一种用于快速PCR的微流控芯片及其应用的制作方法

一种用于快速pcr的微流控芯片及其应用
技术领域
1.本发明属于微流控核酸分析技术领域，具体涉及一种用于快速pcr的微流控芯片及其应用。


背景技术：

2.聚合酶链反应(polymerase chain reaction，pcr)用于扩增位于两段已知序列之间的dna片段，类似于天然dna的复制过程。以拟扩增的dna分子为模板，以一对分别与模板5’末端和3’末端互补的寡核苷酸片段为引物，在dna聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的dna合成，重复这一过程，即可使目的dna片段得到扩增。实时荧光定量pcr因其灵敏高、特异性强、窗口期短、成本较低的优点，已成为基因研究的关键技术，并广泛应用于食品安全检测、司法鉴定、宠物医疗、疫情防控等技术领域。
3.传统的pcr扩增常用孔版结构作为样本载体，存在着升温降温速度较慢，降温仅能依靠自然对流，导致需要耗费较长时间才能达到温度转换，加热片成本较高且易损坏，加上pcr灵敏度需求较高，容易受环境干扰。除此之外，对于反应物的需求量大，不利于降低成本。
4.因此，提供一种能大幅缩短升降温的时间、减少反应物用样、提高分析速度、降低成本及具有可抛弃性的快速pcr的微流控芯片具有重要的应用前景。


技术实现要素：

5.针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种用于快速pcr的微流控芯片及其应用。本发明所述微流控芯片能在短时间内完成pcr扩增反应，所述微流控芯片的使用方法操作简便，无需专业的设备及操作人员，具备低成本、低样品用量、高效率、可抛弃性等优势。
6.为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
7.第一方面，本发明提供一种用于快速pcr的微流控芯片，所述微流控芯片包括：微流控芯片本体和芯片上盖；
8.所述微流控芯片本体上存在凹槽，凹槽形成加样口1、反应区域2、气泡收集槽3；
9.所述气泡收集槽3包括第一连接通道31、第二连接通道32和气泡收集槽主体33。
10.本发明中，所述微流控芯片如图1所示：加样口1、反应区域2、气泡收集槽3。配套加热组件如图2所示：h代表高温区、l代表低温区。人工将样本由加样口1加入后进行入口封闭，样本进入反应区域2后，控制加热组件，使高温液体与低温液体产生自体循环(高温液体密度小、低温液体密度大)，藉由热对流的方式可达到pcr扩增效果。
11.除此之外，加热过程中液体会蒸发变成气泡，产生的气泡由于密度较小，会自行流动至室温区域的气泡收集槽3，如此便不会影响反应。倘若涉及到多段温度控制时，也可以采取多种加热组件做配套，以便精准进行温度控制。
12.本发明中，反应区域2中产生的微小气泡上升进入气泡收集槽3中，所述气泡收集
槽3的形状能够实现高效地收集气泡，减少反应区域2中的气泡残留。
13.优选地，所述微流控芯片本体由塑料材料制备得到。
14.优选地，所述芯片上盖由塑料材料制备得到。
15.优选地，所述加样口1用于将pcr反应液加入反应区域2。
16.优选地，所述反应区域2用于pcr反应液的自体循环，提供pcr扩增的场所；所述反应区域2中分为高温区反应区和低温区反应区，液体在重力和液体温度的作用下进行流动。
17.优选地，所述气泡收集槽3用于收集和储存反应区域2中pcr反应液在自体循环中产生的气泡。
18.第二方面，本发明提供一种用于快速pcr的微流控芯片装置，所述微流控芯片装置包括：第一方面所述的用于快速pcr的微流控芯片、温度控制单元、信号探测单元和数据处理及控制单元。
19.优选地，所述温度控制单元包括加热组件和温度传感器。
20.优选地，所述加热组件包括1-4个(例如可以是1个、2个、3个或4个)低温区和1-4个(例如可以是1个、2个、3个或4个)高温区；所述低温区和高温区交错分布；所述低温区的温度范围为15-50℃(例如可以是15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃或50℃等)；所述高温区的温度范围为65-150℃(例如可以是65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃、100℃、105℃、110℃、115℃、120℃、125℃、130℃、135℃、140℃、145℃或150℃等)。
21.优选地，所述温度传感器用于检测并输出反应区域2的温度。
22.优选地，所述温度控制单元与微流控芯片本体相贴合，温度控制单元用于对微流控芯片本体进行温度控制，改变微流控芯片本体中反应区域2的温度。
23.优选地，所述信号探测单元包括激发光源、光学传输单元和光电探测器组成；所述信号探测单元用于检测并输出反应区域2中的荧光信号。
24.优选地，所述数据处理及控制单元用于对温度控制单元和信号探测单元输出的数据进行处理、存储和显示。
25.优选地，所述加热组件由1个低温区和1个高温区组成；
26.或，所述加热组件由2个低温区和2个高温区组成；
27.或，所述加热组件由3个低温区和3个高温区组成；
28.或，所述加热组件由4个低温区和4个高温区组成。
29.本发明中，由于所述微流控芯片的截面是轴对称的，所以低温区可以位于微流控芯片的左侧，也可以位于微流控芯片的右侧；以低温区位于微流控芯片的左侧为例；所述加热组件由1个低温区和1个高温区组成时，加热组件的高温区的液体密度小，加热组件的低温区的液体体密度大，在重力和液体密度作用下，在反应区域2的下侧，液体由低温区向高温区流动，在反应区域2的上侧，液体由高温区向低温区流动，实现pcr扩增反应液的自体循环，在循环中实现pcr扩增。
30.本发明中，由于所述微流控芯片的截面是轴对称的，所以低温区1可以位于微流控芯片的左侧，也可以位于微流控芯片的右侧；以低温区1位于微流控芯片的左侧为例；所述加热组件由2个低温区和2个高温区组成时，低温区1位于反应区域2的左上侧，高温区1位于反应区域2的右上侧，低温区2位于反应区域2的右下侧，高温区2位于反应区域2的左下侧，低温区与高温区交替排布；温度大小排布为：高温区1＞高温区2＞低温区1＞低温区2；液体
密度大小排布为：低温区2＞低温区1＞高温区2＞高温区1；在反应区域2的左侧，在重力和液体密度作用下，液体由低温区1向高温区2流动，在反应区域2的上侧，液体由高温区1向低温区1流动，实现pcr扩增反应液的自体循环，在循环中实现pcr扩增。
31.本发明中，由于所述微流控芯片的截面是轴对称的，所以低温区可以位于微流控芯片的左侧，也可以位于微流控芯片的右侧；以低温区1位于微流控芯片的左侧为例；所述加热组件由3个低温区和3个高温区组成时，低温区1、高温区2和低温区3位于微流控芯片的左侧，高温区1、低温区2和高温区3位于微流控芯片的右侧；低温区与高温区交替排布；温度大小排布为：高温区1＞高温区2＞高温区3＞低温区1＞低温区2＞低温区3；液体密度大小排布为：低温区3＞低温区2＞低温区1＞高温区3＞高温区2＞高温区1；在重力和液体密度作用下，在反应区域2的左侧，液体由低温区1向高温区2流动；在反应区域2的下侧，液体由低温区3向高温区3流动，实现pcr扩增反应液的自体循环，在循环中实现pcr扩增。
32.本发明中，由于所述微流控芯片的截面是轴对称的，所以低温区可以位于微流控芯片的左侧，也可以位于微流控芯片的右侧；以低温区1位于微流控芯片的左侧为例；所述加热组件由4个低温区和4个高温区组成时，低温区1、高温区2、低温区3和高温区4位于微流控芯片的左侧，高温区1、低温区2、高温区3和低温区4位于微流控芯片的右侧。各区域的液体会根据其温度、密度进行流动，实现pcr反应。但是随着加热模块的增多，理论上有部分区域会出现流动死角，但是随着反应区其他温度区域液体的流动，也会进一步推动与之相邻的区域的液体流动，因此，理论上的流动死角的问题会被一定程度缓解。但是与含有3个或以下的加热组件的芯片相比而言，含有4个或以上的加热组件的芯片的扩增效果相对较差。
33.第三方面，本发明提供一种核酸扩增方法，包括：采用第二方面所述的用于快速pcr的微流控芯片装置进行扩增。
34.优选地，所述核酸扩增方法的步骤包括：
35.(a)将pcr扩增反应液通过加样口1注入微流控芯片本体，采用温度控制单元对微流控芯片本体进行温度控制，改变微流控芯片本体中反应区域2的温度；pcr扩增反应液在反应区域2产生自体循环达到pcr扩增效果，自体循环中产生的气泡沿液体流动方向进入气泡收集槽3；采用信号探测单元检测并输出反应区域2中的荧光信号；
36.(b)采用数据处理及控制单元对信号探测单元输出的数据进行处理、存储和显示。
37.本发明中，所述核酸扩增方法全程封闭式反应，可有效避免气融胶污染；采用温度控制单元进行温度控制，高温液体与低温液体会产生自体循环(高温液体密度小、低温液体密度大)，藉由热对流的方式可达到pcr扩增效果，简化了pcr流程，所述温度控制单元可以准确且多段式控制加热温度，可大幅缩短升降温的时间，提高分析速度；本发明所述微流控芯片对微量液体进行快速pcr检测，对于反应物的需求量低，能够最大程度的降低检测成本。
38.第四方面，本发明提供第一方面所述的用于快速pcr的微流控芯片和/或第二方面所述的用于快速pcr的微流控芯片装置在制备pcr检测产品中的应用。
39.本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
40.相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
41.(1)可于短时间内完成快速pcr。
42.(2)全程封闭式反应，可有效避免气溶胶污染。
43.(3)仅需少量液体(数微升)。
44.(4)低成本且不易损坏。
45.(5)可准确且多段式控制加热温度。
附图说明
46.图1是用于快速pcr的微流控芯片示意图，图中，1为加样口，2为反应区域，3为气泡收集槽，31为第一连接通道，32为第二连接通道，33为气泡收集槽主体。
47.图2是搭配快速pcr微流控芯片的加热组件图(2个加热组件)。
48.图3是搭配快速pcr微流控芯片的加热组件图(4个加热组件)。
49.图4是搭配快速pcr微流控芯片的加热组件图(6个加热组件)。
50.图5是搭配快速pcr微流控芯片的加热组件图(8个加热组件)。
51.图6是气泡收集槽为半圆形的微流控芯片。
52.图7是气泡收集槽为方形的微流控芯片。
53.图8是气泡收集槽为空心弧形的微流控芯片。
具体实施方式
54.下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
55.实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
56.实施例1一种用于快速pcr的微流控芯片
57.所述微流控芯片如图1所示，所述微流控芯片包括：微流控芯片本体和芯片上盖；所述微流控芯片本体上存在凹槽，凹槽形成加样口1、反应区域2、气泡收集槽3；所述气泡收集槽3包括第一连接通道31、第二连接通道32和气泡收集槽主体33。
58.所述微流控芯片本体由塑料材料制备得到。所述芯片上盖由塑料材料制备得到。
59.所述加样口1用于将pcr反应液加入反应区域2。
60.所述反应区域2用于pcr反应液的自体循环，提供pcr扩增的场所；所述反应区域2中分为高温区反应区和低温区反应区，液体在重力和液体温度的作用下进行流动。
61.所述气泡收集槽3用于收集和储存反应区域2中pcr反应液在自体循环中产生的气泡。
62.实施例2一种用于快速pcr的微流控芯片装置
63.所述微流控芯片装置包括：微流控芯片、温度控制单元、信号探测单元和数据处理及控制单元。
64.所述温度控制单元包括加热组件和温度传感器组成。所述加热组件包括1-4个低温区和1-4个高温区；所述低温区和高温区交错分布；所述低温区的温度范围为15-50℃；所述高温区的温度范围为65-150℃。所述温度传感器用于检测并输出反应区域2的温度；所述
温度控制单元与微流控芯片本体相贴合，温度控制单元用于对微流控芯片本体进行温度控制，改变微流控芯片本体中反应区域2的温度。
65.所述信号探测单元包括激发光源、光学传输单元和光电探测器组成；所述信号探测单元用于检测并输出反应区域2中的荧光信号。
66.所述数据处理及控制单元用于对温度控制单元和信号探测单元输出的数据进行处理、存储和显示。
67.实施例3人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒(pcr荧光探针法)
68.(1)取宫颈细胞样本(52岁、女性样本)转移至1ml/细胞保存液，13,000rpm离心10分钟，从无菌样本管中吸取1ml样本至1.5ml灭菌离心管，离心后吸取50μl至另一1.5ml灭菌离心管中，加入50μl核酸释放剂，充分混匀后作为待测样本备用。
69.(2)将10μl样本、38μl的pcr反应液(人乳头瘤病毒/16型、18型)、2μl酶混合液加入至pcr反应管，仪器采用stratagene mx3000p荧光定量pcr仪，循环参数设定为ung酶反应50℃、2分钟/1个循环、预变性95℃、10分钟/1个循环、变性95℃、10秒钟/45个循环、退火延伸55℃、45秒钟/45个循环，选择fam通道进行检测，ct值为33，报告结果为高危hpv阴性(对照组)。
70.(3)将10μl样本、38μl的pcr反应液(人乳头瘤病毒/16型、18型)、2μl酶混合液透过加样口1注入至反应区域2，采取搭配4个加热组件(h1：95℃、h2：75℃、l1：50℃、l2：40℃)，进行pcr扩增。报告荧光采用fam，ct值为35，报告结果为高危hpv阴性，与对照组结果一致。
71.实施例4验证加热模块的设计效用
72.本实施例基于taqman探针实时荧光pcr技术，在pcr反应过程中，同时利用taq酶的5
’→3’
聚合酶活性和核酸外切酶活性，使得taqman探针降解，荧光报告基团和淬灭基团分离使得荧光信号发射，fam荧光检测乙型肝炎病毒，joe/red 610nm波长通道检测内参。pcr反应液包含mgcl2溶液13μl、pcr缓冲液15μl、taq酶5μl、hbv引物探针10μl。将定量质控品7μl加入反应管中，低速离心数秒，取出置定量pcr仪上。仪器采用abi7500双信道仪器：反应管先在50℃反应2分钟，然后94℃保温5分钟，再按照94℃/10秒
→
60℃/45秒，共计循环40次。60℃采集fam、joe荧光通道的信号。透过软件自动计算得出，含有hbv dna含量7.2
×
107iu/ml(对照组)。
73.实验参数：采取三种不同设计的加热模块。
74.方案一：采取1个h加热模块(图2)，设定温度为95℃、1个l加热模块，设定温度为40℃，反应30分钟后，通过软件自动计算得出，含有hbv dna含量3.4
×
107iu/ml。
75.方案二：采取2个h加热模块(图3)，设定温度为95℃/85℃、2个l加热模块，设定温度为60℃/50℃，反应30分钟后，通过软件自动计算得出，含有hbv dna含量5.1
×
107iu/ml。
76.方案三：采取3个h加热模块(图4)，设定温度为95℃/85℃/75℃、2个l加热模块，设定温度为60℃/50℃/40℃，反应30分钟后，通过软件自动计算得出，含有hbv dna含量7.4
×
107iu/ml。
77.方案四：采取4个h加热模块(图5)，设定温度为95℃/90℃/85℃/80℃、2个l加热模块，设定温度为60℃/55℃/50℃/45℃，反应30分钟后，通过软件自动计算得出，含有hbv dna含量3.2
×
107iu/ml。
78.方案五：采取5个h加热模块，设定温度为95℃/90℃/85℃/80℃/75℃、2个l加热模
块，设定温度为60℃/55℃/50℃/45℃/40℃，反应30分钟后，通过软件自动计算得出，含有hbv dna含量1.8
×
107iu/ml。
79.上述结果显示，本发明能够缩短反应时间，并达到相同的检测效用。除此之外，采取多个加热模块能比单个加热模块更有效力，当加热模块为3组时，其扩增效果最好，当模块数量进一步增加时，其扩增量开始减少，说明模块的数量对扩增量的结果具有决定性影响。
80.实施例5气泡收集槽的设计效用
81.本实施例基于taqman探针实时荧光pcr技术，在pcr反应过程中，同时利用taq酶的5
’→3’
聚合酶活性和核酸外切酶活性，使得taqman探针降解，荧光报告基团和淬灭基团分离使得荧光信号发射，fam荧光检测乙型肝炎病毒，joe/red 610nm波长通道检测内参。pcr反应液包含mgcl2溶液13μl、pcr缓冲液15μl、taq酶5μl、hbv引物探针10μl。将定量质控品7μl加入反应管中，低速离心数秒，取出置定量pcr仪上。仪器采用abi7500双信道仪器：反应管先在50℃反应2分钟，然后94℃保温5分钟，再按照94℃/10秒
→
60℃/45秒，共计循环40次。60℃采集fam、joe荧光通道的信号。透过软件自动计算得出，含有hbv dna含量7.2*107iu/ml(对照组)。
82.实验组采取3个h加热模块，设定温度为95℃/85℃/75℃、2个l加热模块，设定温度为60℃/50℃/40℃，反应30分钟。考察不用形状的气泡收集槽的微流控芯片的扩增能力，每种方案进行10组平行实验。
83.方案一：微流控芯片如图1所示。
84.方案二：微流控芯片如图6所示，其中气泡收集槽为半圆形位于微流控芯片的顶部。
85.方案三：微流控芯片如图7所示，其中气泡收集槽为方形位于微流控芯片的顶部。
86.方案四：微流控芯片如图8所示，其中气泡收集槽为空心弧形位于微流控芯片的顶部。
87.采用带有不同形状的气泡收集槽的微流控芯片进行扩增检测的结果如表1所示。
88.表1
89.类型/结果对照方案一方案二方案三方案四dna含量iu/ml7.2
×
1077.4
×
1072.1
×
1071.8
×
1071.4
×
107rsd％5.6％5.97.68.98.8
90.上述结果显示，本发明中所述气泡收集槽的形状更加有利于气泡的收集，能够增加扩增量，改变形状后，气泡收集能力下降，导致扩增量降低；因此，气泡收集槽形状设计对微流控芯片也具有至关重要的作用。
91.综上，本发明提供了一种用于快速pcr的微流控芯片及其应用，所述微流控芯片可大幅缩短升降温的时间、减少反应物用样、提高分析速度、节约检测成本，具有广阔的应用前景。
92.申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

技术特征：
1.一种用于快速pcr的微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片包括：微流控芯片本体和芯片上盖；所述微流控芯片本体上存在凹槽，凹槽形成加样口(1)、反应区域(2)、气泡收集槽(3)；所述气泡收集槽(3)包括第一连接通道(31)、第二连接通道(32)和气泡收集槽主体(33)。2.根据权利要求1所述的用于快速pcr的微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片本体由塑料制备得到；优选地，所述芯片上盖由塑料制备得到。3.根据权利要求1或2所述的用于快速pcr的微流控芯片，其特征在于，所述加样口(1)用于将pcr反应液加入反应区域(2)；优选地，所述反应区域(2)用于pcr反应液的自体循环，提供pcr扩增的场所；所述反应区域(2)中分为高温区反应区和低温区反应区，液体在重力和液体温度的作用下进行流动。4.根据权利要求1-3中任一项所述的用于快速pcr的微流控芯片，其特征在于，所述气泡收集槽(3)用于收集和储存反应区域(2)中pcr反应液在自体循环中产生的气泡。5.一种用于快速pcr的微流控芯片装置，其特征在于，所述微流控芯片装置包括：权利要求1-4中任一项所述的用于快速pcr的微流控芯片、温度控制单元、信号探测单元和数据处理及控制单元。6.根据权利要求5所述的用于快速pcr的微流控芯片装置，其特征在于，所述温度控制单元包括加热组件和温度传感器；优选地，所述加热组件包括1-4个低温区和1-4个高温区；所述低温区和高温区交错分布；所述低温区的温度范围为15-50℃；所述高温区的温度范围为65-150℃；优选地，所述温度传感器用于检测并输出反应区域(2)的温度；优选地，所述温度控制单元与微流控芯片本体相贴合，温度控制单元用于对微流控芯片本体进行温度控制，改变微流控芯片本体中反应区域(2)的温度；优选地，所述信号探测单元包括激发光源、光学传输单元和光电探测器组成；所述信号探测单元用于检测并输出反应区域(2)中的荧光信号；优选地，所述数据处理及控制单元用于对温度控制单元和信号探测单元输出的数据进行处理、存储和显示。7.根据权利要求6所述的用于快速pcr的微流控芯片装置，其特征在于，所述加热组件由1个低温区和1个高温区组成；或，所述加热组件由2个低温区和2个高温区组成；或，所述加热组件由3个低温区和3个高温区组成；或，所述加热组件由4个低温区和4个高温区组成。8.一种核酸扩增方法，其特征在于，包括：采用权利要求5-7中任一项所述的用于快速pcr的微流控芯片装置进行扩增。9.根据权利要求8所述的核酸扩增方法，其特征在于，所述核酸扩增方法的步骤包括：(a)将pcr扩增反应液通过加样口(1)注入微流控芯片本体，采用温度控制单元对微流控芯片本体进行温度控制，改变微流控芯片本体中反应区域(2)的温度；pcr扩增反应液在反应区域(2)产生自体循环达到pcr扩增效果，自体循环中产生的气泡进入气泡收集槽(3)；
采用信号探测单元检测并输出反应区域(2)中的荧光信号；(b)采用数据处理及控制单元对信号探测单元输出的数据进行处理、存储和显示。10.权利要求1-4中任一项所述的用于快速pcr的微流控芯片和/或权利要求5-7中任一项所述的用于快速pcr的微流控芯片装置在制备pcr检测产品中的应用。

技术总结
本发明提供了一种用于快速PCR的微流控芯片及其应用，所述微流控芯片包括：微流控芯片本体和芯片上盖；所述微流控芯片本体上存在凹槽，凹槽形成加样口(1)、反应区域(2)、气泡收集槽(3)；所述气泡收集槽(3)包括第一连接通道(31)、第二连接通道(32)和气泡收集槽主体(33)。所述用于快速PCR的微流控芯片能在短时间内完成PCR扩增反应，所述微流控芯片的使用方法操作简便，无需专业的设备及操作人员，具备低成本、低样品用量、高效率和可抛弃性等优势。势。势。


技术研发人员：汪强虎 张若寒 吴维 林佳慧 裘佳晴 杨意枫
受保护的技术使用者：苏州国科均豪生物科技有限公司
技术研发日：2023.07.07
技术公布日：2023/9/14