一种定点突变创制无卷须黄瓜种质的方法

1.本发明属于基因工程领域，具体涉及一种定点突变创制无卷须黄瓜种质的方法。


背景技术：

2.卷须是葫芦科植物特有的运动器官，其可以使植物获得向高处攀爬的能力。黄瓜是栽培蔬菜作物，主要通过人工绑蔓来进行精细化管理。因此，黄瓜不需要卷须来攀援；同时为了减少卷须消耗生物量，一般还需要人工摘除，费时费力。由此可见，为了黄瓜的高产和省力化栽培，培育无卷须的黄瓜品种具有重要的经济和现实意义。
3.目前，调控植物卷须生长发育基因的研究已经取得一定进展。hofer等研究发现，hd-zipⅰ为豌豆卷须发生的关键调控子，hd-zipⅰ通过抑制叶片舒展从而变态发育形成卷须；hd-zipⅰ属于一个特殊小分支家族基因，推测蝶形花亚科野豌豆的卷须进化产生与hd-zipⅰ基因的获得相关。boss等基于1份矮化无卷须葡萄发现葡萄卷须为花序的变态器官，进一步研究发现，矮化无卷须葡萄为vvgai(编码della蛋白)的赤霉素不敏感型突变，即赤霉素可抑制葡萄花序，促进卷须发生。calonje等从葡萄中克隆了2个mads-box基因vful-l和vap1，发现它们在卷须的整个发育过程中都表达，并证明了葡萄的卷须是花的同源异形器官。oizumi等报道了1份甜瓜无卷须材料“chibatl”。“chibatl”为甜瓜品种
‘
fuyukei1’的自发突变，为单基因隐性突变；而后mizuno等获得材料“chibatl”的杂合子，从而确定了甜瓜卷须为侧分枝的茎叶变态结构。戚春章等从湖北省收集到一份茎叶表面覆盖软毛、无卷须、果面无瘤无刺的华南型白皮黄瓜的突变体，发现无卷须性状与软毛、果实无瘤无刺性状连锁。wang等人在3000多份黄瓜种质中发现1株无卷须黄瓜突变体ten，该突变体是由tcp转录因子家族的csten基因突变所导致的。csten在黄瓜卷须里特异表达，稀有突变显著降低了csten的转录激活活性，使卷须退化，失去向触性，发育为叶片形状。chen等通过ems诱变筛选获得1份黄瓜无卷须突变体td-1(tendril-lessmutant)，为隐性突变；td-1同时具有多样性缺陷表型，包括矮化、表皮毛减少、叶片褶皱、根系短小。图位克隆和bsa测序确定突变基因为csgcn5(csa6g527060)，为错义突变，造成第82位天冬氨酸突变为天冬酰胺。组织表达检测显示，csgcn5在黄瓜根、茎、叶、卷须等组织均有较高表达量，与td-1具有多样性缺陷表型相吻合。


技术实现要素：

4.本发明的目的是创制无卷须黄瓜种质。
5.本发明首先保护一种培育无卷须黄瓜的方法，通过突变卷须黄瓜品种中cslfy蛋白的编码基因(即cslfy基因)来实现；
6.所述cslfy蛋白可为a1)或a2)或a3)：
7.a1)氨基酸序列是seq id no：3所示的蛋白质；
8.a2)在a1)或a2)的n端或/和c端连接标签得到的融合蛋白质；
9.a3)将seq id no：3所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几
个氨基酸残基得到的蛋白质。
10.上述a2)中的蛋白质，标签具体如表1所示。
11.表1.标签的序列
12.标签残基序列poly-arg5-6(通常为5个)rrrrrpoly-his2-10(通常为6个)hhhhhhflag8dykddddkstrep-tagii8wshpqfekc-myc10eqkliseedlha9ypydvpdya
13.上述a3)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
14.上述a3)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
15.上述a3)中的蛋白质的编码基因可通过将seq id no：1或seq id no：2所示的dna序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5
′
端和/或3
′
端连上表1所示的标签的编码序列得到。
16.上述方法中，所述突变可为将seq id no：1所示的cslfy基因突变为cslfy/-1bp；所述cslfy/-1bp是将seq id no：1自5’末端起第281位核苷酸g缺失，保持seq id no：1的其他核苷酸序列不变得到的dna分子。
17.上述方法中，所述突变卷须黄瓜品种中cslfy蛋白的编码基因是通过将crispr/cas9系统导入黄瓜实现。所述crispr/cas9系统可包括表达靶向所述cslfy蛋白的编码基因的grna的dna分子的重组表达载体。
18.上述方法中，所述grna的靶标序列可为seq id no：1自5’末端起第274-298位所示。
19.上述方法中，所述重组表达载体可为重组质粒crispr/cas9-cslfy。重组质粒crispr/cas9-cslfy可为将seq id no：4所示的dna双链分子插入crispr/cas9载体的限制性内切酶bsal的识别位点，得到的重组质粒。
20.本发明还保护突变卷须黄瓜品种中上述任一所述cslfy蛋白的编码基因(即cslfy基因)的物质在培育无卷须黄瓜中的应用。
21.上述任一所述cslfy基因可为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)或(b5)的dna分子：
22.(b1)编码区如seq id no:1所示的dna分子；
23.(b2)核苷酸序列如seq id no:1所示的dna分子；
24.(b3)核苷酸序列如seq id no:2所示的dna分子；
25.(b4)在严格条件下与(b1)或(b2)或(b3)限定的dna分子杂交且编码上述任一所述cslfy蛋白的dna分子；
26.(b5)来源于黄瓜且与(b1)或(b2)或(b3)限定的dna分子至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码上述任一所述cslfy蛋白的dna分子。
27.所述严格条件是在2
×
ssc，0.1％sds的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次
5min，又于0.5
×
ssc，0.1％sds的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min。
28.其中，所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因组dna或重组dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna或hnrna等。
29.其中，seq id no:1由1161个核苷酸组成，seq id no:2由1948个核苷酸组成，seq id no:1所示的核苷酸编码seq id no:3所示的氨基酸序列。
30.本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码上述任一所述cslfy蛋白的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的上述任一所述cslfy蛋白的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码上述任一所述cslfy蛋白，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
31.这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码氨基酸序列如seq id no:3所示的cslfy蛋白的核苷酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
32.上述应用中，所述突变可为将seq id no：1所示的cslfy基因突变为cslfy/-1bp；所述cslfy/-1bp是将seq id no：1自5’末端起第281位核苷酸g缺失，保持seq id no：1的其他核苷酸序列不变得到的dna分子。
33.上述应用中，所述突变卷须黄瓜品种中cslfy蛋白的编码基因的物质可为b1)或b2)：
34.b1)抑制或降低所述cslfy蛋白的编码基因的表达的核酸分子；
35.b2)含有b1)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系。
36.上述应用中，b1)所述核酸分子可为表达靶向所述cslfy蛋白的编码基因的grna的dna分子或为靶向所述cslfy蛋白编码基因的grna。
37.上述应用中，所述grna的靶标序列可为seq id no：1自5’末端起第274-298位所示。
38.实验证明，采用含有重组质粒crispr/cas9-cslfy的重组农杆菌转化黄瓜自交系9930，能够对cslfy基因进行基因编辑，cslfy基因通过crispr/cas9核酸内切酶编辑之后，可造成cslfy基因突变，当两条同源染色体的cslfy基因均发生突变时(具体为将seq id no：1所示的cslfy基因突变为cslfy/-1bp；所述cslfy/-1bp是将seq id no：1自5’末端起第281位核苷酸g缺失，保持seq id no：1的其他核苷酸序列不变得到的dna分子)，可以导致cslfy蛋白活性丧失；cslfy蛋白活性丧失形成无卷须黄瓜种质。采用本发明的方法能够实现对黄瓜的cslfy基因编辑，获得无卷须黄瓜。由此可见，cslfy蛋白可以调控黄瓜的卷须。本发明具有重要的应用价值。
附图说明
39.图1为靶点、oligo f和oligo r的位置关系。
40.图2为6个cslfy纯合突变株的测序结果及cslfy基因和cslfy蛋白的突变类型。
41.图3为6个cslfy纯合突变株的表型观察。
具体实施方式
42.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
43.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
44.黄瓜自交系9930记载于如下文献中：li q，li h1，huang w，xu y，zhou q，wang s，ruan j，huang s，zhang z(2019).a chromosome-scale genome assembly of cucumber(cucumis sativusl.).gigascience 8:giz072.，公众可从北京市农林科学院(即申请人)获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。黄瓜自交系9930为卷须黄瓜品种。
45.crispr/cas9载体构建试剂盒为杭州百格生物技术有限公司的产品，产品目录号为bgk03。
46.ms粉为phyto technology laboratories公司的产品，产品目录号为m519。
47.下述实施例中涉及的培养基如下：
48.ms液体培养基的溶质及其浓度为ms粉4.43g/l和蔗糖30g/l，溶剂为水，ph值为5.7-5.8。
49.ms固体培养基的溶质及其浓度为ms粉4.43g/l、蔗糖30g/l和植物凝胶2.5g/l，溶剂为水，ph值为5.7-5.8。
50.分化培养基的溶质及其浓度为ms粉4.43g/l、蔗糖30g/l、植物凝胶2.5g/l、6-ba 0.5mg/l和aba 1mg/l，溶剂为水，ph值为5.7-5.8。
51.抗性分化培养基的溶质及其浓度为ms粉4.43g/l、蔗糖30g/l、植物凝胶2.5g/l、6-ba0.5mg/l、aba 1mg/l、卡那霉素25mg/l和羧苄青霉素500mg/l，溶剂为水，ph值为5.7-5.8。
52.生根培养基的溶质及其浓度为ms粉4.43g/l、蔗糖30g/l和植物凝胶2.5g/l，溶剂为水，ph值为5.7-5.8。
53.1/2ms液体培养基的溶质及其浓度为ms粉2.22g/l和蔗糖30g/l，溶剂为水，ph值为5.7-5.8。
54.本发明中，黄瓜cdna中，cslfy基因的核苷酸序列如seq id no:1所示；黄瓜基因组dna中，cslfy基因的核苷酸序列如seq id no:2所示。cslfy基因编码cslfy蛋白。cslfy蛋白的氨基酸序列如seq id no:3所示。
55.实施例1、定点突变创制无卷须黄瓜种质
56.利用seq id no：1所示的dna序列在e-crispr网站(http://www.e-crisp.org/e-crisp/designcrispr.html)进行靶点设计。本实施例选择1个靶点进行实验。靶点序列为：5
’‑
ttccgctgggaccttctagtgggtg-3’(即seq id no：1自5’末端起第274-298位)，对应靶基因为cslfy基因。
57.一、重组质粒crispr/cas9-cslfy的构建
58.1、根据靶点设计并合成oligo f：
[0059]5’‑
tgtgttccgctgggaccttctagtgggtg-3’和oligo r：
[0060]5’‑
aaacacccactagaaggtcccagcggaa-3’(靶点、oligo f和oligo r的位置关系如图1所示)。
[0061]
2、用去离子水分别将oligo f和oligo r稀释至10μm，得到oligo f稀释液和oligo r稀释液。
[0062]
3、制备退火反应体系。退火反应体系为20μl，由1μl oligo f稀释液、1μl oligo r稀释液和18μl bufferaneal(crispr/cas9载体构建试剂盒中的组件)组成。
[0063]
4、取步骤3制备的反应体系，退火，得到oligo二聚体。
[0064]
退火程序为：先95℃3min，之后以0.2℃/s的速度降温至20℃。
[0065]
5、将步骤4得到的oligo二聚体和crispr/cas9载体(crispr/cas9载体构建试剂盒中的组件)进行连接，得到重组质粒crispr/cas9-cslfy。
[0066]
连接体系为10μl，由1μl oligo二聚体、2μl crispr/cas9载体、0.5μl限制性内切酶bsaⅰ(anza，ivgn0366)，2.5μl t4 ligase(anza，ivgn2104)，1μlanza buffer(t4 ligase自带)和ddh2o组成。
[0067]
连接程序为：室温静置1h。
[0068]
将重组质粒crispr/cas9-cslfy进行测序。测序结果表明，重组质粒crispr/cas9-cslfy为将seq id no：4所示的dna双链分子插入crispr/cas9载体的限制性内切酶bsal的识别位点，得到的重组质粒。
[0069]
二、cslfy纯合突变株的获得
[0070]
由于黄瓜是二倍体植株，当cas9发挥作用开始剪切特定的基因时，同一个细胞内的两条同源染色体上的两个等位基因都有可能被编辑，产生同样类型或不同类型的突变，所以将一个植株中两个等位基因看成是两个基因编辑事件。纯合突变株指的是该植株的两条同源染色体的cslfy基因发生了相同的突变。双等位基因突变株指的是该植株的两条同源染色体的cslfy基因均发生了突变但突变形式不同。杂合突变株数指的是该植株的两条同源染色体中的一条同源染色体的cslfy基因发生了突变、另一条同源染色体的cslfy基因未发生突变。野生型指的是该植株的两条同源染色体中的cslfy基因均未发生突变。
[0071]
1、农杆菌侵染液的制备
[0072]
(1)将重组质粒crispr/cas9-cslfy转化至根癌农杆菌eha105，得到重组农杆菌。
[0073]
(2)将重组农杆菌单克隆接种于2ml含50mg/l卡那霉素和70mg/l rif的yeb液体培养基，28℃、200rpm/min振荡培养过夜，得到培养菌液1。将2ml培养菌液1接种于50ml含50mg/l卡那霉素和70mg/l rif的yeb液体培养基，28℃、200rpm/min振荡培养，得到od
600nm
为0.6-0.8的培养菌液2。
[0074]
(3)取步骤(2)得到的培养菌液2，5000rpm离心5分钟，收集菌体；先用1/2ms液体培养基洗涤菌体，再用1/2ms液体培养基稀释，得到od
600nm
为0.2左右的农杆菌侵染液。
[0075]
2、将重组农杆菌转化至黄瓜自交系9930(以下简称黄瓜)，经过分化和生根后，获得t0代拟转基因黄瓜。具体步骤如下：
[0076]
(1)挑选饱满完整的黄瓜种子，剥皮后，先在70％(v/v)乙醇水溶液中消毒30s，然后置于2.0％次氯酸钠溶液中杀菌15min，再用无菌水冲洗数遍，最后播种在ms固体培养基上，28℃培养2-3天直至子叶破壳。
[0077]
(2)完成步骤(1)后，取所述黄瓜种子，切去生长点及下胚轴，两片子叶均切去上半
部分(1/2－1/3)，留取下半部分，作为外植体。
[0078]
(3)完成步骤(2)后，用步骤1制备的农杆菌侵染液侵染外植体15min；侵染结束后，用无菌滤纸吸干多余农杆菌侵染液，将外植体背朝下接种于分化培养基，28℃暗培养2d。
[0079]
(4)完成步骤(3)后，将外植体置于抗性分化培养基，28℃光暗交替培养(16小时光照/8小时黑暗；光照强度约为2000lx)15-20d，获得长约1.0-1.5cm的抗性芽。
[0080]
(5)完成步骤(4)后，切下抗性芽并置于含卡那霉素100mg/l的生根培养基，28℃光暗交替培养(16小时光照/8小时黑暗；光照强度约为2000lx)诱导生根。待根系发育好后，将黄瓜植株移入盛有无菌土的花盆中，并用保鲜膜遮盖以保持水分，在人工气候室培养1周；然后移至温室，先适应3-5d，然后常规管理，即得到t0代拟转基因黄瓜。
[0081]
3、分别以t0代拟转基因黄瓜叶片的基因组dna为模板，采用引物f：5
’‑
cctcgagaaatggtgggagg-3’和引物r：5
’‑
aggggagagccaaacaatcc-3’组成的引物对进行pcr扩增(反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min)，得到相应的pcr扩增产物。分别将pcr扩增产物进行测序。测序结果与cslfy基因cas9目标序列(seq id no：2自5’末端起第43至491位所示)进行比对，统计突变类型。
[0082]
4、分别将步骤3获得的杂合突变株进行自交，得到的种子即为t1代种子，t1代种子长成的植株即为t1代植株。
[0083]
5、分别以t1代植株叶片的基因组dna为模板，采用引物f：5
’‑
cctcgagaaatggtgggagg-3’和引物r：5
’‑
aggggagagccaaacaatcc-3’组成的引物对进行pcr扩增(反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min)，得到相应的pcr扩增产物。分别将pcr扩增产物进行测序。测序结果与cslfy基因cas9目标序列(seq id no：2自5’末端起第43至491位所示)进行比对，统计突变类型。
[0084]
结果表明，获得6株cslfy纯合突变株，分别命名为cslfy-1、cslfy-2、cslfy-3、cslfy-4、cslfy-5和cslfy-6。黄瓜自交系9930、cslfy-1、cslfy-2、cslfy-3、cslfy-4、cslfy-5和cslfy-6中cslfy基因和cslfy蛋白的突变类型见图2(9930为黄瓜自交系9930的部分序列，cslfy1-6为6株cslfy纯合突变株)。cslfy-1、cslfy-2、cslfy-3、cslfy-4、cslfy-5和cslfy-6的两条同源染色体的cslfy基因均发生了相同的突变，具体为两条同源染色体上在cslfy基因均发生了1个核苷酸“g”的缺失(即seq id no：1自5’末端起第281位缺失)，从而引起了移码，编码的蛋白提前终止，导致cslfy蛋白的功能缺失。
[0085]
三、cslfy纯合突变株的表型观察
[0086]
待cslfy纯合突变株(cslfy-1、cslfy-2、cslfy-3、cslfy-4、cslfy-5和cslfy-6)和黄瓜自交系9930均生长至4叶1心时，观察是否有卷须表型。
[0087]
结果见图3(ck-1和ck-2均为黄瓜自交系9930)。结果表明，黄瓜自交系9930具有卷须表型，而cslfy-1、cslfy-2、cslfy-3、cslfy-4、cslfy-5和cslfy-6不具有卷须表型，其卷须表现为叶片状。即cslfy-1、cslfy-2、cslfy-3、cslfy-4、cslfy-5和cslfy-6均为无卷须黄瓜突变株。
[0088]
由此可见，本发明可以定点突变创制无卷须黄瓜种质。
[0089]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和
范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。

技术特征：
1.一种培育无卷须黄瓜的方法，通过突变卷须黄瓜品种中cslfy蛋白的编码基因来实现；所述cslfy蛋白为a1)或a2)或a3)：a1)氨基酸序列是seq id no：3所示的蛋白质；a2)在a1)或a2)的n端或/和c端连接标签得到的融合蛋白质；a3)将seq id no：3所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的蛋白质。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述突变为将seq id no：1所示的cslfy基因突变为cslfy/-1bp；所述cslfy/-1bp是将seq id no：1自5’末端起第281位核苷酸g缺失，保持seq id no：1的其他核苷酸序列不变得到的dna分子。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述突变卷须黄瓜品种中cslfy蛋白的编码基因是通过将crispr/cas9系统导入黄瓜实现；所述crispr/cas9系统包括表达靶向所述cslfy蛋白的编码基因的grna的dna分子的重组表达载体。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述grna的靶标序列为seq id no：1自5’末端起第274-298位所示。5.突变卷须黄瓜品种中cslfy蛋白的编码基因的物质在培育无卷须黄瓜中的应用；所述cslfy蛋白为a1)或a2)或a3)：a1)氨基酸序列是seq id no：3所示的蛋白质；a2)在a1)或a2)的n端或/和c端连接标签得到的融合蛋白质；a3)将seq id no：3所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的蛋白质。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述突变为将seq id no：1所示的cslfy基因突变为cslfy/-1bp；所述cslfy/-1bp是将seq id no：1自5’末端起第281位核苷酸g缺失，保持seq id no：1的其他核苷酸序列不变得到的dna分子。7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于：所述突变卷须黄瓜品种中cslfy蛋白的编码基因的物质为如下b1)或b2)：b1)抑制或降低所述cslfy蛋白的编码基因的表达的核酸分子；b2)含有b1)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：b1)所述核酸分子为表达靶向所述cslfy蛋白的编码基因的grna的dna分子或为靶向所述cslfy蛋白编码基因的grna。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述grna的靶标序列为seq id no：1自5’末端起第274-298位所示。

技术总结
本发明公开了一种定点突变创制无卷须黄瓜种质的方法。该方法通过突变卷须黄瓜品种中CsLFY蛋白的编码基因来实现；CsLFY蛋白为氨基酸序列是SEQ ID No：3所示的蛋白质；突变为将SEQ ID No：1所示的CsLFY基因突变为CsLFY/-1bp；CsLFY/-1bp是将SEQ ID No：1自5’末端起第281位核苷酸G缺失，保持SEQ ID No：1的其他核苷酸序列不变得到的DNA分子。采用本发明的方法能够对黄瓜的CsLFY蛋白的编码基因进行编辑，获得无卷须黄瓜。本发明具有重要的应用价值。值。


技术研发人员：温常龙 夏昌选 银珊珊 李颖
受保护的技术使用者：北京市农林科学院
技术研发日：2023.05.30
技术公布日：2023/9/9