一种长余辉均相检测方法

1.本发明属于体外检测的技术领域，特别涉及一种长余辉均相检测方法。


背景技术：

2.长余辉均相检测是一种可用于免疫检测分析物的均相测定方法，它基于供体微球与受体微球之间能量传递的距离效应，以长余辉发光信号强度指示分析物的浓度信息。在cn202010347677.8发明专利中公开了相关的试剂及方法，其中供体微球中包裹有敏化剂分子，受体微球中包裹有缓存剂和发光剂，受体微球通过免疫反应结合等方式接近供体微球。光源选择性地激发供体微球，然后通过能量传递过程激活受体微球，最终发射出长余辉发光信号，被光学检测器探测并用于结果分析。能量传递效率与距离呈负相关，在约100nm的距离尺度内属于有效作用范围，未通过免疫反应等方式结合的供受体微球因距离超出所述范围而发光较弱。从功能上划分，供体微球为敏化球而受体微球为发光球。通过对长余辉发光信号的强度检测，来判断待测样品中目标分析物的有无及其浓度信息。均相检测技术有效避免了洗脱、离心等繁琐步骤，通过与高亲和力的抗体配合，能够在较短的时间内完成从孵育到检测等一系列步骤，在实现高灵敏检验的同时，降低了操作成本。
3.理想状态下，当敏化球和发光球在未免疫结合分析物时，两者之间的距离大于100nm，单线态的氧难以进行有效的传能，因此不会产生长余辉发光信号。而实际检测中，由于微球的自由扩散靠近，或者物理吸附结合等因素，会使敏化球和发光球之间的距离小于100nm，甚至零距离接触，同样会发生高效的长余辉发光，因此会产生伪信号。但是，在目前的均相检测方法中，复杂的背景信号或伪信号干扰难以有效地被去除，无法实现无背景的高信噪比检测。
4.另外，目前的均相检测普遍采用扫描式信号采集模式，需要按照空间时序对每个测试杯位上的样本进行逐个激发与信号收集。即便是借助全自动设备，也需要逐个测试杯位地进行光源激发和信号收集，概念上类似于对杯位逐个扫描测试。单次执行一个测试周期，只完成一个样本的测试，下一个样本测试还要等执行下一个周期。如此，当样本数量多的时候测试总耗费时间较长，这也等同于限制了通量的提高。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种长余辉均相检测方法及系统，解决均相检测背景干扰和通量受限的技术问题，实现高信噪比、高通量的长余辉均相检测。
6.在第一方面中，本技术提供一种长余辉均相检测方法，其包括以下步骤：
7.s1、提供长余辉均相检测试剂组合物和取样的待测样本；
8.s2、将所述长余辉均相检测试剂组合物中的至少一部分预先附着在测试容器的底板上；
9.s3、将所述待测样本和所述长余辉均相检测试剂组合物的剩余部分加入所述测试容器中进行孵育；
10.s4、注入分离液，将水相溶液分离至远离底板；
11.s5、用激发光照射分离后的检测液；
12.s6、通过检测器采集长余辉发光信号；
13.s7、根据所采集的长余辉发光信号值处理得到待测样本中目标分析物信息。
14.在本发明中，检测液为分离液与待测样本以及所述长余辉均相检测试剂组合物作用后得到的液态。在用激发光照射分离后的检测液的步骤中，需要使用激光照射油相的所有液体。
15.在本发明中，经过均相溶液中的免疫反应或结合作用，长余辉免疫复合物最终形成并固定在底板上。首先，通过分离液注入的技术，有效地去除非免疫结合作用产生的干扰或影响。在此基础上，借助长余辉发光面成像信号采集技术，一方面能够实现无背景的高质量检测，另一方面可以同时对多个样本进行便捷的快速检测。基于本发明的方法及系统，为开创高信噪比、高通量的长余辉均相检测提供了新的途径。
16.本发明长余辉发光面成像信号采集技术，可以同时对多个样本进行便捷的快速检测。例如，当考虑对单个或多个样本进行测试时，固定与测试杯位相对应的激发光源和检测器，当激发光关闭后收集长余辉发光信号。在这种情况下，所述激发光源为点光源或面光源，优选面光源；所述检测器为光电倍增管、硅光电池、摄像头、相机、手机、ccd、emccd，优选摄像头、相机、手机、ccd、emccd。
17.本发明也可兼容扫描式激发与信号采集，分离液注入的方法在该检测中仍然被使用，在去除非免疫结合作用产生的干扰并提高信噪比方面的显著优势得以保留。例如，当只考虑对单个样本进行测试时，固定与测试杯位相对应的激发光源和检测器，当激发光关闭后收集长余辉发光信号。在这种情况下，所述激发光源为点光源或面光源，优选点光源；所述检测器为光电倍增管、硅光电池、摄像头、相机、手机、ccd、emccd，优选光电倍增管、硅光电池。
18.在长余辉均相检测模式中，首先是激发光源由控制模块控制打开，光源发出的激发光对一个或多个测试杯位中的长余辉物质进行激发，关闭激发光源，然后由检测器接收产生的长余辉发光，或是对测试杯位区域进行拍照；检测器将此信号或是图片传递至信号处理模块，信号处理模块根据其内部预存程序将相关信号和图片进行处理，得到待检测目标分析物的含量。
19.所述分离液为凝胶溶液、油相液体；优选地，所述分离液为油相液体，且其密度大于水。
20.优选地，所述分离液为透明色；所述透明色的颜色为无色或浅色，更优选无色。
21.优选地，所述分离液的油相液体含有例如二氯甲烷、三氯甲烷、四氯化碳、全氟溴烷、全氟碘烷、全氟化碳、碘油、离子液体中的一种或多种。
22.优选地，所述分离液的全氟溴烷选自例如1-溴七氟丙烷、2-溴七氟丙烷、1-溴九氟丁烷、1-溴十一氟戊烷、1-溴十三氟己烷、1-溴十五氟庚烷、1-溴十七氟辛烷、1-溴十九氟壬烷中的一种或多种。
23.优选地，所述分离液的全氟碘烷选自例如全氟碘乙烷、1-碘七氟丙烷、2-碘七氟丙烷、2-碘九氟丁烷、1-碘十一氟戊烷、1-碘十三氟己烷、1-碘十五氟庚烷、1-碘十七氟辛烷、1-碘十九氟壬烷中的一种或多种。
24.优选地，所述分离液的全氟化碳选自例如全氟戊烷、全氟己烷、十六氟庚烷、十八氟辛烷、全氟壬烷、全氟癸烷、全氟环己烷、全氟(甲基环己烷)中的一种或多种。
25.优选地，所述分离液的离子液体含有例如以下式1和/或式2的结构：
[0026][0027]
在根据本发明的长余辉均相检测试剂组合物中包含敏化球和发光球。所述敏化球表面连接有第一偶联物，所述敏化球在光激发下产生单线态氧；所述发光球表面连接有第二偶联物，所述发光球与单线态氧反应产生长余辉发光信号。
[0028]
所述第一偶联物、第二偶联物能够分别与目标分析物形成免疫复合物。第一偶联物和第二偶联物的质量百分比含量均可以为0.0006％～0.1％，优选0.001％～0.05％，基于各自组分的总重计。
[0029]
根据本发明，所述敏化球包括载体微球、供体组分或者由它们组成，而所述发光球包括载体微球、受体组分或者由它们组成。所述供体组分包含吸光剂，所述受体组分包含光化学缓存剂和发光剂。在本发明的方法中，通过供体组分和受体组分的光化学能量传递而实现发光，特别是长余辉发光的功能。所述光化学缓存剂可在所述发光剂和所述吸光剂之间构建能量交换和储存的桥梁，使输入的激发光能量在一定时间段内以发光的形式持续释放出来，从而实现长余辉发光。
[0030]
在本技术中，吸光剂和发光剂本身是现有技术已知的。吸光剂通常指能吸收并捕获来自于自然光源或人工光源的光能的物质。吸光剂的选取范围包括传统的光敏试剂和其他能量供体材料等。而发光剂通常指能够将能量最终以光能的形式发射出来的物质。发光剂可以是能够产生荧光或磷光等的发光物质。
[0031]
为了利用余辉材料的有益效果，特别是例如改善余辉强度和时间，在本发明的组合物中对发光剂和吸光剂两个组分做了明确区分，使其各自分别承担吸收光能和释放光能的作用，从而在与经过特定筛选的光化学缓存剂组合之后实现能量输入、能量缓存和能量输出的能量利用路径。这也意味着，在有利的实施方式中，在结构上既具有吸光基团也具有发光基团从而以同一分子发挥两种功能的化合物不是根据本发明的发光剂或吸光剂，并且也不会得到本发明的优异技术效果。一方面，这样的化合物等同于把吸光剂与发光剂连同它们的性质一起打包绑定，就无法分别地对余辉发光试剂的激发和发光性能进行调节，例如当其根据实际的激发充能的需要选取了一个化合物后，试剂的发光性质也同时固定了，反之亦然；另一方面，这样的化合物等同于把吸光剂与发光剂的比例固定为例如1:1，无法同时调节吸光程度的强弱和发光水平的高低；而且，同时具备高效吸光功能与高效发光功能的材料相对较少。
[0032]
在本发明的组合设计中，光化学缓存剂与发光体可以为两个独立的分子，光化学缓存剂与发光体也可以整合在一个分子上。光化学缓存剂与发光体为两个分子时，可以独立地调节两者的浓度比例以优化长余辉发光；光化学缓存剂与发光体整合在一个分子时，
在很低的浓度下仍能保持有效的能量传递，产生可探测的长余辉发光。优选地，缓存剂分子本身不发光或发光非常弱，当缓存剂分子与单线态氧反应后发光性质被激活或高效产生可传能的暗态激发态。
[0033]
在根据本发明的发光试剂中，吸光剂与发光剂的选取具有一定的规则标准。一般而言，将具有较大的摩尔吸光系数的化合物选取作为吸光剂，例如光敏剂或能量供体染料；而将具有更高发光量子效率的化合物选取作为发光剂，例如发光染料。另外，吸光剂的吸收峰应该与发光剂的发射峰尽可能少的重叠，避免余辉发光被吸光剂吸收而减弱的不利影响。在包含敏化球与发光球的长余辉均相试剂中，当吸光剂浓度比例过高时，会产生长余辉发光被吸光剂吸收而减弱的不利影响；当吸光剂浓度比例过低时，吸收的激发光能量比较有限，也会导致长余辉发光较弱。
[0034]
本技术的发明人发现，从提高发光亮度或发光信号强度的角度考虑，所述吸光剂和发光剂应当有利地分别是选自如下的不同分子式或不同结构的至少一种化合物：卟啉和酞菁类染料、金属配合物、并苯类化合物、氟硼二吡咯类化合物(bodipy)、量子点(qds)、石墨烯类，以及这些化合物的衍生物或共聚物。
[0035]
(1)吸光剂
[0036]
优选地，所述吸光剂可选自卟啉类和酞菁类染料、过渡金属配合物、量子点(qds)，以及这些化合物的衍生物或共聚物。这些化合物本身是本领域技术人员已知的，以下提及吸光剂的一些非限制性的实例。
[0037]
作为卟啉类染料及其配合物可以提及例如以下这些化合物：
[0038]
[0039]
[0040][0041]
作为酞菁类染料及其配合物可以提及例如以下这些：
[0042]
[0043][0044]
在以上所示的这些吸光剂化合物的结构式中，
[0045]
x表示卤素如f,cl,br,i；以及，m＝金属元素，如al,pd,pt,zn,ga,ge,cu,fe,co,ru,re,os等。
[0046]
各个取代基r如r
1-24
表示h、羟基、羧基、氨基、巯基、酯基、醛基、硝基、磺酸基、卤素，或具有1-50、优选1-24、如2-14个碳原子的烷基、烯基、炔基、芳基、具有n、o或s的杂芳基、烷氧基、烷氨基，或者它们的组合。优选地，上述基团r如r
1-24
各自独立地选自甲氧基、乙氧基、二甲氨基、二乙氨基、甲基、乙基、丙基、丁基、叔丁基、苯基或者它们的组合。
[0047]
可以用作吸光剂的过渡金属配合物本身是已知的，并且优选是如上所示的那些卟啉类和酞菁类染料的配合物。
[0048]
合适的量子点材料包括例如石墨烯量子点、碳量子点和重金属量子点。
[0049]
重金属量子点包括例如ag2s、cds、cdse、pbs、cuins、cuinse、cuingas、cuingase、inp量子点。其外可以包裹壳层，形成核壳结构，壳层可以为ag2s、cds、cdse、pbs、cuins、cuinse、cuingas、cuingase中的一种或几种，也可以为zns层。
[0050]
优选地，采用表面配体对量子点进行修饰，所述表面配体可以是例如油酸、油胺、十八烯、十八胺、正十二硫醇及其组合等。在一些更有利的情况下，量子点表面的配体通过配体交换策略部分更换为含有三线态的分子结构，例如羧基蒽，羧基并四苯、羧基并五苯、氨基蒽、氨基并四苯、氨基并五苯、巯基蒽、巯基并四苯、巯基并五苯等。
[0051]
在一个更优选的实施方式中，所述吸光剂优选自卟啉和酞菁类的配合物、量子点(qds)、以及这些化合物的衍生物。例如以下这些示例性的一种或多种化合物：
[0052][0053][0054]
以及还有石墨烯量子点、cdse量子点和pbs量子点等量子点材料。
[0055]
(2)发光剂
[0056]
优选地，所述发光剂可选自铱配合物、稀土配合物、并苯类化合物、氟硼二吡咯类
化合物(bodipy)、以及这些化合物的衍生物和共聚物。
[0057]
作为氟硼二吡咯类化合物(bodipy)，可以提及例如以下这些化合物：
[0058][0059][0060]
作为并苯类化合物，可以提及例如以下这些化合物：
[0061][0062]
在以上所示的这些发光剂化合物的结构式中，
[0063]
n＝大于等于0的整数，例如0、1、2和3；
[0064]
各个取代基r如r
1-16
表示h、羟基、羧基、氨基、巯基、酯基、醛基、硝基、磺酸基、卤素，或具有1-50、优选1-24、如2-14个碳原子的烷基、烯基、炔基、芳基、具有n、o或s的杂芳基、烷氧基、烷氨基，或者它们的组合。优选地基团r如r
1-16
选自甲氧基、乙氧基、二甲氨基、二乙氨基、甲基、乙基、丙基、丁基、叔丁基、苯基；或者它们的组合。
[0065]
适合作为发光剂试剂的铱配合物中，配体的组成可以是一种或多种不同配体的组合，其结构示意及部分c-n，n-n，o-o和o-n配体的种类示例性展示如下(其中所示的c-n，n-n，o-o和o-n配体为其简略结构示意图且分别突出表示以配体中的c与n原子、两个n原子、两个o原子和o与n原子为配位点与铱原子ir进行配位作用，这样的表示方法是本领域技术人员熟悉和理解的)：
[0066][0067]
(其中dmso为二甲基亚砜)
[0068][0069]
其中c-n配体可以具有例如以下结构：
[0070][0071]
o-n配体可以具有例如以下结构：
[0072][0073]
n-n配体可以具有例如以下结构：
[0074][0075]
作为发光剂的稀土配合物可以例如是这样的结构，其中中心原子为镧系元素，配
体以o或n与中心原子配位，一般中心原子为eu、tb、sm、yb、nd、dy、er、ho、pr等。这些稀土配合物的配位数大约在3到12，优选6到10。在实际的稀土配合物中，配体种类、每个配体的个数和总的配位数可以发生变化。稀土配合物及其配体可参考例如jean-claude g.b
ü
nzli的综述性论文coord.chem.rev.,2015,293-294,19-47。
[0076]
在一个更优选的实施方式中，所述发光剂选自铱配合物、稀土配合物、氟硼二吡咯类化合物(bodipy)、苝以及这些化合物的衍生物。例如以下这些示例性的一种或多种化合物：
[0077][0078]
(3)光化学缓存剂
[0079]
光化学缓存剂的功能主要是光化学能量的转化，与主要功能为发光的发光剂不同，缓存剂分子本身不发光或发光很弱，其分子结构中一般不包含直接能发光的基团或共
轭结构。特别地，根据本发明的光化学缓存剂在种类上区别于发光剂或吸光剂，尤其是本发明所列的那些发光剂或吸光剂物质。在光化学反应中经过加成、重排或断键的反应步骤，激活在能级间跃迁的能量提取过程。
[0080]
特别地，本发明人发现，有一些特定的缓存剂化合物特别适合于制备稳定且长余辉发光性能良好的发光试剂。特别适用于本发明的缓存剂选自如下的结构式(式i)：
[0081][0082]
其中，
[0083]
g和t为选自o,s,se和n的杂原子；
[0084]
r1'和r2'以及r4'到r8'各自独立地选自h、羟基、羧基、氨基、巯基、酯基、硝基、磺酸基、卤素、酰胺基，或具有1-50、优选1-24、如2-14个碳原子的烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷氨基、芳基、芳烷基、具有n、o或s的杂芳基或杂芳烷基、二苯胺基，或者它们的组合，其中所述芳基、芳烷基、杂芳基或杂芳烷基任选具有一个或多个取代基l；和
[0085]
l选自羟基、羧基、氨基、巯基、酯基、硝基、磺酸基、卤素、酰胺基，或具有1-50、优选1-24、如2-14个或6-12个碳原子的烷基、烯基、炔基、烷氧基和烷氨基，或者它们的组合；
[0086]
以及，r3'为苯基、吸电子基团或包含吸电子基团的芳基。
[0087]
在本技术上下文中，“芳基”表示与脂族化合物相区别的芳香族化合物形成的基团或环，它们通过一个或多个单键而直接与另一结构基团相连接或者与另一环结构稠合，因此区分于通过亚烷基或酯基等间隔基与另一结构基团相连的基团例如“芳烷基”或“芳氧基”或“芳酯基”。类似地，也适用于“杂芳基”，它们可以看作是用杂原子n、s、se或o代替芳基上的环碳原子或用所述杂原子代替脂族环如环烯烃上的碳原子而形成的基团。此外，如无相反指示，则所述“芳基”或“杂芳基”还包括用芳基、杂芳基取代或稠合的芳基或杂芳基，如联苯基、苯基噻吩基或苯并噻唑基。另外，所述“芳基”或“杂芳基”还可以包括具有例如醚基或羰基的官能基团的芳族或杂芳族化合物形成的基团，如蒽酮、二苯醚或噻唑酮等。有利的，根据本发明的“芳基”或“杂芳基”具有4-30个、更优选5-24、例如6-14或6-10个碳原子。术语“稠合”则表示两个芳环具有公共的边。
[0088]
在本技术上下文中，术语“烷基”、“烷氧基”或“烷硫基”指的是直链、支化或环状的饱和的脂族烃基，其通过单键、氧基或硫基与其他基团相连接，其优选具有1-50、更优选1-24、如1-18个碳原子。术语“烯基”或“炔基”指的是直链、支化或环状的具有一个或多个c-c双键或三键的不饱和的脂族烃基，优选具有2-50、更优选2-24、如4-18个碳原子。
[0089]
在本技术上下文中，术语“烷氨基”指的是一个或多个烷基取代的氨基，包括单烷氨基或二烷基氨基，如甲基氨基、二甲基氨基、二乙基氨基、二丁基氨基等。
[0090]
在本技术上下文中，术语“卤素”包括氟、氯、溴和碘。
[0091]
在本技术上下文中，术语“吸电子基团”理解为当该基团取代了芳族或杂芳族环上的氢后会使得环上电子云密度降低的基团。这样的基团在化学领域中是广泛公知的。优选地，在本发明中，所述吸电子基团选自硝基、卤素、卤代烷基、磺酸基、氰基、酰基、羧基和/或
它们的组合。
[0092]
此外，在本技术上下文中，所列举的各个取代基定义中的选择基团可以相互组合而形成符合价键原则的新取代基，这意味着例如由烷基、酯基与乙烯基相互组合形成的例如c1-c6烷基酯基乙烯基(c1-6烷基-o-c(＝o)-c＝c-)也在相关取代基的定义中。
[0093]
在一个优选的实施方式中，环部分可以选自可以选自
[0094]
在一个优选的实施方式中，r1'和r2'以及r4'到r8'各自独立地选自具有1-18、优选1-12、更优选1-16个碳原子的烷基、烷氧基、烷氨基或芳基或者它们的组合，其中所述芳基可以被一个或多个基团l取代或未取代并且优选是被一个或多个l取代或未取代的苯基。
[0095]
优选地，l选自羟基，磺酸基、卤素、硝基、具有1-12个、更优选1-6个碳原子的直链或支化的烷基、烷氧基、烷氨基、氨基，或者它们的组合。
[0096]
更优选地，基团r1'和r2'以及r4'到r8'选自甲氧基、乙氧基、二甲氨基、二乙氨基、二丁氨基、甲基、乙基、丙基、丁基、叔丁基，或者它们的组合。
[0097]
更优选地，基团r3'选自吸电子基团或包含吸电子基团的芳基，所述吸电子基团优选自硝基、氰基、卤素、卤代烷基和/或它们的组合。相应地，包含吸电子基团的芳基优选包括环上具有一个或多个选自硝基、氰基、卤素和/或卤代烷基的取代基的芳基，优选苯基，如氟代苯基或全氟苯基。
[0098]
在一个尤其优选的实施方式中，光化学缓存剂选自如下这些化合物：
[0099]
[0100]
[0101][0102]
在本发明的长余辉均相检测试剂中，敏化球和发光球其中的一类分散在液相试剂中，而其中的另一类球或另一类球中的染料组分预先附着在底板上。例如，当把敏化球分散在液相试剂中时，发光球或发光球中的受体组分预先附着在底板上；同理，当把发光球分散在液相试剂中时，敏化球或敏化球中的供体组分预先附着在底板上。所述底板为均相测试容器的底板，例如样品测试比色皿的底板或样品测试杯的底板。
[0103]
所述发光球或敏化球预先附着在底板上的方法，包括发光球或敏化球通过化学键、生物结合、免疫结合等相互作用连接至底板、发光球或敏化球掺杂在底板中、发光球或敏化球掺杂在透明薄膜中并固定在底板表面。
[0104]
所述发光球中的受体组分或敏化球中的供体组分预先附着在底板上的方法，包括发光球中的受体组分或敏化球中的供体组分掺杂在底板中、发光球中的受体组分或敏化球中的供体组分掺杂在透明薄膜并固定在底板表面。
[0105]
所述敏化球、发光球、供体组分、或受体组分等掺杂至底板或透明薄膜的方法，包括共混式一体成型、后掺杂。所述后掺杂方法，包括预先制备底板或透明薄膜，将底板或透明薄膜与溶胀试剂作用并发生溶胀后，加入敏化球、发光球、供体组分、或受体组分等物质，去除溶胀试剂后固化成型。
[0106]
所述敏化球或供体组分掺杂后的底板及透明薄膜，表面连接第一偶联物；所述发光球或受体组分掺杂后的底板及透明薄膜，表面连接第二偶联物。
[0107]
所述底板及透明薄膜表面与第一偶联物或第二偶联物通过化学键连接。例如，所述底板及透明薄膜表面含有羧基、醛基或环氧基，第一偶联物或第二偶联物上均含有氨基，所述羧基、醛基或环氧基与所述氨基反应产生化学键，从而实现连接。
[0108]
除了如上所述的那些必要和优选的成分和组分之外，在根据本发明的长余辉均相检测试剂组合物中还可以包含免疫反应中常用的其他添加剂成分，例如稀释样本的试剂、保持体系稳定的试剂等。
[0109]
这样的其他成分包括例如盐、稳定剂、信号放大组分、表面活性剂、水、防腐剂、核酸、多肽，ph值调节剂。可选地，这样的成分还可包括稀释液，例如缓冲液pb、pbs、pbst、bbs、mes、tris、tes、hepes中的至少一种，它们能对全血样本进行溶血和稀释，并控制反应体系
的ph、盐浓度等。
[0110]
在一种优选的方案中，所述敏化球或敏化球中供体组分预先配置固定在测试容器底板上，所述发光球配置在水相试剂中。
[0111]
在一种优选的方案中，所述发光球或发光球中受体组分预先配置固定在测试容器底板上，所述敏化球配置在水相试剂中。
[0112]
在将试剂组合物制成试剂盒的形式时，这些其他成分可以任选地分别与如上所述的试剂组合，从而配制和分装成试剂盒中的不同试剂包装。
[0113]
在一些优选实施方案中，所述待测样本包括例如全血、尿液、末梢血、血清、血浆、体液、和/或脑脊液等。所述信息包括目标分析物的种类、浓度、ph值和成分等。
[0114]
在一些优选实施方案中，通常进行充分地混合以得到均匀的溶液体系，在混合和孵育过程中所述目标分析物会与第一偶联物及第二偶联物发生免疫反应。所述混合的方式，包括磁力搅拌、振荡、摇晃。一般选择孵育时间为1min至10min。
[0115]
在一些优选实施方案中，有利地，步骤s5中用于照射的激发光波长选自365-1532nm的范围。更优选地，激发光的波长为1064nm、980nm、915nm、808nm、785nm、830nm、808nm、785nm、730nm、680nm、630nm、532nm、488nm、450nm、405nm、365nm。
[0116]
优选地，可以在0.1ms～5s的照射时间后关闭激发光。由于在本发明的检测试剂组合物中包含长余辉发光材料，因此其可以在关闭光源之后的一段时间内持续发出长余辉信号。
[0117]
有利地，在上述步骤中，在激发光照射后产生长余辉发光，长余辉发光的中心波长为x，所述x选自400-800nm，更优选地，x选自645nm、615nm、545nm或450nm。
[0118]
在步骤s6中，收集时间段的长短设置为0.001s～300s，优选0.01s～60s。基于长余辉发光的机制且经过s4步骤的分离作用，有效地消除了检测体系的背景信号，而检测信号在一段时间内可持续，因此增加收集时间可以增强和放大检测信号，提高检测的信噪比。
[0119]
在具体的检测实施过程中，激发光源可以采用具有相应波长(如上述优选波长范围)的激光器。可以采用相同或不同的检测器来同时或分别检测长余辉信号值，只要它们具有能实现上述的长余辉信号收集功能。例如，在采用不同的检测器的情况下，第一检测器可以为硅光电池检测器，第二检测器可以为光电倍增管检测器。特别地，还可以通过在检测器前面增加滤光片的方法收集标记不同的长余辉组合物所产生的不同波长的长余辉发光信号，从而实现在同一个检测中联合检测更多的项目。
[0120]
在一种有利的实施方案中，所述检测步骤是基于长余辉发光宽场面成像信号采集技术，可以同时对多个样本进行便捷的快速检测。所述激发光源为点光源或面光源，优选面光源；所述检测器为光电倍增管阵列、硅光电池阵列、摄像头、相机、手机、ccd、emccd，优选摄像头、相机、手机、ccd、emccd。借助于拍照式宽场成像检测模式，通过一次成像即可获得包含多个测试容器的信号图像，从而高效地提高检测通量。
[0121]
有益效果：在本发明中，最终形成的长余辉免疫复合物被固定在测试容器的底板上，方便后续进行干扰物质的分离操作。在分离操作中，采用高密度油相分离液注入的方法，借助重力作用将与底板接触的水相溶液隔离至远离底板的容器上方，达到自然分离的效果，由此无需复杂的步骤即可去除非免疫结合作用产生的干扰。高密度油相的分离液沉至容器底部，为底板上固定的长余辉免疫复合物提供油相环境，有利于长余辉发光信号的
增强。在此基础上，借助长余辉发光面成像信号采集技术，一方面能够实现无背景的高质量检测，另一方面可以同时对多个样本进行便捷的快速检测。基于本发明的方法及系统，为开创高信噪比、高通量的长余辉均相检测提供了新的途径。
附图说明
[0122]
下面将以明确易懂的方式，结合附图说明优选实施方式，对一种长余辉均相检测方法及系统的上述特性、技术特征、优点及其实现方式予以进一步说明。
[0123]
图1是常规理想状态下的长余辉均相检测机理示意图；
[0124]
图2是长余辉均相检测在实际情况中的背景或干扰信号来源示意图；
[0125]
图3是本发明实施例中所形成的长余辉免疫复合物及各组分的分布示意图，其中图a/c和图b/d分别代表方形和圆形底板的情况，图a/b和图c/d分别代表敏化球分布在水相溶液中和发光球分布在水相溶液中的情况；
[0126]
图4是本发明实施例在测试容器中所形成的长余辉免疫复合物示意图，其中图a代表测试容器为样品测试比色皿，图b代表测试容器为样品测试杯；
[0127]
图5是本发明实施例在形成长余辉免疫复合物之后加入分离液以分离水相溶液至远离底板的示意图，与水相不互溶的分离液由于重力作用将水相排至测试容器上方；
[0128]
图6是本发明实施例中基于长余辉发光宽场面成像信号采集技术的示意图；
[0129]
图7是本发明实施例中长余辉面成像信号采集所得的图像以及其中单个测试容器对应信号部分的示意图；
[0130]
图8是本发明实施例中对多个测试容器进行分离液自动加液的装置盘示意图；
[0131]
图9是本发明实施例中功能化96孔板的图示，每个孔的底板集成了长余辉相关组分的发光膜组件；
[0132]
图10是本发明实施例中可拆卸的功能化12孔测试容器图示，其可组装在96孔板支架上；
[0133]
附图标号说明：1-发光膜，2-敏化膜，3-敏化球，31-第一偶联物，4-发光球，41-第二偶联物，5-目标分析物，6-测试容器，7-溶液，71-原溶液，72-分离液，8-光源，9-检测器，10-测试容器盘，11-面成像信号采集图像，111-单个测试杯位的信号分布图像，12-分离液加样盘，121-分离液加样孔。
具体实施方式
[0134]
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对照附图说明本发明的具体实施方式。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图，并获得其他的实施方式。
[0135]
实施例1
[0136]
如图1所示，在常规理想状态下的均相检测体系中，一般背景或干扰信号被忽略了。但是，在实际情况的均相检测体系中，却存在背景或干扰信号的来源(示意图如图2所示)，且通常难以消除。为了更明确地展示和分析，在本实施例中对这一在均相检测中普遍存在的问题进行了实验说明。
[0137]
以eu配合物(eu-complex-1分子)作为发光体和sof分子作为光化学缓存剂为例，制备含有受体组分的透明薄膜(如图3中b所示的发光膜)。将eu配合物和sof溶解在四氢呋喃中，其中eu配合物的浓度为50mm，sof的浓度为3mm。向1ml溶液中加入聚氨酯颗粒0.1g，充分搅拌使聚氨酯颗粒溶解并混匀。取0.1ml所得的溶液加入比色杯，避光烘干固化后在底板上成膜，再使用plasma等离子体进行表面处理，然后将第二偶联物偶联至膜的表面并使用bsa进行封闭处理，获得如图4所示意的含有发光膜的测试容器(例如圆形的比色杯)。与之相匹配地，敏化球为包含吸光剂pdpc的羧基化聚苯乙烯微球，其表面偶联有第一偶联物。第一偶联物和第二偶联物分别为血清淀粉样蛋白a(saa)的两种特异性抗体。
[0138]
上文提及的eu-complex-1、sof以及pdpc的结构式如下所示：
[0139][0140]
将敏化球分散在检测试剂的水相溶液组分中，然后加入目标分析物血清淀粉样蛋白a(saa，20mg/l)并混合均匀，取0.2ml所得的混合水溶液加入到上述含有发光膜的比色杯中，然后孵育10min。由此，所获得的比色杯及溶液体系的示意图如图4所示(例如圆形的比色杯)，为方便说明，标号为测试例1。
[0141]
重复以上测试例1的实验，区别在于将目标分析物saa替换为样本稀释液。由此，所获得的比色杯及溶液体系标号为测试例2。
[0142]
重复以上测试例1的实验，区别在于完成后再注入分离液1-溴十九氟壬烷0.2ml，分离液与水相不互溶且由于重力下沉至比色杯底部，使水相溶液分离至远离底板(示意图如图5所示)。由此，所获得的比色杯及溶液体系标号为测试例3。
[0143]
重复以上测试例3的实验，区别在于将目标分析物saa替换为样本稀释液。由此，所获得的比色杯及溶液体系标号为测试例4。
[0144]
使用730nm的激发光照射样本进行激发，然后收集长余辉发光信号。对于以上四个测试例，测试条件保持一致。测试例1、测试例2、测试例3、测试例4的信号值分别为92000、
15200、78000、500。测试例1(阳性)与测试例2(阴性，相当于背景)的信号比值为6，测试例3(阳性)与测试例4(阴性，相当于背景)的信号比值为156。对于测试例2，由于微球的自由扩散靠近或者物理吸附结合等因素，会使敏化球和发光膜之间的距离小于100nm甚至达到零距离接触的程度，会发生高效的长余辉发光而产生伪信号，这些因素是背景信号的主要来源。
[0145]
基于以上实验分析可见，分离液的注入很大程度上降低了背景干扰(信号由15200降为500)，基于分离液的作用起到了很好的分离效果，显著地提高了检测信噪比(由6提高至156)。
[0146]
实施例2
[0147]
以bodipy(bd-1分子)作为发光体和so分子作为光化学缓存剂为例，制备含有受体组分的透明薄膜(如图3中a所示的发光膜)。将bodipy和so溶解在甲苯中，其中bodipy的浓度为10mm，so的浓度为2mm。向1ml溶液中加入聚丙烯颗粒0.1g，充分搅拌使聚丙烯颗粒溶解并混匀。取0.1ml所得的溶液加入比色皿，避光烘干固化后在底板上成膜，再使用plasma等离子体进行表面处理，然后将第二偶联物偶联至膜的表面并使用bsa进行封闭处理，获得如图4所示意的含有发光膜的测试容器(例如方形的比色皿)。与之相匹配地，敏化球为包含吸光剂pdpc的羧基化聚苯乙烯微球，其表面偶联有第一偶联物。第一偶联物和第二偶联物分别为c反应蛋白(crp)的两种特异性抗体。
[0148]
上文提及的bd-1、so和pdpc的化学结构如下所示：
[0149][0150][0151]
将敏化球分散在检测试剂的水相溶液组分中，然后加入目标分析物c反应蛋白(crp，20mg/l)并混合均匀，取0.2ml所得的混合水溶液加入到上述含有发光膜的比色皿中，然后孵育10min。由此，所获得的比色皿及溶液体系的示意图如图4所示(例如方形的比色皿)，为方便说明，标号为测试例1。
[0152]
重复以上测试例1的实验，区别在于将目标分析物crp替换为样本稀释液。由此，所获得的比色皿及溶液体系标号为测试例2。
[0153]
重复以上测试例1的实验，区别在于完成后再注入分离液碘油0.3ml，分离液与水相不互溶且由于重力下沉至比色皿底部，使水相溶液分离至远离底板。由此，所获得的比色皿及溶液体系标号为测试例3。
[0154]
重复以上测试例3的实验，区别在于将目标分析物crp替换为样本稀释液。由此，所获得的比色皿及溶液体系标号为测试例4。
[0155]
使用730nm的激发光照射样本进行激发，然后收集长余辉发光信号。对于以上四个测试例，测试条件保持一致。测试例1、测试例2、测试例3、测试例4的信号值分别为41000、5700、35000、300。测试例1(阳性)与测试例2(阴性，相当于背景)的信号比值为7，测试例3(阳性)与测试例4(阴性，相当于背景)的信号比值为117。对于测试例2，由于微球的自由扩散靠近或者物理吸附结合等因素，会使敏化球和发光膜之间的距离小于100nm甚至达到零距离接触的程度，会发生高效的长余辉发光而产生伪信号，这些因素是背景信号的主要来源。
[0156]
基于以上实验分析可见，分离液的注入很大程度上降低了背景干扰(信号由5700降为300)，基于分离液的作用起到了很好的分离效果，显著地提高了检测信噪比(由7提高至117)。
[0157]
实施例3
[0158]
重复实施例1的实验操作，区别在于发光膜制备方法中的差异：将实施例1中plasma等离子体表面处理工艺替换为功能化涂层的表面涂布工艺。本实施例中的功能化涂层的表面涂布工艺是透明薄膜表面经过涂层的涂布并且被官能化，涂层也可防止染料泄露至聚合物之外的溶液中。透明薄膜表面可以包含被葡聚糖包裹的聚苯乙烯涂层，涂层可以用-nh2、-sh、-coh、-cooh和/或-co-or基团官能化，通过这些官能团与第二偶联物进行偶联。
[0159]
使用730nm的激发光照射样本进行激发，然后收集长余辉发光信号。对于本实施例所得的四个测试例，测试条件保持一致。测试例1、测试例2、测试例3、测试例4的信号值分别为61000、5500、56000、400。测试例1(阳性)与测试例2(阴性，相当于背景)的信号比值为11，测试例3(阳性)与测试例4(阴性，相当于背景)的信号比值为140。对于测试例2，由于微球的自由扩散靠近或者物理吸附结合等因素，会使敏化球和发光膜之间的距离小于100nm甚至达到零距离接触的程度，会发生高效的长余辉发光而产生伪信号，这些因素是背景信号的主要来源。
[0160]
基于以上实验分析可见，分离液的注入很大程度上降低了背景干扰(信号由5500降为400)，基于分离液的作用起到了很好的分离效果，显著地提高了检测信噪比(由11提高至140)。
[0161]
实施例4
[0162]
重复实施例2的实验操作，区别在于发光膜制备方法中的差异：将实施例2中plasma等离子体表面处理工艺替换为功能化涂层的表面涂布工艺。本实施例中的功能化涂层的表面涂布工艺：透明薄膜表面经过涂层的涂布并且被官能化，涂层也可防止染料泄露至聚合物之外的溶液中。透明薄膜表面可以包含被葡聚糖包裹的聚苯乙烯涂层，涂层可以
用-nh2、-sh、-coh、-cooh和/或-co-or基团官能化，通过这些官能团与第二偶联物进行偶联。
[0163]
使用730nm的激发光照射样本进行激发，然后收集长余辉发光信号。对于本实施例所得的四个测试例，测试条件保持一致。测试例1、测试例2、测试例3、测试例4的信号值分别为29000、4100、26000、200。测试例1(阳性)与测试例2(阴性，相当于背景)的信号比值为7，测试例3(阳性)与测试例4(阴性，相当于背景)的信号比值为130。对于测试例2，由于微球的自由扩散靠近或者物理吸附结合等因素，会使敏化球和发光膜之间的距离小于100nm甚至达到零距离接触的程度，会发生高效的长余辉发光而产生伪信号，这些因素是背景信号的主要来源。
[0164]
基于以上实验分析可见，分离液的注入很大程度上降低了背景干扰(信号由4100降为200)，基于分离液的作用起到了很好的分离效果，显著地提高了检测信噪比(由7提高至130)。
[0165]
实施例5
[0166]
以吸光剂pdpc分子作为吸光剂为例，制备含有供体组分的透明薄膜(如图3中d所示的敏化膜)。将pdpc溶解在甲苯中，其中pdpc的浓度为10μm。向1ml溶液中加入聚苯乙烯颗粒0.1g，充分搅拌使聚苯乙烯颗粒溶解并混匀。聚苯乙烯颗粒表面可以包括羧基、氨基、羧酸酯、卤基、酯基、羟基、碳酰胺、醛基、氯甲基、硫氧化物、氮氧化物、环氧基和/或甲苯磺酰基官能团，通过这些官能团与第一偶联物进行偶联。取0.1ml所得的溶液加入比色杯，避光烘干固化后在底板上成膜，然后将第一偶联物偶联至膜的表面并使用络蛋白进行封闭处理，获得如图4所示意的含有发光膜的测试容器。与之相匹配地，发光球为包含eu配合物(eu-complex-1分子)作为发光体和sof分子作为光化学缓存剂的醛基化聚苯乙烯微球，其表面偶联有第二偶联物。第一偶联物和第二偶联物分别为血清淀粉样蛋白a(saa)的两种特异性抗体。
[0167]
将敏化球分散在检测试剂的水相溶液组分中，然后加入目标分析物血清淀粉样蛋白a(saa，20mg/l)并混合均匀，取0.2ml所得的混合水溶液加入到上述含有发光膜的比色杯中，然后孵育10min。由此，所获得的比色杯及溶液体系的示意图如图4所示，为方便说明，标号为测试例1。
[0168]
重复以上测试例1的实验，区别在于将目标分析物saa替换为样本稀释液。由此，所获得的比色杯及溶液体系标号为测试例2。
[0169]
重复以上测试例1的实验，区别在于完成后再注入分离液全氟辛烷0.4ml，分离液与水相不互溶且由于重力下沉至比色杯底部，使水相溶液分离至远离底板。由此，所获得的比色杯及溶液体系标号为测试例3。
[0170]
重复以上测试例3的实验，区别在于将目标分析物saa替换为样本稀释液。由此，所获得的比色杯及溶液体系标号为测试例4。
[0171]
使用730nm的激发光照射样本进行激发，然后收集长余辉发光信号。对于以上四个测试例，测试条件保持一致。测试例1、测试例2、测试例3、测试例4的信号值分别为22000、6100、16000、400。测试例1(阳性)与测试例2(阴性，相当于背景)的信号比值为4，测试例3(阳性)与测试例4(阴性，相当于背景)的信号比值为40。对于测试例2，由于微球的自由扩散靠近或者物理吸附结合等因素，会使发光球和敏化膜之间的距离小于100nm甚至达到零距
离接触的程度，会发生高效的长余辉发光而产生伪信号，这些因素是背景信号的主要来源。
[0172]
基于以上实验分析可见，分离液的注入很大程度上降低了背景干扰(信号由6100降为400)，基于分离液的作用起到了很好的分离效果，显著地提高了检测信噪比(由4提高至40)。
[0173]
实施例6
[0174]
以eu配合物(eu-complex-2分子)作为发光体和socf分子作为光化学缓存剂为例，制备含有受体组分的发光膜。发光膜的基质为聚苯乙烯薄膜，其中eu-complex-2分子和socf分子的含量以发光膜的总质量计分别为8.5％和0.1％。聚苯乙烯薄膜含有羧基基团，然后借助于该功能基团将第二偶联物偶联至发光膜的表面并进行封闭处理，将发光膜附着在测试容器的底板上获得含有发光膜的测试容器。与之相匹配地，敏化球为包含吸光剂sipc的羧基化聚苯乙烯微球，其中sipc分子的含量以敏化球的总质量计为1.5％。敏化球表面偶联有第一偶联物。第一偶联物和第二偶联物分别为降钙素原(pct)的两种特异性抗体。
[0175]
上文提及的eu-complex-2、socf以及sipc的结构式如下所示：
[0176][0177]
将敏化球分散在检测试剂的水相溶液组分中，然后加入目标分析物降钙素原(pct，2ng/l)并混合均匀，取0.2ml所得的混合水溶液加入到上述含有发光膜的比色杯中，然后孵育10min。由此，所获得的比色杯及溶液体系为方便说明，标号为测试例1。
[0178]
重复以上测试例1的实验，区别在于将目标分析物pct替换为样本稀释液。由此，所获得的比色杯及溶液体系标号为测试例2。
[0179]
重复以上测试例1的实验，区别在于完成后再注入分离液1-溴十五氟庚烷0.2ml，分离液与水相不互溶且由于重力下沉至比色杯底部，使水相溶液分离至远离底板。由此，所
获得的比色杯及溶液体系标号为测试例3。
[0180]
重复以上测试例3的实验，区别在于将目标分析物pct替换为样本稀释液。由此，所获得的比色杯及溶液体系标号为测试例4。
[0181]
使用680nm的激发光照射样本进行激发，然后收集长余辉发光信号。对于以上四个测试例，测试条件保持一致。测试例1、测试例2、测试例3、测试例4的信号值分别为105000、23600、81900、700。测试例1(阳性)与测试例2(阴性，相当于背景)的信号比值为4，测试例3(阳性)与测试例4(阴性，相当于背景)的信号比值为117。对于测试例2，由于微球的自由扩散靠近或者物理吸附结合等因素，会使敏化球和发光膜之间的距离小于100nm甚至达到零距离接触的程度，会发生高效的长余辉发光而产生伪信号，这些因素是背景信号的主要来源。
[0182]
基于以上实验分析可见，分离液的注入很大程度上降低了背景干扰(信号由23600降为700)，基于分离液的作用起到了很好的分离效果，显著地提高了检测信噪比(由4提高为117)。
[0183]
实施例7
[0184]
重复实施例6，区别在于分离液更换为1-碘十七氟辛烷。结果表明，基于分离液的作用起到了很好的分离效果，分离液的注入很大程度上降低了背景干扰，显著地提高了检测信噪比(由4提高为115)。
[0185]
实施例8
[0186]
重复实施例6，区别在于分离液更换为1-溴十三氟己烷。结果表明，基于分离液的作用起到了很好的分离效果，分离液的注入很大程度上降低了背景干扰，显著地提高了检测信噪比(由4提高为121)。
[0187]
实施例9
[0188]
重复实施例6，区别在于分离液更换为1-碘十七氟辛烷。结果表明，基于分离液的作用起到了很好的分离效果，分离液的注入很大程度上降低了背景干扰，显著地提高了检测信噪比(由4提高为105)。
[0189]
实施例10
[0190]
重复实施例6，区别在于分离液更换为式1的离子液体。结果表明，基于分离液的作用起到了很好的分离效果，分离液的注入很大程度上降低了背景干扰，显著地提高了检测信噪比(由4提高为85)。
[0191]
实施例11
[0192]
重复实施例6，区别在于分离液更换为式2的离子液体。结果表明，基于分离液的作用起到了很好的分离效果，分离液的注入很大程度上降低了背景干扰，显著地提高了检测信噪比(由4提高为98)。
[0193]
实施例12
[0194]
首先，重复实施例6的实验以制备多个含有发光膜的比色杯测试容器。将4个比色杯靠近放置在样品架上(如示意图6所示的摆放形式)，使用光源照射对所有这些样本中的长余辉组合物进行激发充能。关闭激发光源，然后使用宽场面成像采集方式，同时对全部比色杯进行长余辉信号的收集。在本实施例中，长余辉信号采集的设备为摄像头，摄像头设置在比色杯底部的下方，可对全部比色杯所形成的宽场视野进行面成像。成像的曝光时间可
以设置为10ms至300s，在本实施例中选择持续10s的曝光以收集长余辉发光信号。通过对所采集的图像进行处理分析，可获得长余辉发光信号的强度分布图。如示意图7所示，在该面成像所得的图像中，每个比色杯所属区域的发光情况都能被记录。
[0195]
基于宽场面成像的信号采集技术，同时可以开展多个测试例的检测，且每个测试例都相当于独立的测试，相互之间不影响。基于此，可以对上述4个比色杯所测试的项目分别地进行设置。在本实施例中，4个测试例被设置为相同的pct检测项目，且样本中目标物浓度均为2ng/l。结果表明，4个测试均能进行检测，通过4个测试分析所获得的目标分析物浓度信息基本保持一致，偏差小于10％。由此说明，基于宽场面成像的长余辉均相检测技术具有很好的稳定性和重复性。
[0196]
实施例13
[0197]
重复实施例12，区别在于测试容器的更换：在本实施例中使用底部透明的96孔板取代4个测试杯进行长余辉均相的测试。
[0198]
在前述实施例12中，4个样本的测试只需要大约10s钟即可完成。在本实施例中以96孔板进行测试，将同时测试的比色杯数量提升至96个并不会明显增加测试时间，因为虽然测试样本数量增加但仍然只需要一次拍照成像即可获得所有测试信息，因此本发明的方法技术能够为提高长余辉均相测试的通量提供全新的思路和途径。另外，为了配合多样本的同时测试，在分离液的注入这一步骤中，可以使用全自动辅助加液装置(例如示意图8所示)。基于此，因此本发明的方法技术能够在高通量的长余辉均相测试中发挥作用。
[0199]
实施例14
[0200]
本发明也在进一步提高检测的通用性、技术的易推广程度、使用便利性等方面提供了方案。例如，针对目标分析物相同的检测项目，可以预先将发光膜或敏化膜集成到测试容器的底板上。在孔板中进行长余辉相关染料组分或薄膜的集成融合之后，孔板表面的蛋白标记(例如第一偶联物或第二偶联物)及封闭，可参考酶联免疫吸附剂测定(elisa)方法进行，该方法为通用的成熟方法。
[0201]
以96孔板为例，将发光膜功能组件预先集成到每个孔的底部，由此获得可兼容96个样本同时长余辉均相测试的功能化孔板(例如图9所示)。该功能化孔板采用统一的生产工艺制备，有效降低孔与孔或板与板之间的偏差，非常容易实现优异的体系质量控制。
[0202]
基于此，功能化孔板既可以作为相应目标分析物的通用测试容器又可以作为长余辉体系的通用组分，在使用过程中只需要使用全自动辅助装置统一添加敏化球试剂组分和分离液组分即可，如此可方便使用和推广。
[0203]
实施例15
[0204]
为了进一步提高检测的通用性、技术的易推广程度、使用便利性，在本实施例中，所制备的含有发光膜的比色杯测试容器设置成可拆卸组装至96孔板的12孔方式(例如图10所示)。基于次，可以在96孔板的板架上放置8种对应不同检测项目的12孔功能孔板，然后进行多项目快速长余辉成像检测。使用光源照射对所有这些96孔样本中的长余辉组合物进行激发充能。关闭激发光源，然后使用宽场面成像采集方式，同时对全部比色杯进行长余辉信号的收集。在本实施例中，长余辉信号采集的设备为制冷式ccd相机，相机设置在比色杯底部的下方，可对全部比色杯所形成的宽场视野进行面成像。成像的曝光时间可以设置为10ms至300s，在本实施例中选择持续30s的曝光以收集长余辉发光信号。通过对所采集的图
像进行处理分析，可获得长余辉发光信号的强度分布图。在该面成像所得的图像中，每个比色杯所属区域的发光情况都能被记录。
[0205]
基于宽场面成像的信号采集技术，同时可以开展多个测试例的检测，且每个测试例都相当于独立的测试，相互之间不影响。基于此，可以对4个比色杯所测试的项目分别地进行设置。在本实施例中，单一条形12个孔的测试例被设置为相同的检测项目，且样本中目标物浓度涵盖12个梯度；而全部8个孔板条(每个均含有12个孔位)被设置为8个不同的项目，对应于8个不同的目标分析物，分别为人绒毛膜促性腺激素、抗链球菌溶血素“o”、类风湿因子、甲胎蛋白、癌胚抗原、前列腺特异抗原、肌钙蛋白
‑ⅰ
、降钙素原。结果表明，96个测试均能进行检测，通过单条12个测试分析所获得的目标分析物浓度信息呈现出很好的线性，r方均大于0.99。由此说明，基于宽场面成像的长余辉均相检测技术具有很好的可扩展性，展示出广阔的应用前景。
[0206]
应当说明的是，上述实施例均可根据需要自由组合。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种长余辉均相检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：s1、提供长余辉均相检测试剂组合物和取样的待测样本；s2、将所述长余辉均相检测试剂组合物中的至少一部分预先附着在测试容器的底板上；s3、将所述待测样本和所述长余辉均相检测试剂组合物的剩余部分加入所述测试容器中进行孵育；s4、注入分离液，将水相溶液分离至远离底板；s5、用激发光照射分离后的检测液；s6、通过检测器采集长余辉发光信号；s7、根据所采集的长余辉发光信号值处理得到待测样本中目标分析物信息。2.如权利要求1所述的长余辉均相检测方法，其特征在于，所述长余辉均相检测试剂组合物包括敏化球和发光球，其中，所述敏化球表面连接有第一偶联物，且所述敏化球在光激发下产生单线态氧；其中，所述发光球表面连接有第二偶联物，且所述发光球与所述单线态氧反应产生长余辉发光信号。3.如权利要求2所述的长余辉均相检测方法，其特征在于，所述敏化球和所述发光球中的一种分散在液相试剂中，其中的另一种或者另一种球中的染料组分预先附着在所述底板上。4.如权利要求3中所述的长余辉均相检测方法，其特征在于，所述发光球或所述敏化球或者它们的染料组分预先附着在底板上的方式包括下述方式中的一种：所述发光球或所述敏化球或者它们的染料组分通过化学键、生物结合、免疫结合的相互作用连接至所述底板；或者，所述发光球或所述敏化球或者它们的染料组分掺杂在所述底板中；或者，所述发光球或所述敏化球或者它们的染料组分掺杂在透明薄膜中并固定在所述底板表面。5.如权利要求1所述的长余辉均相检测方法，其特征在于：所述分离液为凝胶溶液或油相液体，且所述分离液的密度大于水的密度。6.如权利要求1所述的长余辉均相检测方法，其特征在于：所述分离液为透明色，所述透明色为无色或浅色。7.如权利要求5所述的长余辉均相检测方法，其特征在于，所述油相液体包括二氯甲烷、三氯甲烷、四氯化碳、全氟溴烷、全氟碘烷、全氟化碳、碘油、离子液体中的一种或多种。8.如权利要求7所述的长余辉均相检测方法，其特征在于，所述全氟溴烷选自1-溴七氟丙烷、2-溴七氟丙烷、1-溴九氟丁烷、1-溴十一氟戊烷、1-溴十三氟己烷、1-溴十五氟庚烷、1-溴十七氟辛烷、1-溴十九氟壬烷中的一种或多种。9.如权利要求7所述的长余辉均相检测方法，其特征在于，所述全氟碘烷选自全氟碘乙烷、1-碘七氟丙烷、2-碘七氟丙烷、2-碘九氟丁烷、1-碘十一氟戊烷、1-碘十三氟己烷、1-碘十五氟庚烷、1-碘十七氟辛烷、1-碘十九氟壬烷中的一种或多种。10.如权利要求7所述的长余辉均相检测方法，其特征在于，所述全氟化碳选自全氟戊烷、全氟己烷、十六氟庚烷、十八氟辛烷、全氟壬烷、全氟癸烷、全氟环己烷、全氟(甲基环己
烷)中的一种或多种。11.如权利要求7所述的长余辉均相检测方法，其特征在于，所述离子液体选自如下式1和/或式2的结构：12.如权利要求2所述的长余辉均相检测方法，其特征在于，所述第一偶联物、所述第二偶联物能分别与所述目标分析物形成免疫复合物。13.如权利要求12所述的长余辉均相检测方法，其特征在于，所述第一偶联物和所述第二偶联物基于各自组分总重计的质量百分比含量为0.0006％～0.1％，优选为0.001％～0.05％。14.如权利要求2所述的长余辉均相检测方法，其特征在于，所述敏化球包括载体微球、供体组分或者由它们组成，所述发光球包括载体微球、受体组分或者由它们组成，其中，所述供体组分包括吸光剂，所述受体组分包括光化学缓存剂和发光剂。15.如权利要求1-14中任一项所述的长余辉均相检测方法，其特征在于，所述长余辉均相检测试剂组合物还包括免疫反应中常用的其他添加剂成分，优选为稀释样本的试剂、保持体系稳定的试剂。16.如权利要求1-14中任一项所述的长余辉均相检测方法，其特征在于，所述采集长余辉发光信号的模式包括长余辉发光面成像信号采集或扫描式信号采集；和/或，所述激发光的光源为点光源或面光源；和/或，所述检测器包括光电倍增管、硅光电池、摄像头、相机、手机、ccd、emccd中的一种。17.如权利要求1-14中任一项所述的长余辉均相检测方法，其特征在于，所述激发光的波长范围为365nm～1532nm，优选为1064nm、980nm、915nm、808nm、785nm、830nm、808nm、785nm、730nm、680nm、630nm、532nm、488nm、450nm、405nm或者365nm；优选地，所述激发光照射分离后的检测液的时间范围为0.1ms～5s；优选地，所述检测器采集长余辉发光信号的采集时间范围为0.001s～300s，更优选为0.01s～60s；优选地，所述孵育过程的时间范围为1min～10min；优选地，所述待测样本包括全血、尿液、末梢血、血清、血浆、体液、脑脊液中的一种或多种；优选地，所述待测样本中目标分析物信息包括分析物种类、浓度、ph值和成分中的一种或多种。

技术总结
本发明属于体外检测的技术领域，公开了一种长余辉均相检测方法。经过均相溶液中的免疫反应或结合作用，形成长余辉免疫复合物并将其固定在测试容器的底板上。首先，通过分离液注入的技术，有效地去除非免疫结合作用产生的干扰或影响。在此基础上，借助长余辉发光面成像信号采集技术，一方面能够实现无背景的高质量检测，另一方面可以同时对多个样本进行便捷的快速检测。本文所述的长余辉均相检测方法为开创高信噪比、高通量的长余辉均相检测提供了新的途径。的途径。的途径。


技术研发人员：李富友 石梅 徐明
受保护的技术使用者：复旦大学义乌研究院
技术研发日：2023.07.18
技术公布日：2023/9/16