、铟-111(
111
in)、碘-131(
131
i)、碘-123(
123
i)、碘-125(
125
i)、镓-67(
67
ga)，和镥-177(
177
lu)、磷(
32
p)、碳(
14
c)、氚(3h)、钇(
90
y)、锕(
225
ac)、砹(
211
at)、铼(
186
re)、铋(
212
bi或
213
bi)和铑(
188
rh)。
[0206]
治疗剂
[0207]
在一些实施方式中，本发明的il27rα结合分子操作性地连接至治疗剂。治疗剂的实例包括治疗性小分子(例如化疗剂)或生物治疗剂，包括抗体，细胞毒性或细胞抑制化合物，放射性同位素，植物、真菌或细菌来源的分子，或生物蛋白(例如，蛋白毒素)或颗粒(例如，纳米颗粒或重组病毒颗粒，例如，通过病毒包被蛋白)，治疗性抗体，化疗剂，如本文更充分描述的。
[0208]
在一些实施方式中，可纳入本发明的il27rα结合分子的治疗剂是短程辐射发射器，包括，例如，短程高能a发射器。此类放射性同位素的实例包括α发射器、β发射器、γ发射器或β/γ发射器。可用作治疗剂的放射性同位素包括：钇90(
90
y)、镥-177(
177
lu)、锕-225(
225
ac)、砹-211(
211
at)、铼-186(
186
re)、铋-212(
212
bi)、铋-213(
213
bi)和铑-188(
188
rh)。
[0209]
在一些实施方式中，本发明的il27rα结合分子操作性地连接至细胞毒性剂(或其衍生物)，例如美登醇(maytansinol)或dm1美登素)、紫杉烷或卡奇霉素(calicheamicin)、假单胞菌外毒素a、脱三角梅蛋白(debouganin)、蓖麻毒素、白喉毒素、鹅膏毒素，例如α-鹅膏蕈碱、皂素、美登素类、美登素、奥瑞他汀、蒽环类药物、卡奇霉素、伊立替康、sn-38、杜卡霉素(duocarmycin)、吡咯并苯并二氮杂(pyrrolobenzodiazepine)、吡咯并苯并二氮杂
二聚体、吲哚并苯并二氮杂和吲哚并苯并二氮杂二聚体，或其变体)。
[0210]
il27rα结合分子的合成：
[0211]
在一些实施方式中，本发明的il27rα结合分子是多肽。然而，在一些实施方式中，仅il27rα结合分子的部分是多肽，例如，其中il27rα结合分子包含非肽基结构域(例如，peg il27rα结合sdab偶联物、放射性核苷酸il27rα结合sdab偶联物或小分子il27rα结合sdab偶联物)。以下提供了本发明的il27rα结合分子的多肽部分(结构域)的固相和重组合成的指导。在只有il27rα结合分子的部分是多肽的那些实施方式中，应理解，il27rα结合分子的一个或多个肽基结构域是该过程中的中间体，其可以经历进一步的处理以完成所需il27rα结合分子的合成。本发明的il27rα结合分子的多肽结构域可以通过用于构建多肽的常规方法生产，包括重组或固相合成，如下文更详细地描述。
[0212]
化学合成
[0213]
除了通过已经通过重组分子生物技术改变的核酸分子的表达产生突变多肽之外，il27rα结合分子的多肽结构域可以化学合成。化学合成多肽可以由本领域技术人员常规地生产。化学合成包括通过化学方式进行的，表现出所述特性的il27rα结合分子的多肽结构域的肽的直接合成。该方法可以在促进特定分子(例如peg)的连接的期望位置纳入天然和非天然氨基酸。
[0214]
在一些实施方式中，本发明的il27rα结合分子的多肽结构域可以通过化学合成制备。il27rα结合分子的多肽结构域的化学合成可以通过液相或固相进行。固相肽合成(spps)允许纳入非天然氨基酸和/或肽/蛋白质骨架修饰。可用于合成本发明的il27rα结合分子的多肽结构域的spps的多种形式是本领域已知的(例如，ganesan a.(2006)mini rev.med.chem.6:3-10；和camarero等,(2005)protein pept lett.12:723-8)。在化学合成的过程中，α官能团和任何反应性侧链可以用酸不稳定或碱不稳定基团保护，其在供酰胺键连接的条件下是稳定的，但可易于在不损害已形成的肽链的情况下被裂解。
[0215]
在固相合成中，n-末端或c-末端氨基酸可以被偶联至合适的支持材料。合适的支持材料是那些对合成过程中逐步缩合和裂解反应的试剂和反应条件惰性的材料，并且不溶解于正在使用的反应介质。市售可得的支持材料的例子包括用活性基团和/或聚乙二醇修饰的苯乙烯/二乙烯基苯共聚物；氯甲基化的苯乙烯/二乙烯基苯共聚物；羟甲基化或氨基甲基化的苯乙烯/二乙烯基苯共聚物等。被保护氨基酸的连续偶联可以根据肽合成中的常规方法进行，通常在自动肽合成仪中进行。
[0216]
在固相合成结束时，从支持材料上将肽裂解下来，同时裂解侧链保护基团。所获得的肽可以通过多种层析方法纯化，包括但不限于疏水吸附层析、离子交换层析、分配层析、高压液相色谱(hplc)和反相hplc。
[0217]
重组生产
[0218]
或者，通过重组dna技术生产本发明的il27rα结合分子的多肽结构域。在多肽的重组生产的典型实践中，编码所需多肽的核酸序列被纳入适合用于将要完成表达的宿主细胞的表达载体中，核酸序列被操作性地连接至该载体编码的一个或多个表达控制序列，并在目标宿主细胞中发挥功能。如果在多肽中纳入分泌前导序列(信号肽)，重组蛋白可以通过破坏宿主细胞或从细胞介质中回收。重组蛋白可以被纯化和浓缩用于进一步用途，包括纳入。
[0219]
编码il27rα结合分子的核酸序列的合成
[0220]
在一些实施方式中，il27rα结合分子的多肽结构域通过重组方法生产，使用编码il27rα结合分子的多肽结构域(或包含il27rα结合分子的多肽结构域的融合蛋白)的核酸序列。编码所需il27rα结合分子的多肽结构域的核酸序列可以使用寡核苷酸合成仪通过化学方式合成。
[0221]
核酸序列不限于编码多肽的序列；也可以包括位于编码序列(例如，il27rα结合分子的多肽结构域的编码序列)的上游或下游的部分或全部非编码序列。分子生物学的本领域技术人员熟知用于分离核酸分子的常规操作。例如，他们可以用限制性核酸内切酶处理基因组dna或通过进行聚合酶链式反应(pcr)产生。如果核酸分子是核糖核酸(rna)，分子可以，例如，通过体外转录产生。
[0222]
编码il27rα结合分子的多肽结构域的核酸分子(及其融合体)可以包含天然存在的序列或不同于天然存在序列的序列，但由于遗传密码的简并性，其编码相同的多肽。这些核酸分子可以由以下组成：rna或dna(例如基因组dna、cdna或合成dna，例如通过基于亚磷酰胺的合成(phosphoramidite-based synthesis)产生的)或这些类型核酸内核苷酸的组合或修饰。此外，核酸分子可以是双链的或单链的(即正义链或反义链)。
[0223]
编码il27rα结合分子的多肽结构域的核酸序列可以获取自提供定制核酸序列合成的多种商业来源。本发明的human il27rα结合分子的氨基酸序列变体是基于本领域众所周知的遗传密码将合适的核苷酸变化引入编码序列来制备的。这种变体表示所指出的残基的插入、取代和/或特异性缺失。插入、取代和/或特异性缺失的任何组合都可以得到最终的构建体，只要最终的构建体拥有本文定义的所需生物活性。
[0224]
构建编码il27rα结合分子的多肽结构域的dna序列和在合适的转化的宿主中表达这些序列的方法包括但不限于使用pcr-辅助诱变技术。也可以用标准重组技术向il27rα结合分子的多肽结构域中制造由氨基酸残基缺失或添加组成的突变。如果缺失或添加，编码il27rα结合分子的多肽结构域的核酸分子任选地用合适的限制性核酸内切酶消化。所得片段可以直接表达，或通过，例如，连接至第二片段来进一步操作。如果核酸分子的两个末端包含相互重叠的互补核苷酸，则可以促进连接，但也可以连接平末端片段。pcr产生的核酸也可以用于产生多种突变序列。
[0225]
本发明的il27rα结合分子的多肽结构域不仅可以直接重组生产，而且可以与异源多肽(例如信号序列或其他在成熟il27rα结合分子的n-末端或c-末端具有特定裂解位点的多肽)的融合多肽形式生产。通常，信号序列可以是载体的组分，也可以是插入到载体中的编码序列的部分。所选择的异源信号序列优选是被宿主细胞识别和处理(即被信号肽酶裂解)的序列。在一些实施方式中，信号序列是与il27rα结合分子天然相关联的信号序列(即人il27rα信号序列)。信号序列的包含取决于其是否需要从制备其的重组细胞分泌il27rα结合分子。如果所选细胞是原核细胞，通常优选dna序列不编码信号序列。如果所选细胞是真核细胞，通常优选编码信号序列，最优选使用野生型il-2信号序列。或者，异源哺乳动物信号序列也是合适的，例如来自相同或相关物种的分泌多肽的信号序列，以及病毒分泌前导序列，例如单纯疱疹gd信号。当重组宿主细胞是酵母细胞，例如酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)时，可以使用α交配因子分泌信号序列(alpha mating factor secretion signal sequence)以实现il27rα结合分子的胞外分泌，进入培养基，如描述于singh,美国
专利号7,198,919b1。
[0226]
如果要表达的il27rα结合分子的多肽结构域待以嵌合体(chimera)形式表达(例如包含il27rα结合分子和异源多肽序列的融合蛋白)，则嵌合蛋白可以由杂交核酸分子编码，其包含编码所有或部分il27rα结合分子的多肽结构域的第一序列和编码所有或部分异源多肽的第二序列。例如，本文所述的il27rα结合分子的多肽结构域可以被融合至六-组氨酸标签，以促进细菌表达的蛋白的纯化，或融合至六-组氨酸、血凝素或fc标签，以促进真核细胞中表达的蛋白的纯化。所谓第一和第二，不应理解为限制融合蛋白的元件取向，异源多肽可以被连接至il27rα结合分子的多肽结构域的n-末端和/或c-末端。例如，n-末端可以被连接至靶向结构域，c-末端连接至六-组氨酸标签纯化柄。
[0227]
要表达的il27rα结合分子的多肽结构域(或融合体/嵌合体)的完整氨基酸序列可以被用于构建回译基因(back-translated gene)。可以合成含有编码il27rα结合分子的多肽结构域的核苷酸序列的dna寡聚物。例如，可以合成编码部分所需多肽的一些小寡核苷酸，然后连接。单个的寡核苷酸通常包含5’或3’突出端用于互补组装。
[0228]
在一些实施方式中，编码il27rα结合分子的多肽结构域的核酸序列可以是“密码子优化”的以促进在特定宿主细胞类型中的表达。在多种表达系统，包括哺乳动物、酵母和细菌宿主细胞中密码子优化的技术是本领域众所周知的，且有在线工具以提供用于在多种宿主细胞类型中表达的密码子优化的序列。参见例如，hawash,等(2017)9:46-53和mauro和chappell在《哺乳动物细胞中重组蛋白表达：方法和方案》(recombinant protein expression in mammalian cells: methods and protocols)，david hacker编(胡马纳出版社(human press)纽约)。此外，有多种基于网络的在线软件可以免费使用，以协助制备密码子优化的核酸序列。
[0229]
表达载体
[0230]
组装(通过合成、定点诱变或另一方式)后，编码il27rα结合分子的多肽结构域的核酸序列将被插入表达载体。可以使用用于多种宿主细胞中的多种表达载体，通常是基于用于表达的宿主细胞选择。表达载体通常包括但不限于以下一个或多个：复制起点，一个或多个标志物基因，增强子元件、启动子和转录终止序列。载体包括病毒载体、质粒载体、整合载体等。质粒是非病毒载体的例子。为了促进重组多肽的高效表达，要表达的编码多肽序列的核酸序列被操作性地连接至在所选的表达宿主中发挥功能的转录和翻译调控序列。
[0231]
表达载体通常包含选择基因，也被称为可选择标志物。该基因编码转化的宿主细胞在选择性培养基中生长的存活或生长所必需的蛋白质。未用含有选择基因的载体转化的宿主细胞无法在培养基中存活。典型的选择基因编码蛋白质，其将(a)赋予对抗生素或其他毒素例如氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四环素的抗性；(b)弥补营养缺陷型缺陷；或(c)提供无法从复合培养基中获得的关键营养素。
[0232]
用于本发明的il27rα结合分子的多肽结构域的表达载体包含调节序列，其被宿主生物体识别且操作性地连接至编码il27rα结合分子的多肽结构域的核酸序列。术语“调控序列”、“调节序列”或“表达控制序列”在本文中可互换使用，指启动子、增强子和其他表达控制元件(例如聚腺苷酸化信号)。参见，例如goeddel(1990)于《基因表达技术：酶学方法》(gene expression technology:methods in enzymology)185(学术出版社(academic press),美国加利福尼亚州圣地亚哥。调节序列包括在许多类型的宿主细胞中引导组成型
表达的核苷酸序列，和仅在某些宿主细胞中引导表达的核苷酸序列(例如，组织特异性调节序列)。本领域技术人员将理解，表达载体的设计可能取决于例如要转化的宿主细胞的选择，所需蛋白质的表达水平等因素。在表达控制序列的选择中，本领域技术人员理解将要考虑多种因素。这些包括，例如，序列的相对强度、它的可控性，以及它与编码主体il27rα结合分子的实际dna序列的相容性，特别是关于可能的二级结构。
[0233]
在一些实施方式中，调节序列是启动子，其选择基于，例如，寻求在其中表达的细胞类型。启动子是位于结构基因起始密码子上游(5')的非翻译序列(通常在约100到1000bp内)，其控制与其操作性地连接的特定核酸序列的转录和翻译。这种启动子通常分为两类，诱导型的和组成型的。诱导型启动子是对培养条件的某些变化(如营养物的存在或不存在或温度的变化)反应，从其控制下的dna启动增加转录水平的启动子。多种潜在的宿主细胞所识别的大量启动子是众所周知的。
[0234]
在细菌中可以使用t7启动子，在昆虫细胞中可以使用多角体蛋白启动子，在哺乳动物细胞中可以使用巨细胞病毒或金属硫蛋白(metallothionein)启动子。另外，在高等的真核细胞的情况下广泛使用组织特异性和细胞特异性启动子。这些启动子以其在给定的体内组织或细胞类型中核酸分子的指导表达的能力而命名。技术人员知晓许多可用于核酸的指导表达的启动子和其他调节元件。
[0235]
哺乳动物宿主细胞中载体的转录可以被控制，由，例如，从病毒基因组中获得的启动子，例如多瘤病毒、牛痘病毒、腺病毒(如人腺病毒血清型5)、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒(如鼠干细胞病毒)、乙肝病毒和最优选的猿猴病毒40(sv40)，来自异源哺乳动物的启动子，例如，肌动蛋白启动子、pgk(磷酸甘油酸激酶)或免疫球蛋白启动子，来自热休克启动子，只要这些启动子与宿主细胞系统相容。sv40病毒的早期和晚期启动子可方便地以sv40限制性片段形式获得，该片段也含有sv40病毒的复制起点。
[0236]
高等真核生物的转录通常通过在载体中插入增强子序列来增加。增强子是dna的顺式作用元件，通常约为10至300bp，它作用于启动子以增加其转录。增强子的取向和位置相对独立，在转录单元的5'和3'处、内含子内以及编码序列本身内都有发现。现在已经从哺乳动物基因(珠蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰岛素)中得知了许多增强子序列。然而，通常人们会使用来自真核细胞病毒的增强子。示例包括复制起点后侧的sv40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、复制起点后侧的多瘤增强子和腺病毒增强子。增强子可以被剪接到表达载体中编码序列的5'或3'的位置，但优选是位于离启动子5'的位置。用于真核宿主细胞的表达载体还将包含用于终止转录和用于稳定化mrna所必需的序列。此类序列通常可以从真核生物或病毒dna或cdna的5'，偶尔3'非翻译区获得。含有一个或多个上述组分的合适载体的构建采用了标准技术。
[0237]
除了促进插入核酸分子的转录的序列之外，载体可以包含复制起点和其他编码可选择标志物的基因。例如，新霉素-抗性(neor)基因赋予其表达细胞g418抗性，因而允许对转染的细胞进行表型选择。标志物或报告基因的其他例子包括β-内酰胺酶、氯霉素乙酰转移酶(cat)、腺苷脱氨酶(ada)、二氢叶酸还原酶(dhfr)、潮霉素-b-磷酸转移酶(hph)、胸苷激酶(tk)、lacz(编码β-半乳糖苷酶)和黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(xgprt)。本领域技术人员可以容易地确定给定的调节元件或可选择标志物适合或不适合用于特定表达环境。表达载体的正确组装可以通过核酸测序、限制性图谱和在合适宿主中生物活性多肽的表达来
thr(n-x-t)的n-连接的糖基化基序，其中x是除脯氨酸之外的任何氨基酸。在这种情况下，期望通过修改n-连接的糖基化基序的序列以防止糖基化来消除这种n-连接的糖化基序。在一些实施方式中，asn-x-ser(n-x-s)n-连接的糖基化基序的消除可以通过在asn-x-ser(n-x-s)n-连接的糖基化基序的asn(n)残基和/或ser(s)残基掺入保守氨基酸取代来实现。在一些实施方式中，asn-x-thr(n-x-t)n-连接的糖基化基序的消除可以通过在asn-x-thr(n-x-t)n-连接的糖基化基序的asn(n)残基和/或thr(t)残基掺入保守氨基酸取代来实现。在一些实施方式中，消除as原核宿主细胞不提供重组蛋白糖基化的机制，当使用原核表达系统产生重组的交叉重组(crissrecombinant)结合il27rα的sdab时，可以避免对序列进行修饰以消除n-连接的糖基化位点。
[0245]
关于用于原核和真核细胞的其他表达系统，参见sambrook等(1989)《分子克隆：实验室手册》(molecular cloning:a laboratory manual)(第2版,冷泉港实验室出版社,纽约州普莱恩维尤)的第16和17章。参见，goeddel(1990)于《基因表达技术：酶学方法》(gene expression technology:methods in enzymology)185(学术出版社，加利福尼亚州圣地亚哥)。
[0246]
转染
[0247]
该表达构建体可以被引入宿主细胞以从而生产本文公开的重组的il27rα结合分子的多肽结构域，或以生产其生物学活性突变蛋白。载体dna可以通过常规转化或转染技术被引入原核或真核细胞。关于用于转化或转染宿主细胞的合适的方法可以在sambrook等(1989)《分子克隆：实验室手册》(molecular cloning:a laboratory manual)(第2版,冷泉港实验室出版社,纽约州普莱恩维尤)中和其他标准分子生物学实验手册中找到。
[0248]
为了促进目标细胞的转染，可以在有利于摄取非病毒载体的条件下使目标细胞直接暴露于非病毒载体。促进哺乳动物细胞摄取外源核酸的条件的例子在本领域是众所周知的，包括但不限于化学手段(例如赛默飞世尔科技(thermo-fisher scientific))，高盐和磁场(电穿孔)。
[0249]
细胞培养
[0250]
细胞可以在被改良为适合用于诱导启动子、选择转化子或扩增编码所需序列的基因的常规营养培养基中培养。哺乳动物宿主细胞可以在多种培养基中培养。市售可得的培养基如汉姆氏f10(ham's f10)(西格玛(sigma))、最小必需培养基((mem)，西格玛)、rpmi 1640(西格玛)和达氏改良的伊氏培养基((dmem)，西格玛)都适合培养宿主细胞。任何这些培养基可根据需要补充激素和/或其他生长因子(例如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐类(如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂(如hepes)、核苷(如腺苷和胸苷)、抗生素、微量元素和葡萄糖或等同的能量来源。任何其他必需的补充剂也可以以本领域技术人员已知的适当浓度包含在内。培养条件，如温度、ph值等，是以前用于选择表达的宿主细胞的条件，对普通技术人员来说是显而易见的。
[0251]
重组蛋白回收
[0252]
如果使用分泌前导序列，重组生产的il27rα结合多肽可以以分泌多肽形式从培养基中回收。或者，il27rα结合多肽也可以从宿主细胞裂解物中回收。蛋白酶抑制剂，例如苯基甲基磺酰氟(pmsf)可以在从细胞裂解物种回收阶段中使用，以抑制纯化过程中的蛋白酶降解，并可包括抗生素以防止外源污染物的生长。
[0253]
纯化
[0254]
各种纯化步骤是本领域已知的，并且可以寻用，例如亲和层析。亲和层析利用了通常存在于生物大分子中的高度特异性结合位点，根据分子与特定配体结合的能力将其分离。共价键将配体附接至不溶性的多孔支持介质上，使配体明显地呈现在蛋白质样品上，从而利用一种分子种类的天然特异性结合，从混合物中分离和纯化第二种类。抗体通常用于亲和层析。也可以使用尺寸选择步骤，例如，凝胶过滤层析(也被称为尺寸排阻或分子筛层析)用于根据蛋白质的尺寸进行分离。在凝胶过滤中，蛋白质溶液通过由半透性多孔树脂填充的柱。半透性树脂具有孔径范围，决定了可以用该柱分离的蛋白质的大小。
[0255]
由转化的宿主生产的重组的il27rα结合分子的多肽结构域可以根据任何合适的方法纯化。il27rα结合分子可以从大肠杆菌中产生的包涵体中分离出来，或从生产特定il27rα结合分子的哺乳动物或酵母培养物的条件培养基中，使用阳离子交换、凝胶过滤和或反相液相色谱分离出来。
[0256]
重组多肽的基本纯化形式可以用，例如，如本文所述，作为治疗剂使用。
[0257]
根据上述产生的重组的il27rα结合分子的多肽结构域的生物活性可以使用本领域已知的过程通过il27rα结合确证，包括但不限于竞争elisa、放射性配体结合试验(例如，饱和结合、斯卡查德图(scatchard plot)、非线性曲线拟合程序和竞争结合试验)；非放射性配体结合试验(例如，荧光偏振(fluorescence polarization)(fp)、荧光共振能量转移(fret)和表面等离子体共振试验(参见，例如，drescher等,methods mol biol 493:323-343(2009)，使用商购自ge医疗生命科学公司(ge healthcare bio-sciences)的仪器，例如biacore 8+、biacore s200、biacore t200(ge healthcare bio-sciences,100results way,marlborough ma 01752))；液相配体结合试验(例如，实时聚合酶链式反应(rt-qpcr)和免疫沉淀)；和固相配体结合试验(例如，多孔板试验、珠上配体结合试验、柱上配体结合试验和过滤试验)。
[0258]
使用方法
[0259]
il27rα活性的抑制
[0260]
在一个实施方式中，本发明提供了通过给予对象足够干扰包含il27rα的受体活性的量的il27rα结合分子，调节表达il27rα细胞活性的方法。本发明还提供了一种调节混合细胞群中表达il27rα的细胞活性的方法，包括在体内和/或离体将所述细胞群与本发明的il27rα结合分子或复合物以足以干扰包含il27rα的受体的活性的量接触。
[0261]
il27rα+细胞的鉴定、分离、富集或耗竭
[0262]
在一个实施方式中，本发明提供了本发明的il27rα结合分子的使用方法，其可用于从包含il27rα+细胞的生物样品中分离、富集或耗竭il27rα+细胞的过程。生物样品可包括血液来源的细胞，例如pbmc，细胞培养来源或组织来源(脑或骨髓)的b细胞，t细胞。适用于il27rα+细胞的分离、富集或耗竭的过程包括离心、过滤、磁性细胞分选和荧光细胞分选，这些方法采用本领域公知的技术。本发明还提供了一种通过使用本文所述的il27rα结合分子，通过给予治疗有效量的富含或耗竭il27rα+细胞的细胞产物来治疗患有疾病、病症或病状的对象的方法。
[0263]
在一个实施方式中，分选程序采用包含荧光标记物的il27rα结合分子，用于facs分离或从样品中耗竭il27rα+细胞。荧光标记物可以直接(例如，任选地通过使用接头的化
学偶联)或间接(例如通过sdab的生物素化和生物素化抗体与链霉亲和素荧光色素偶联物的结合)附接到il27rα结合分子的sdab上。这种荧光标记的il27rα+细胞可以使用常规facs技术从混合细胞群中分离。
[0264]
在替代性实施方式中，选择程序采用本发明的il27rα结合分子(例如，结合il27rα的vhh)，其偶联至磁性颗粒，提供il27rα+细胞的磁性标记，用于磁性细胞分离程序。在一个实施方式中，所述方法包括：(a)将本发明的一种或多种il27rα结合分子(例如，结合il27rα的vhh)偶联至磁性颗粒；(b)通过使生物样品与一定量的与il27rα结合分子偶联的磁性颗粒接触来产生混合物；(c)经受磁场使得磁性标记的il27rα+细胞被保留；(d)从混合物中去除非磁性标记的细胞；以及(e)去除能够分离il27rα+细胞的磁场。
[0265]
细胞选择程序(例如facs或磁分离)产生两种产物：(a)il27rα+细胞耗竭的细胞群和(b)il27rα+细胞富集的细胞群。这些群体中的每一个都可以通过常规程序进行进一步处理，以鉴定在研究、诊断或临床应用中可能有用的特定il27rα+或il27rα-细胞亚群。例如，分离还表达cd4、cd8、cd19、cd25和cd62l中的一个或多个的特异性il27rα+t细胞亚群，通过facs或通过本领域公知的技术进行磁场分离，进一步使用分别特异性结合cd4、cd8、cd19、cd25和cd62l抗原的一种或多种抗体迭代。
[0266]
在一个实施方式中，其中il27rα结合分子可用于从包含表达il27rα细胞的生物样品中耗竭表达il27rα的细胞，这种外周血或髓样组织，其可任选地被进一步处理以，通过耗竭il27rα+细胞，从预分选的cd4+或cd8+细胞中分离人il27rαra+原初t细胞，或进一步分离il27rα+原初t细胞亚群，或从cd4+或cd8+细胞群中分离人il27rα+记忆t细胞。在一个实施方式中，il27rα结合分子提供了一种从生物样品中产生富集原初treg的细胞群的方法，该方法包括使用如上所述的本发明的il27rα结合分子耗竭il27rα+细胞，任选地还包括耗竭cd8+和/或cd19+细胞的步骤。对于特定的细胞类型，il27rα+耗竭的细胞群可以任选地在体外进一步扩增，以制备包含治疗有效量的il27rα+耗竭的细胞产物的细胞产物，所述细胞产物可以给予患有疾病、病症或病状的对象。富集il27rα+的细胞群可任选地在体外进一步扩增，以制备包含治疗有效量的il27rα+细胞的细胞产物。试剂盒
[0267]
本发明还考虑了包含il27rα结合分子的药物组合物的试剂盒。该试剂盒通常为容纳各种成分的物理结构形式，如下文所述，并可用于例如实施上述方法。本发明的试剂盒可以设计为适当维持其中所含组分的必要条件(例如，冷藏或冷冻)。试剂盒可进一步包含标签或包装插页，包括其中的组分的鉴定信息和使用说明。试剂盒中的各组分可以被封装在单独的容器中，所有的各种容器可以在一个单独包装中。标签或插页可以包括制造商信息，如批号和失效日期。标签或包装插页可以，例如，整合到容纳组分的物理结构中，分别地包含在物理结构中，或固定在试剂盒的组分上(例如，安瓿、注射器或小瓶)。标签或插页可以以物理形式或计算机可读介质提供。在一些实施方式中，实际说明书并不存在于试剂盒中，而是试剂盒提供了从远程获得说明书的方法，例如，通过互联网网站，包括通过提供符合政府法规(例如，hipaa)的密码(或可扫描的代码，如il27rα结合分子或包含试剂盒的容器上的条形码或qr码)的安全访问。
[0268]
实施例
[0269]
提供以下实施例的目的是向本领域普通技术人员完整地公开和描述如何制备和使用本il27rα结合分子，这些实施例不意在限制发明人认为的il27rα结合分子范围，也不
代表他们认为下述进行的实验是所进行的所有的实验。应当理解的是，并不一定以现在时书写示例性描述，而是可以进行这些描述以生成如本文所述的数据等。努力保证所用数值(如量、温度等)的准确性，但应允许一些实验误差和偏差。所采用的具体描述的程序的变化对于本领域的个人或技术人员来说可能是显而易见的，并且期望本领域技术人员可以适当地采用这种变化。因此，il27rα结合分子旨在以不同于本文具体描述的方式实施，并且本发明包括适用法律允许的所附权利要求中记载的主题的所有修改和等同物。
[0270]
除非另有说明，份数是重量份数，分子量是重均分子量，温度是摄氏度(℃)，压力是大气压或接近大气压。使用标准缩写，包括下述：bp＝碱基对；kb＝千碱基；pl＝皮升；s或sec＝秒；min＝分钟；h或hr＝小时；aa＝氨基酸；kb＝千碱基；nt＝核苷酸；pg＝皮克；ng＝纳克；μg＝微克；mg＝毫克；g＝克；kg＝千克；dl或dl＝分升；μl或μl＝微升；ml或ml＝毫升；l或l＝升；μm＝微摩尔；mm＝毫摩尔；m＝摩尔；kda＝千道尔顿；i.m.＝肌肉内(经肌肉内)；i.p.＝腹膜内(经腹膜内)；sc或sq＝皮下(经皮下)；qd＝每日一次；bid＝每日两次；qw＝每周一次；qm＝每月一次；hplc＝高效液相色谱；bw＝体重；u＝单元；ns＝无统计学显著性；pbs＝磷酸盐缓冲盐水；pcr＝聚合酶链式反应；nhs＝n-羟基琥珀酰亚胺；hsa＝人血清白蛋白；msa＝小鼠血清白蛋白；dmem＝达氏改良伊氏培养基；gc＝基因组拷贝；edta＝乙二胺四乙酸；pbmc＝原代外周血单核细胞；fbs＝胎牛血清；fcs＝胎牛血清；hepes＝4-(2-羟乙基)-1哌嗪乙磺酸；lps＝脂多糖；atcc＝美国典型培养物保藏中心。
[0271]
实施例1.免疫方案
[0272]
通过用对应于hil27rα的氨基酸33-516(uniprot参考号q6uwb1)的多肽免疫骆驼起始抗-hil27rαvhh的分离过程。通过用mil27rα的201个氨基酸胞外结构域、mil27rα前体的氨基酸25-510(uniprot参考号o70394)对骆驼进行免疫，起始分离抗-mil27rαvhh的过程。对于每种抗原，使用以下方法鉴定和分离vhh。
[0273]
将编码抗原的合成dna序列插入pfuse_higg1_fc2载体(捷瑞生物技术(generay biotechnology))中，并转染进hek293f哺乳动物细胞宿主细胞进行表达。抗原表达为fc融合蛋白，其使用蛋白a色谱纯化。用1
×
pbs(抗原总量约1mg)稀释抗原。通过sds-page评估质量，以确保纯度足够(》80％)用于免疫。在免疫前，骆驼在设施中至少适应了7天。用抗原进行免疫，在7周的时间内每周给予一次抗原。对于初次免疫，免疫原的制备如下：将10ml完全弗氏佐剂(cfa)加入研钵中，然后用研杵研磨和样品研磨将10ml抗原的1
×
pbs缓慢加入研钵，直到抗原乳化至乳白色且难以分散。对于免疫方案中后续的六次免疫(2-7周)，除使用不完全弗氏佐剂(ifa)代替cfa外，按上述方法制备免疫原。在骆驼上的至少六个部位皮下注射约2ml乳化抗原，每只骆驼总共约10ml。当注射抗原时，针在每次注射后在皮下空间中保持约10至15秒，以避免乳液泄漏。
[0274]
实施例2.噬菌体文库构建
[0275]
在免疫方案中最后一次注射后三天从骆驼身上采集血样。从血液中提取rna并转录成cdna。编码vh-ch1-铰链-ch2-ch3构建体的约900bp的逆转录序列从编码vhh-铰链-ch2-ch3物质的约所需700bp片段中分离。通过巢式pcr扩增纯化的约700bp片段。使用pst1和not1消化扩增的序列。将约400bp的pst1/not1消化片段插入到pst1/not1消化的pmecs噬菌粒载体中，使得编码vhh的序列与编码ha/his序列的dna序列在框内。pcr产生的序列和pmecs噬菌粒的载体用pst i和not i消化，随后连接到pmecs/nb重组体。连接后，通过电穿
孔将产物转化到大肠杆菌(e.coli)tg1细胞中。将转化体富集在生长培养基中，然后转移到2yt+2％葡萄糖琼脂平板上。
[0276]
实施例3：抗原特异性vhh的分离
[0277]
对噬菌体库进行生物淘选以鉴定结合il27rα的vhh。用il27rα包被96孔板，并在每个孔中孵育噬菌体文库以允许表达il27rα反应性vhh的噬菌体结合至板上的il27rα。洗涤非特异性结合的噬菌体并分离特异性结合噬菌体。选择后，在tg1细胞中扩增表达il27rα反应性vhh的富集噬菌体文库。重复上述生物淘选过程2-3轮，以富集针对il27rα的vhh选择性文库。
[0278]
实施例4：展现出特异性结合ifngr1的抗体的鉴定：
[0279]
在完成实施例3的生物淘选后，分离三个96孔板的单噬菌体克隆，以便在包被有il27rα的板上进行周质提取物elisa(pe-elisa)，以鉴定选择性结合ifngr1的阳性vhh结合剂。在相同条件下用il27rα和pbs包被96孔板。接下来，在37℃下封闭孔1小时。然后，向各孔中加入100μl提取的抗体并孵育1小时。随后，向各孔中加入100μl与hrp偶联的抗标签多克隆抗体，并在37℃下孵育1小时。用tmb底物显影板。通过加入h2so4停止反应。在微量滴定板阅读器上读取450nm的吸收率。具有比pbs包被的对照高至少三倍吸光度的抗原包被孔的抗体，被认为表现出对il27rα的特异性结合。对阳性克隆进行测序，并分析序列以鉴定独特的克隆型
[0280]
实施例5.通过表面等离子体共振评估结合亲和力
[0281]
从根据实施例1-3产生的每个hil27rαvhh克隆型中选择代表性实施例，用于进行如下通过spr的结合评估。使用表面等离子体共振(spr)基本上按照以下程序评估对应于seq id no:2-27的hil27rα结合分子的结合亲和力。所有实验均在配备蛋白a衍生传感器芯片(cytiva)的biacore t200仪器上在10mm hepes、150mm nacl、0.05％(v/v)聚山梨醇酯20(ps20)和3mm edta(hbs-ep+缓冲液)中进行。单-fc vhh配体以5μl/分钟的速度流动18至300秒的可变时间，达到下表所列的捕获载荷。配体捕获后，在高性能或单循环动力学模式下注射il27rα-受体胞外结构域的2倍稀释系列，该序列经修饰以包含c末端多聚-his序列，通常包括在1μm和1nm之间的至少5个浓度。通过流动ph 1.5的10mm甘氨酸-hcl(60秒，50μl/分钟)实现表面再生。用biacore t200评估软件处理减去缓冲液的感测图，并用1:1langmuir结合模型(整体偏移设置为零)进行全局拟合，以提取动力学和亲和常数(ka，kd，kd)。r
最大
《100ru表示表面密度与动力学分析兼容。使用以下公式生成计算的r
最大
值：r
最大
＝载荷(ru)x配体的价态x(分析物的分子量/配体的分子量)。表面活性定义为实验/计算的r
最大
之比。表6中提供了这些结合亲和力实验的结果。
[0282]
应理解，本文所述的实施例和实施方式仅用于说明目的，本领域技术人员应了解据此作出的各种修饰或改变，且它们包括在本技术的主旨和权益以及所附权利要求书的范围内。本文引用的所有发表物、序列登记号、专利和专利申请通过引用全文纳入本文以用于所有目的。

技术特征：
1.一种特异性结合至il2rb的胞外结构域的il27rα结合分子。2.如权利要求1所述的il27rα结合分子，其中所述il2rb结合分子包括单域抗体(sdab)。3.如权利要求2所述的il27rα结合分子，其中所述sdab包含互补决定区1(cdr1)、cdr2和cdr3，如下表的行中所示：
4.如权利要求2或3所述的il27rα结合分子，其中所述sdab与选自seq id no:2-25中的任一多肽序列具有至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％、或至少98％、或至少99％同一性或100％同一性。5.如权利要求2所述的il27rα结合分子，其中所述sdab包含互补决定区1(cdr1)、cdr2和cdr3，如下表的行中所示：
6.如权利要求2所述的il27rα结合分子，其中所述sdab与选自seq id no:122、126、130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、170和174中的任一多肽序列具有至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％、或至少98％、或至少99％同一性或100％同一性。7.如权利要求3或5中任一项所述的il27rα结合分子，其中所述sdab是人源化的或包含移植到异源框架区的cdr。8.如权利要求1-7中任一项所述的il27rα结合分子，进一步包括标记剂、成像剂和/或治疗剂。9.如权利要求1-8中任一项所述的il27rα结合分子，用于分离、耗竭、或富集生物样品的il27rα+细胞。11.一种核酸序列，其编码权利要求1-8中任一项所述的il27rα结合分子。12.一种包含如权利要求11所述核酸的重组病毒或非病毒载体。13.一种宿主细胞，其包含权利要求11所述的核酸。14.一种试剂盒，其包括权利要求1-8中任一项所述的il2rb结合分子。

技术总结
本发明涉及生物活性分子和组合物及其使用方法，所述生物活性分子包括特异性结合至人IL27Rα的胞外结构域的单域抗体(sdAb)，组合物包括这种抗体。物包括这种抗体。


技术研发人员：R
受保护的技术使用者：辛德凯因股份有限公司
技术研发日：2021.08.04
技术公布日：2023/9/9