一种甘蔗渣木质素酚基协同希瓦氏菌还原Cr(VI)的方法

一种甘蔗渣木质素酚基协同希瓦氏菌还原cr(vi)的方法
技术领域
1.本发明属于废物资源化利用和水处理技术领域，具体涉及甘蔗渣木质素酚基协同希瓦氏菌还原cr(vi)的方法。


背景技术：

2.自然界的铬主要存在于铬铅矿中，工业上的铬主要出现在皮革制造、电镀、木材防腐和纺织染料等领域。铬作为纯金属对环境没有不良影响。三价铬是人体和动物必需的微量元素。三价铬cr (iii)在水中常常以沉淀的形式存在且毒性低，而六价铬cr (vi)迁移性高，毒性大，且对生物有致癌、致畸和致突变的作用，因此铬及其化合物被世界卫生组织列为人类致癌物质，铬污染的问题长期困扰着人类。解决水环境中的铬污染迫在眉睫。cr (vi)和cr (iii)是铬离子在水溶液中最主要和最稳定的状态。因此大量研究都试图将高毒性的cr (vi)转化成低毒性的cr (iii)，但化学还原法易对水体造成二次污染，所以迫切需要寻找生物质材料参与cr (vi)的还原。
3.希瓦氏菌属是一种典型的异化金属还原微生物。属于弧菌科，呈棒状，是一种革兰氏阴性细菌。希瓦氏菌之所以引起环境微生物学界的关注，主要是希瓦氏菌可以以有毒重金属、放射性元素作为电子受体通过产能代谢和电子传递途径多样化，通过呼吸作用，将这些重金属还原解毒或还原固定。因此利用希瓦氏菌降解污染物成为研究的热门方向。
4.电子穿梭体（es）是一类可通过自身氧化还原介导电子转移的化学物质的统称。电子穿梭体广泛存在于自然界中，其作用是加速微生物向细胞外部进行的电子传递。希瓦氏菌本身具有分泌内生电子穿梭体如黄素腺嘌呤二核苷酸（fad）、核黄素（rf）、2,6-蒽二酚（fmn）等的功能，但其分泌含量较少，不足以满足希瓦氏菌高效还原目标污染物的需求。因此需要引入天然存在或人工合成的外源性电子穿梭体增强希瓦氏菌的还原能力。然而人工合成的外源性电子穿梭体价格较为昂贵。
5.我国作为世界上第三大甘蔗种植国，每年的甘蔗产量可达1000~1100万吨。甘蔗渣作为广西本地常见的制糖废弃物，其重量约为甘蔗重量的25%，其所含主要成分木质素正是一种可再生的酚型高分子聚合物。
6.所以在国内外大量研究都围绕单一甘蔗渣或单一希瓦氏菌去除cr (vi)的基础上，本发明提出利用甘蔗渣木质素中富含的多元酚来提高希瓦氏菌对cr (vi)的还原效率。生物还原法解决cr (vi)污染的同时有助于提高甘蔗渣废弃物的利用率，也为希瓦氏菌寻找一种具有良好生物相容性的天然电子穿梭体。本发明具有成本低、效果好、可再生等特性，有助于推动希瓦氏菌在环境修复领域的发展，为水环境中的cr (vi)修复提供一定的理论依据。


技术实现要素：

7.本发明的目的是提供一种甘蔗渣木质素酚基协同希瓦氏菌强化以乳酸钠作为电子供体还原cr(vi)的方法，通过条件优化得出甘蔗渣协同希瓦氏菌还原cr(vi)的最优条
件，对其进行物相与结构、成分组成以及形貌特征实验表征，本发明具有成本低、效果好、可再生等特性，有助于推动希瓦氏菌在环境修复领域的发展，为水环境中的cr (vi)修复提供一定的理论依据。
8.具体步骤为：
9.1.将充分洗去糖分的甘蔗渣在60℃的电热鼓风干燥箱中烘至恒重（约24h）后粉碎，再过60目筛备用；
10.2.制备希瓦氏菌菌液：
11.（1）从低温条件下保存的冻存管中取出希瓦氏菌菌种（希瓦氏菌菌种为s. oneidensis mr-1菌剂），30℃下解冻后，无菌条件下用接种环取少量菌种置于在121℃下灭菌30 min的10 ml lb液体培养基中，随后用封口膜将接种后的lb液体培养基封口，在35℃、150 r/min条件下活化15~22 h至细菌生长稳定期，得到希瓦氏活化菌。
12.（2）在无菌操作台中，取2ml希瓦氏活化菌菌液接种至100ml lb液体培养基中，培养的温度为25~45℃，时间为0～7天，等到希瓦氏菌菌液。所得希瓦氏菌菌液的液体od600保持在2以上。
13.3.在锥形瓶中加入由权利要求1和2制得的希瓦氏菌菌液（0ml至4ml）和甘蔗渣（0.1g至2g）、20 mm乳酸钠、10mg/l至50mg/l的cr (vi)溶液，并用naoh溶液和hcl溶液调节ph 5至9，控制反应总体积为100 ml，置于150 r/min的恒温摇床中反应7d，实现s. oneidensis mr-1以乳酸钠为电子供体，将获得的电子传递给木质素中的活性基团酚羟基，酚羟基还原cr (vi)，从而提高s. oneidensis mr-1还原cr (vi)的效率。。
14.本发明具有成本低、效果好、可再生等特性，有助于推动希瓦氏菌在环境修复领域的发展，为水环境中的cr (vi)修复提供一定的理论依据。
附图说明
15.图1为本发明产品扫描电子显微镜镜检图（sem，a：
×
20k；b：
×
20k；a：
×
20k；d：eds）。
16.图2为本发明产品红外光谱图（fi-ir）。
17.图3为本发明产品氧化还原电位图（cv）。
18.图4为本发明产品紫外可见光谱图（dt-uv/vis）。
19.图5为本发明不同ph值条件下，产品对六价铬去除率变化图。
20.图6为本发明不同初始浓度条件下，产品对六价铬去除率变化图。
21.图7为本发明不同菌体投加量条件下，产品对六价铬去除率变化图。
22.图8为本发明不同甘蔗渣投加量条件下，产品对六价铬去除率变化图。
23.图9为本发明不同温度条件下，产品对六价铬去除率变化图。
具体实施方式
24.实施例1：
25.一、甘蔗渣和希瓦氏菌的预处理：
26.1.将充分洗去糖分的甘蔗渣在60℃的电热鼓风干燥箱中烘至恒重（约24h）后粉碎，再过60目筛备用；
27.2.制备希瓦氏菌菌液：
28.（1）从低温条件下保存的冻存管中取出希瓦氏菌菌种（希瓦氏菌菌种为s. oneidensis mr-1菌剂），30℃下解冻后，无菌条件下用接种环取少量菌种置于在121℃下灭菌30 min的10 ml lb液体培养基中，随后用封口膜将接种后的lb液体培养基封口，在35℃、150 r/min条件下活化15~22 h至细菌生长稳定期，得到希瓦氏活化菌。
29.（2）在无菌操作台中，取2ml希瓦氏活化菌菌液接种至100ml lb液体培养基中，培养的温度为25~45℃，时间为0～7天，等到希瓦氏菌菌液。所得希瓦氏菌菌液的液体od600保持在2以上。
30.反应前后甘蔗渣+希瓦氏菌复合体的物相与结构、成分组成以及形貌特征采用扫描电子显微镜（sem/eds）、傅立叶变换红外光谱仪（ft-ir）、氧化还原电位（cv）和紫外可见光谱（dt-uv/vis）进行观察测试。
31.二、ph值对甘蔗渣协同希瓦氏菌去除cr(vi)影响：
32.（1）用移液管分别移取100ml初始浓度为20mg/l的cr(vi)溶液编号装瓶于250ml锥形瓶中备用；
33.（2）用hcl和naoh分别调节待处理液ph值为5、6、7、8、9；
34.（3）每瓶待处理液中分别加入2 ml细菌浓度od600为2.5的希瓦氏菌菌液、20 mm的乳酸钠和1g甘蔗渣，加塞后以150r
·
min-1
的振荡速度进行恒温水浴振荡，反应时间为7d，温度控制在35℃；
35.（4）取步骤（3）产物离心、过滤，使用紫外线分光光度法测定滤液吸光度，获得在不同ph值条件下甘蔗渣和希瓦氏菌对cr(vi)的去除效果，如图5所示。
36.三、初始浓度对甘蔗渣协同希瓦氏菌去除cr(vi)影响：
37.（1）用移液管分别移取100ml初始浓度为10、20、30、40、50mg/l的cr(vi)溶液编号装瓶于250ml锥形瓶中备用；
38.（2）用hcl和naoh分别调节待处理液ph值为7；
39.（3）每瓶待处理液中分别加入2 ml细菌浓度od600为2.5的希瓦氏菌菌液、20 mm的乳酸钠和1g甘蔗渣，加塞后以150r
·
min-1
的振荡速度进行恒温水浴振荡，反应时间为7d，温度控制在35℃；
40.（4）取步骤（3）产物离心、过滤，使用紫外线分光光度法测定滤液吸光度，获得在不同初始浓度条件下甘蔗渣和希瓦氏菌对cr(vi)的去除效果，如图6所示。
41.四、菌体投加量对甘蔗渣协同希瓦氏菌去除cr(vi)影响：
42.（1）用移液管分别移取100ml初始浓度为20mg/l的cr(vi)溶液编号装瓶于25ml锥形瓶中备用；
43.（2）用hcl和naoh分别调节待处理液ph值为7；
44.（3）每瓶待处理液中分别加入0 ml、0.5 ml、1 ml、2 ml和4 ml细菌浓度od600为2.5的希瓦氏菌菌液、20 mm的乳酸钠和1g甘蔗渣，加塞后以150r
·
min-1的振荡速度进行恒温水浴振荡，反应时间为7d，温度控制在35℃；
45.（4）取步骤（3）产物离心、过滤，使用紫外线分光光度法测定滤液吸光度，获得在不同甘蔗渣投加量条件下产品对cr(vi)的去除效果，如图7所示。
46.五、甘蔗渣投加量对甘蔗渣协同希瓦氏菌去除cr(vi)影响：
47.（1）用移液管分别移取100ml初始浓度为20mg/l的cr(vi)溶液编号装瓶于250ml锥形瓶中备用；
48.（2）用hcl和naoh分别调节待处理液ph值为7；
49.（3）每瓶待处理液中分别加入0.1 g、0.5 g、1.0 g、1.5 g和2.0 g甘蔗渣，加塞后以150r
·
min-1
的振荡速度进行恒温水浴振荡，反应时间为7d，温度控制在35℃；
50.（4）取步骤（3）产物离心、过滤，使用紫外线分光光度法测定滤液吸光度，获得在不同甘蔗渣投加量条件下产品对cr(vi)的去除效果，如图8所示。
51.六、温度对甘蔗渣协同希瓦氏菌去除cr(vi)影响：
52.（1）用移液管分别移取100ml初始浓度为20mg/l的cr(vi)溶液编号装瓶于25ml锥形瓶中备用；
53.（2）用hcl和naoh分别调节待处理液ph值为7；
54.（3）每瓶待处理液中分别加入2 ml细菌浓度od600为2.5的希瓦氏菌菌液、20 mm的乳酸钠和1g甘蔗渣，加塞后以150r
·
min-1
的振荡速度进行恒温水浴振荡，反应时间为7d，温度分别控制在25℃、35℃、45℃；
55.（4）取步骤（3）产物离心、过滤，使用紫外线分光光度法测定滤液吸光度，获得在不同温度条件下产品对cr(vi)的去除效果，如图9所示。
56.以上对反应前后的甘蔗渣、希瓦氏菌成分分析、红外光谱分析、紫外可见光谱分析、扫描电镜分析、x射线衍射分析、x射线能谱分析和三维荧光光谱分析等研究，分析得出s. oneidensis mr-1可以以乳酸钠为电子供体，将获得的电子传递给木质素中的活性基团酚羟基，酚羟基还原cr (vi)，提高s. oneidensis mr-1还原cr (vi)的效率。

技术特征：
1.一种甘蔗渣木质素酚基协同希瓦氏菌还原cr(vi)的方法，其特征在于，具体步骤为：步骤一，将充分洗去糖分的甘蔗渣在60℃的电热鼓风干燥箱中烘至恒重（约24h）后粉碎，再过60目筛备用；步骤二，制备希瓦氏菌菌液：（1）从低温条件下保存的冻存管中取出希瓦氏菌菌种（希瓦氏菌菌种为s. oneidensis mr-1菌剂），30℃下解冻后，无菌条件下用接种环取少量菌种置于在121℃下灭菌30 min的10 ml lb液体培养基中，随后用封口膜将接种后的lb液体培养基封口，在35℃、150 r/min条件下活化15~22 h至细菌生长稳定期，得到希瓦氏活化菌；（2）在无菌操作台中，取2ml希瓦氏活化菌菌液接种至100ml lb液体培养基中，培养的温度为25~45℃，时间为0～7天，等到希瓦氏菌菌液；所得希瓦氏菌菌液的液体od600保持在2以上；步骤三，在锥形瓶中加入由权利要求1和2制得的希瓦氏菌菌液（0ml至4ml）和甘蔗渣（0.1g至2g）、20 mm乳酸钠、10mg/l至50mg/l的cr (vi)溶液，并用naoh溶液和hcl溶液调节ph5至9，控制反应总体积为100 ml，置于150 r/min的恒温摇床中反应7d，实现甘蔗渣中具有较强还原性的酚羟基协同s. oneidensis mr-1还原cr(vi)。

技术总结
本发明公开了一种甘蔗渣木质素酚基协同希瓦氏菌还原Cr(VI)的方法。通过优化实验发现引入甘蔗渣木质素酚基协同希瓦氏菌，有效增强希瓦氏菌对Cr(VI)的还原效果。以实现对水环境Cr(VI)污染的修复，修复过程在好氧条件下进行，修复时间为7天，在最适温度、pH、Cr(VI)浓度即温度35℃、pH为7、Cr(VI)初始浓度20mg/L的条件下，三天内甘蔗渣+希瓦氏菌+乳酸钠对Cr(VI)的还原能力接近90%。本发明具有成本低、效果好、可再生等特性，有助于推动希瓦氏菌在环境修复领域的发展，为水环境中的Cr(VI)修复提供一定的理论依据。一定的理论依据。一定的理论依据。


技术研发人员：陆燕勤 邹承恩 史成科 许立巍 陈文文
受保护的技术使用者：桂林理工大学
技术研发日：2023.07.11
技术公布日：2023/9/19