直接特异性定量检测聚乙二醇化白介素-12的酶联免疫方法与流程

1.本发明属于药物定量检测领域，尤其涉及一种直接特异性定量检测聚乙二醇化白介素-12的酶联免疫方法。


背景技术：

2.聚乙二醇(polyethylene glycol，peg)别名聚氧乙烯醇或聚氧乙烯二醇，系环氧乙烷与单乙二醇(或双乙二醇)在碱性催化剂催化之下聚合而成。因其化学性质稳定，生物安全性好，在医药领域的应用由来已久。聚乙二醇修饰的蛋白或多肽类药物通过多种方式能够延长药物在体内的血药半衰期，提高稳定性，减弱免疫原性，聚乙二醇修饰的白介素12(简称“peg-il-12”)就是其中一种聚乙二醇修饰的蛋白类药物，该药物不仅能提高il-12的稳定性，延长半衰期，同时还能够平衡药物的il-12活性和副作用。然而，包含聚乙二醇修饰白介素12药物在内的聚乙二醇修饰药物在进行成药开发过程中无可避免地需要进行药代动力学研究，需要检测血液或其他体液中的药物含量。
3.20世纪70年代，在免疫组化、放射性免疫法等免疫酶技术的基础上发展出了酶联免疫吸附技术(enzyme linked immunosorbent assay，elisa)。该技术问世后，因其特异性强，灵敏度高，无放射性污染，操作简单等优势，在医学检验和基础研究中迅速得到广泛应用。特别是在重组蛋白药物的药代动力学研究中，该技术是获得目的蛋白在血清或其他体液样品中浓度的重要途径。
4.尽管目前使用酶联免疫吸附技术检测聚乙二醇修饰蛋白药物的报道很多，例如国外文献“determination of pegylated recombination protein(peg-sop55)in rat serum by elisa and study of its pharmacokinetics”公开了利用酶联免疫技术检测peg-sop55的方法，但该检测技术主要针对检测蛋白，而非聚乙二醇修饰的蛋白药物，同时在进行药代动力学研究过程中，体内有些蛋白药物不仅有聚乙二醇修饰的药物被吸收进入体内的，还有自体产生的相似蛋白，不含聚乙二醇也能够被普通的酶联免疫吸附技术检测到，因此，该方法不能准确测定通过给药进入体内的聚乙二醇修饰药物的含量。
5.由此可见，如何研发出一种能够避免其他蛋白药物干扰、检测精度高的适用于直接特异性定量检测聚乙二醇化白介素-12的酶联免疫方法是解决上述问题的关键举措。


技术实现要素：

6.本发明针对现有的酶联免疫吸附方法易受其他蛋白药物干扰，进而无法准确测定通过给药进入体内的聚乙二醇修饰药物含量的技术问题，提出一种操作简便、检测精度高的聚乙二醇化白介素-12的酶联免疫方法。
7.为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：
8.直接特异性定量检测聚乙二醇化白介素-12的酶联免疫方法，通过先将peg特异性抗体包被于酶标板上，利用包被peg特异性抗体的酶标板吸附待测样品中的聚乙二醇化白介素-12，再加入白介素-12特异性检测抗体依次经过孵育、显色、显色终止及检测步骤，实
现聚乙二醇化白介素-12定量检测。
9.在一实施方式中，直接特异性定量检测聚乙二醇化白介素-12的酶联免疫方法，具体包括以下步骤：
10.溶解后的peg特异性抗体加入空白酶标板中进行包被，得到包被后的酶标板；
11.所述包被后的酶标板依次经过封闭液封闭、洗涤后，得到预包被抗体的酶标板；
12.将待测样品加入所述预包被抗体的酶标板进行抗原与抗体特异性吸附，吸附结束后洗涤酶标板，得到吸附后的酶标板；
13.将白介素-12特异性检测抗体加入所述吸附后的酶标板进行孵育，孵育结束后洗涤酶标板，得到双抗体包被的酶标板；
14.向所述双抗体包被的酶标板中加入显色液避光孵育、显色，显色结束后加入终止液终止显色反应，酶标仪进行聚乙二醇化白介素-12定量检测。
15.在一实施方式中，所述溶解后的peg特异性抗体是通过缓冲液溶解peg特异性抗体制备得到，其中，所述缓冲液选自磷酸盐缓冲液或碳酸盐缓冲液。
16.在一实施方式中，所述peg特异性抗体浓度为5-10μg/ml。
17.在一实施方式中，制备所述包被后的酶标板时采用的包被条件为4℃-37℃，1-24h。
18.在一实施方式中，所述封闭液选自1-10％的牛血清白蛋白、卵清蛋白或添加脱脂奶粉的磷酸盐缓冲液。
19.在一实施方式中，制备所述预包被抗体的酶标板时，洗涤步骤所用洗涤液选自pbs缓冲液、添加表面活性剂的pbs缓冲液或添加牛血清白蛋白的pbs缓冲液。
20.在一实施方式中，所述添加表面活性剂的pbs缓冲液中的表面活性剂不包含聚乙二醇类表面活性剂。
21.在一实施方式中，所述白介素-12特异性检测抗体选自直接标记酶的白介素-12抗体、标记生物素的白介素-12抗体与标记链霉亲和素的酶联用、标记链霉亲和素的白介素-12抗体与标记生物素的酶联用或白介素-12抗体与酶标二抗联用。
22.在一实施方式中，所述白介素-12特异性检测抗体的浓度为0.001-2.0μg/ml。
23.与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：
24.1、本发明提出的直接特异性定量检测聚乙二醇化白介素-12的酶联免疫方法，该检测方法采用peg特异性抗体和白介素-12特异性检测抗体进行双抗体夹心酶联免疫吸附方法检测聚乙二醇化白介素-12，通过两种抗体的交叉特异性，能够在检测聚乙二醇化白介素-12的同时，减少或消除聚乙二醇和白介素-12的干扰，该方法具有特异性好，灵敏度高，设备要求低等特点，能够从根本上解决现有的酶联免疫吸附方法易受其他蛋白药物干扰，进而无法准确测定通过给药进入体内的聚乙二醇修饰药物含量的技术问题；
25.2、本发明提出的直接特异性定量检测聚乙二醇化白介素-12的酶联免疫方法，该方法可以用于聚乙二醇化白介素-12的药代动力学研究，在检测血液和其他体液中的聚乙二醇化白介素-12含量的同时，避免血液或其他体液中可能存在的游离的白介素-12，白介素-23，白介素-35等细胞因子以及游离peg的干扰；
26.3、本发明提出的直接特异性定量检测聚乙二醇化白介素-12的酶联免疫方法具有操作步骤简便、特异性好，灵敏度高、检测线性范围宽等特点，在40ng/ml-40pg/ml范围内均
可实现聚乙二醇化白介素-12含量的准确检测。
附图说明
27.图1为本发明实施例所提供的灵敏度评价实验的标准曲线；
28.图2为本发明实施例所提供的特异性评价试验的标准曲线；
29.图3为本发明实施例所提供的市售il-12检测试剂盒标准曲线。
具体实施方式
30.下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
31.本发明实施例提供了一种直接特异性定量检测聚乙二醇化白介素-12的酶联免疫方法，通过先将peg特异性抗体包被于酶标板上，利用包被peg特异性抗体的酶标板吸附待测样品中的聚乙二醇化白介素-12，再加入白介素-12特异性检测抗体依次经过孵育、显色、显色终止及检测步骤，实现聚乙二醇化白介素-12定量检测。
32.在一具体实施方式中，直接特异性定量检测聚乙二醇化白介素-12的酶联免疫方法，具体包括以下步骤：
33.s1、溶解后的peg特异性抗体加入空白酶标板中进行包被，得到包被后的酶标板；
34.s2、所述包被后的酶标板依次经过封闭液封闭、洗涤后，得到预包被抗体的酶标板；
35.s3、将待测样品加入所述预包被抗体的酶标板进行抗原与抗体特异性吸附，吸附结束后洗涤酶标板，得到吸附后的酶标板；
36.s4、将白介素-12特异性检测抗体加入所述吸附后的酶标板进行孵育，孵育结束后洗涤酶标板，得到双抗体包被的酶标板；
37.s5、向所述双抗体包被的酶标板中加入显色液避光孵育、显色，显色结束后加入终止液终止显色反应，酶标仪进行聚乙二醇化白介素-12定量检测。
38.在一具体实施方式中，所述溶解后的peg特异性抗体是通过缓冲液溶解peg特异性抗体制备得到，其中，所述缓冲液选自磷酸盐缓冲液或碳酸盐缓冲液。
39.在一具体实施方式中，所述peg特异性抗体浓度为5-10μg/ml。
40.在上述实施例方式中，peg特异性抗体浓度具体可选取5μg/ml、6μg/ml、7μg/ml、8μg/ml、9μg/ml、10μg/ml或根据实际需要选取上述限定范围内的任一数值均落在本发明的保护范围之内。
41.在一具体实施方式中，制备所述包被后的酶标板时采用的包被条件为4℃-37℃，1-24h。
42.在一具体实施方式中，所述封闭液选自1-10％的牛血清白蛋白、卵清蛋白或添加脱脂奶粉的磷酸盐缓冲液。
43.在一具体实施方式中，制备所述预包被抗体的酶标板时，洗涤步骤所用洗涤液选自pbs缓冲液、添加表面活性剂的pbs缓冲液或添加牛血清白蛋白的pbs缓冲液。
44.在一具体实施方式中，所述添加表面活性剂的pbs缓冲液中的表面活性剂不包含聚乙二醇类表面活性剂。
45.在一具体实施方式中，所述白介素-12特异性检测抗体选自直接标记酶的白介素-12抗体、标记生物素的白介素-12抗体与标记链霉亲和素的酶联用、标记链霉亲和素的白介素-12抗体与标记生物素的酶联用或白介素-12抗体与酶标二抗联用。
46.在一具体实施方式中，所述白介素-12特异性检测抗体的浓度为0.001-2.0μg/mlμg/ml。
47.为了更清楚详细地介绍本发明实施例所提供的直接特异性定量检测聚乙二醇化白介素-12的酶联免疫方法，下面将结合具体实施例进行描述。
48.实施例1
49.本实施例提供了一种直接特异性定量检测聚乙二醇化白介素-12的酶联免疫方法，具体为：
50.(1)peg特异性抗体用ph为7.4的0.01m pbs缓冲液溶解至10ug/ml，然后按照100ul/孔的体积加入96孔酶标板中，4℃孵育过夜；
51.(2)弃去酶标板中的pbs缓冲液，按照200ul/孔的体积加入含有1％bsa的pbs缓冲液，37℃，孵育2h进行封闭；
52.(3)弃去封闭液，加入200ul/孔，含有0.05％bsa的pbs缓冲液进行洗涤，重复洗涤三次，洗涤完成后晾干制得预包被抗体的酶标板；
53.(4)将聚乙二醇化白介素-12用pbs梯度稀释成20ng/ml、10ng/ml、5ng/ml、2.5ng/ml、1.25ng/ml、625pg/ml、312pg/ml、156pg/ml作为标准溶液；
54.(5)将待测样品和标准溶液按照100ul/孔加入预包被抗体的酶标板，37℃孵育1h，孵育完成后用洗涤液洗板三次；
55.(6)按照100ul/孔，加入白介素-12特异性检测抗体，37℃孵育1h，孵育完成后用洗涤液洗板三次；
56.(7)按照100ul/孔，加入辣根过氧化物酶标记羊抗鼠抗体，37℃孵育40min，孵育完成后用洗涤液洗板三次；
57.(8)按照100ul/孔，加入tmb显色液，37℃孵育5～30min，显色完成后加入100ul/孔终止液，终止反应；
58.(9)将酶标板用酶标仪进行检测，检测波长为450nm。
59.实施例2
60.本实施例提供了一种直接特异性定量检测聚乙二醇化白介素-12的酶联免疫方法，具体为：
61.(1)peg特异性抗体用ph为9.6的0.05m碳酸钠缓冲液溶解至5ug/ml,然后按照100ul/孔的体积加入96孔酶标板中，4℃孵育过夜；
62.(2)弃去酶标板中的peg抗体缓冲液，按照200ul/孔的体积加入含有1％bsa的pbs缓冲液，37℃，孵育2h进行封闭；
63.(4)弃去封闭液，加入200ul/孔，含有0.05％bsa的pbs缓冲液进行洗涤，重复洗涤三次，洗涤完成后晾干制得预包被抗体的酶标板；
64.(5)将聚乙二醇化白介素-12用pbs梯度稀释成400pg/ml、200pg/ml、100pg/ml、
50pg/ml、25pg/ml、12.5pg/ml、6.25pg/ml、3.125pg/ml作为标准溶液；
65.(6)将待测样品和标准溶液按照100ul/孔加入预包被抗体的酶标板中，37℃孵育1h，孵育完成后用洗涤液洗板三次；
66.(7)按照100ul/孔，加入辣根过氧化物酶标记的il-12检测抗体，37℃孵育1h，孵育完成后用洗涤液洗板三次；
67.(8)按照100ul/孔，加入tmb显色液，37℃孵育5～30min，显色完成后加入100ul/孔终止液，终止反应；
68.(9)将酶标板用酶标仪进行检测，检测波长为450nm。
69.实施例3
70.本实施例提供了一种检测聚乙二醇化白介素-12的酶联免疫方法，具体为：
71.(1)peg特异性抗体用ph为9.6的0.05m碳酸钠缓冲液溶解至5ug/ml,然后按照100ul/孔的体积加入96孔酶标板中，4℃孵育过夜；
72.(2)弃去酶标板中的pbs缓冲液，按照200ul/孔的体积加入含有1％bsa的pbs缓冲液，37℃，孵育2h进行封闭；
73.(3)弃去封闭液，加入200ul/孔，含有0.05％bsa的pbs缓冲液进行洗涤，重复洗涤三次，洗涤完成后晾干制得预包被抗体的酶标板；
74.(4)将聚乙二醇化白介素-12用pbs梯度稀释成20ng/ml、10ng/ml、5ng/ml、2.5ng/ml、1.25ng/ml、625pg/ml、312pg/ml、156pg/ml作为标准溶液；
75.(5)将待测样品和标准溶液按照100ul/孔加入预包被抗体的酶标板，37℃孵育1h，孵育完成后用洗涤液洗板三次；
76.(6)按照100ul/孔，加入生物素化的白介素-12特异性检测抗体，37℃孵育1h，孵育完成后用洗涤液洗板三次；
77.(7)按照100ul/孔，加入链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶，37℃孵育40min，孵育完成后用洗涤液洗板三次；
78.(8)按照100ul/孔，加入tmb显色液，37℃孵育5～30min，显色完成后加入100ul/孔终止液，终止反应；
79.(9)将酶标板用酶标仪进行检测，检测波长为450nm。
80.性能测试
81.本发明为了验证直接特异性定量检测聚乙二醇化白介素-12的酶联免疫方法的灵敏度、准确度等，还进一步对该方法进行了灵敏度评价实验、准确度与重复性试验以及中间精密度试验，具体如下：
82.(1)灵敏度评价实验
83.将实施例2中标准溶液测得的吸光值与标准液浓度的对数值做标准曲线(标准曲线如图1所示)，利用microcal origin软件，四参数逻辑曲线求回归方程，理论值、实测值等数据见下表：
84.表1灵敏度评价试验中理论值、实测值以及回收率
[0085][0086][0087]
实验结果：由上表所述数据可知，在40pg/ml-40ng/ml的范围内，具有较好的线性，回收率均在理论值
±
15％范围内，因此将检测范围确定为40pg/ml-40ng/ml。
[0088]
(2)准确度与重复性试验
[0089]
本次试验以peg-20kd-il-12作为待测样品对该方法的准确性进行验证，根据其标准曲线选取高(10ng/ml)、中(1.25ng/ml)、低(312pg/ml)3个浓度进行考察，每个样品重复测定8次，进行试验的准确度和重复性验证，实验具体步骤参照实施例3，结果见表2。
[0090]
表2准确度与重复性试验理论值、实测值以及回收率
[0091]
理论值/pg/ml实测值/pg/ml回收率/％rsd％10ng/ml9.509ng/ml950.3941.25ng/ml1.430ng/ml1140.9312pg/ml294pg/ml941.918
[0092]
由上表所示数据可知，通过本次准确度与重复性试验中对高、中、低三个浓度进行考察发现，这三个浓度的回收率均在理论值
±
15％范围内，rsd均小于20％，符合法规所规定的要求，由此可见，本发明所提供的检测方法的准确度和重复性均符合要求。
[0093]
(3)中间精密度试验
[0094]
本次试验以peg-20kd-il-12作为待测样品验证该检测方法的中间精密度，选取高(10ng/ml)、中(1.25ng/ml)、低(312pg/ml)3个浓度，每个浓度样品在1次实验内重复检测3次，重复2次实验，实验具体步骤参照实施例3，试验结果见下表：
[0095]
表3中间精密度试验相关数据
[0096]
[0097][0098]
(4)特异性评价试验：
[0099]
由于本发明所提供的检测方法多用于血液样本检测，为了评价此方法的特异性以及血清基质对检测的影响，本次试验选用牛血清模拟血清样本基质，在血清中只加白介素-12或不加任何物质的空白血清，而不添加聚乙二醇化白介素-12，它们在波长为450nm处的吸收值为0.2左右，这个值可能是由于血清内源性因素导致的本底吸收导致。
[0100]
同时，还对比了本发明的直接特异性定量检测聚乙二醇化白介素-12的酶联免疫方法与目前市售的il-12检测试剂盒(human il-12p70 precoated elisa kit，达科为，1111202)在模拟检测体液中的mpeg-il-12时候的性能差异，具体为：
[0101]
(1)将mpeg-il-12作为标准品，配制一系列标准溶液，浓度分别是160ng/ml、40ng/ml、10ng/ml、2.5ng/ml、625pg/ml、156pg/ml、39pg/ml、10pg/ml，将标准溶液测得的吸光值与标准液浓度的对数值做标准曲线(见图2)；
[0102]
(2)配制含有20pg/ml白介素-12的mpeg-il-12溶液浓度分别为10ng/ml、1.25ng/ml、312pg/ml，模拟体液含有白介素-12时对检测mpeg-il-12的干扰。
[0103]
(3)后续实验步骤参照实施例3，同时用市售的il-12检测试剂盒也同步进行了检测。
[0104]
表4特异性评价试验理论值、实测值以及回收率
[0105][0106][0107]
上表所示数据可知，本次试验结果与单独加10ng/ml、1.25ng/ml、312pg/ml聚乙二醇化白介素-12的吸收值基本一致，回收率83％以上，该结果表明本发明所提供的检测方法具有很高的特异性，受血清影响较小。但是需要说明的是，在本次试验中，市售白介素-12检测试剂盒高中低三个浓度的吸光度值均高出上限，无法进行相关数据计算(标准曲线见图3，检测结果见表5)。
[0108]
表5市售il-12检测试剂盒检测结果
[0109][0110]
基于上表所示检测结果，分析无法进行相关数据计算原因在于：由于il-12与il-12特异性抗体的结合能力远高于聚乙二醇化的il-12与il-12特异性抗体的结合能力，在il-12与聚乙二醇化的il-12同时存在时，il-12特异性抗体优先与il-12结合，且结合比较牢固，强烈干扰了聚乙二醇化il-12与il-12特异性抗体的结合，导致检测结果普遍偏高，无法进行计算。

技术特征：
1.直接特异性定量检测聚乙二醇化白介素-12的酶联免疫方法，其特征在于，通过先将peg特异性抗体包被于酶标板上，利用包被peg特异性抗体的酶标板吸附待测样品中的聚乙二醇化白介素-12，再加入白介素-12特异性检测抗体依次经过孵育、显色、显色终止及检测步骤，实现聚乙二醇化白介素-12定量检测。2.根据权利要求1所述的直接特异性定量检测聚乙二醇化白介素-12的酶联免疫方法，其特征在于，包括以下步骤：溶解后的peg特异性抗体加入空白酶标板中进行包被，得到包被后的酶标板；所述包被后的酶标板依次经过封闭液封闭、洗涤后，得到预包被抗体的酶标板；将待测样品加入所述预包被抗体的酶标板进行抗原与抗体特异性吸附，吸附结束后洗涤酶标板，得到吸附后的酶标板；将白介素-12特异性检测抗体加入所述吸附后的酶标板进行孵育，孵育结束后洗涤酶标板，得到双抗体包被的酶标板；向所述双抗体包被的酶标板中加入显色液避光孵育、显色，显色结束后加入终止液终止显色反应，酶标仪进行聚乙二醇化白介素-12定量检测。3.根据权利要求2所述的直接特异性定量检测聚乙二醇化白介素-12的酶联免疫方法，其特征在于，所述溶解后的peg特异性抗体是通过缓冲液溶解peg特异性抗体制备得到，其中，所述缓冲液选自磷酸盐缓冲液或碳酸盐缓冲液。4.根据权利要求3所述的直接特异性定量检测聚乙二醇化白介素-12的酶联免疫方法，其特征在于，所述peg特异性抗体浓度为5-10μg/ml。5.根据权利要求2所述的直接特异性定量检测聚乙二醇化白介素-12的酶联免疫方法，其特征在于，制备所述包被后的酶标板时采用的包被条件为4℃-37℃，1-24h。6.根据权利要求2所述的直接特异性定量检测聚乙二醇化白介素-12的酶联免疫方法，其特征在于，所述封闭液选自1-10％的牛血清白蛋白、卵清蛋白或添加脱脂奶粉的磷酸盐缓冲液。7.根据权利要求2所述的直接特异性定量检测聚乙二醇化白介素-12的酶联免疫方法，其特征在于，制备所述预包被抗体的酶标板时，洗涤步骤所用洗涤液选自pbs缓冲液、添加表面活性剂的pbs缓冲液或添加牛血清白蛋白的pbs缓冲液。8.根据权利要求7所述的直接特异性定量检测聚乙二醇化白介素-12的酶联免疫方法，其特征在于，所述添加表面活性剂的pbs缓冲液中的表面活性剂不包含聚乙二醇类表面活性剂。9.根据权利要求2所述的直接特异性定量检测聚乙二醇化白介素-12的酶联免疫方法，其特征在于，所述白介素-12特异性检测抗体选自直接标记酶的白介素-12抗体、标记生物素的白介素-12抗体与标记链霉亲和素的酶联用、标记链霉亲和素的白介素-12抗体与标记生物素的酶联用或白介素-12抗体与酶标二抗联用。10.根据权利要求2所述的直接特异性定量检测聚乙二醇化白介素-12的酶联免疫方法，其特征在于，所述白介素-12特异性检测抗体的浓度为0.001-2.0μg/ml。

技术总结
本发明提出一种直接特异性定量检测聚乙二醇化白介素-12的酶联免疫方法，属于药物定量检测领域，能够解决现有的酶联免疫吸附方法易受其他蛋白干扰，进而无法准确测定通过给药进入体内的聚乙二醇修饰药物含量的技术问题。该技术方案包括：通过先将PEG特异性抗体包被于酶标板上，利用包被PEG特异性抗体的酶标板吸附待测样品中的聚乙二醇化白介素-12，再加入白介素-12特异性检测抗体依次经过孵育、显色、显色终止及检测步骤，实现聚乙二醇化白介素-12定量检测。本发明能够应用于聚乙二醇化蛋白或多肽类药物定量检测方面。蛋白或多肽类药物定量检测方面。蛋白或多肽类药物定量检测方面。


技术研发人员：王建刚 乔天奎 郑彬彬
受保护的技术使用者：康立泰生物医药（青岛）有限公司
技术研发日：2022.03.03
技术公布日：2023/9/12