FOXM1抑制剂在制备抗心力衰竭药物中的应用

foxm1抑制剂在制备抗心力衰竭药物中的应用
技术领域
1.本发明涉及foxm1抑制剂在制备抗心力衰竭药物中的应用，属于生物医药技术领域。


背景技术：

2.心脏压力超负荷状态普遍存在于多种心血管疾病中，其中以高血压及心脏瓣膜疾病尤为突出。改善这些患者心脏压力超负荷状态，对改善患者预后具有重要意义。有研究表明，持续压力超负荷状态可引起心肌肥厚，主要表现为心肌纤维化和心肌细胞肥大，还可诱导炎症反应，而炎症反应进一步引起心肌细胞损伤，最终导致心脏重构。同时，压力超负荷状态不仅影响心脏结构的改变，还可通过影响心肌细胞能量代谢，降低心脏的舒张和收缩功能。在心脏压力超负荷状态下，机体主要通过调控特定的生长因子、基因、受体、蛋白及离子通道的表达或者依靠自身保护因子的机制来对抗心脏重构、改善心功能。目前，针对压力超负荷导致的心脏重构和心力衰竭临床上尚缺乏有效的预防和治疗手段。因此，寻找阻止压力超负荷导致心力衰竭的特异性分子以及分子通路，寻找防治心力衰竭的药物靶点具有非常重要的理论和临床意义。
3.foxm1(forkhead box protein m1)是一种转录因子，隶属于forkhead家族中的m亚家族，作为关键的细胞周期调控因子和增殖相关基因，已被证实在调控dna复制和细胞周期进展中发挥重要作用，也参与dna损伤检查点反应和dna断裂修复。然而，关于foxm1在压力负荷性心力衰竭中的作用目前尚未见相关报道。


技术实现要素：

4.本发明的目的是：针对目前心脏压力负荷性心力衰竭临床上尚无十分有效的防治方法，本发明旨在通过靶向抑制foxm1改善心脏压力超负荷导致的心力衰竭，结果表明，通过给予foxm1抑制剂fdi-6能够减轻tac诱导的心肌纤维化和心肌肥厚，显著改善心功能异常。
5.为了实现上述目的，本发明提供了抑制foxm1表达或活性的试剂在制备抗心力衰竭药物中的应用，所述心力衰竭指的是压力负荷性心力衰竭；例如由高血压、主动脉缩窄等压力负荷导致的心力衰竭。
6.优选地，所述抑制foxm1表达或活性的试剂包括小分子foxm1抑制剂。
7.优选地，所述foxm1抑制剂为fdi-6，其化学结构式如下所示：
[0008][0009]
长期的高血压、主动脉狭窄等压力负荷性刺激会诱发心力衰竭，但这一过程往往
会伴随着心脏重构的发生。心肌纤维化和心肌肥厚等病理性重构严重影响心脏的收缩和舒张功能，加速心力衰竭的进展。因此，本发明着眼于靶向抑制foxm1这一转录因子，抑制心肌成纤维细胞的激活，防止成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化，阻断心脏重构的关键环节，改善心脏功能。
[0010]
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
[0011]
本发明通过foxm1特异性抑制剂fdi-6抑制心脏成纤维细胞中的foxm1活性，抑制成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化，减轻心肌纤维化和心肌肥厚，显著改善横向主动脉弓缩窄(transverse aortic constriction，tac)诱导的心功能异常；本发明的结果表明，对于临床上压力负荷性心力衰竭的病人给予foxm1抑制剂能够阻断心脏重构，改善心脏收缩和舒张功能，提高患者的生活质量和远期预后，具有重要的临床意义。
附图说明
[0012]
图1为动物体内给予foxm1抑制剂fdi-6处理实验方案的流程图；
[0013]
图2展示了foxm1抑制剂fdi-6可以改善tac引起的心肌重构和心功能恶化的结果；a：动物模型构建流程；b：m型超声结果显示，fdi-6可以改善tac引起的心功能恶化；c：fdi-6可以提高心衰小鼠的射血分数(ef％)和缩短分数(fs％)；d-e：fdi-6可以降低心重/体重(hw/bw)和肺重/胫骨长度(lw/tl)；f：天狼猩红显示各组小鼠纤维化程度及定量情况；g：wga显示各组小鼠心肌细胞肥大程度及定量情况；h：western blot检测不同处理组小鼠心脏匀浆中蛋白的表达及定量情况；i：不同处理组小鼠心脏分离的成纤维细胞α-sma免疫荧光染色和定量情况，检测成纤维细胞活化程度；j：各组小鼠分离的成年成纤维细胞的迁移和定量情况；k：各组小鼠分离的成年成纤维细胞的收缩能力情况；l：western blot检测提取各组小鼠分离的成年成纤维细胞中蛋白的表达情况；
[0014]
图3展示了foxm1抑制剂fdi-6对于心、肝、肾等重要脏器没有明显毒副作用；a：fdi-6给药后不影响小鼠血清ast和alt浓度；b：fdi-6给药后不影响小鼠血清ldh和ck浓度；c：fdi-6给药后不影响小鼠血清肌酐浓度；d：fdi-6给药后不影响小鼠体重和心率；e-f：he染色表明fdi-6给药后不影响小鼠肝脏和肾脏组织学形态。
具体实施方式
[0015]
为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。
[0016]
以下实施例中涉及的小鼠购自上海杰思捷实验动物有限公司，foxm1特异性抑制剂fdi-6购自mce(medchemexpress)公司，动物实验已通过复旦大学附属中山医院伦理委员会批准。
[0017]
foxm1特异性抑制剂fdi-6的化学结构式如下：
[0018][0019]
实施例
[0020]
本实施例提供了foxm1抑制剂在抗压力负荷性心力衰竭中的应用：
[0021]
(一)实验方法
[0022]
1、主动脉弓缩窄模型(tac模型)的构建
[0023]
使用雄性c57bl/6野生型小鼠(6-8周大，wt型)。腹腔注射1％戊巴比妥钠0.15ml麻醉小鼠。用眼科剪在小鼠颈部和胸部中线位置纵向切开皮肤0.5～1cm，使用眼科镊轻轻分离结缔组织和气管中线两侧肌肉。用眼科剪从锁骨处开始切至第二肋骨(约5mm)。使用显微镊将胸腺两叶彼此分离，此时可清晰看到主动脉弓和两条颈动脉。用显微镊从左颈总动脉和右无名动脉之间，主动脉弓下方轻轻穿过，夹住6-0尼龙缝合线小心拉出。将自制l型26g垫针防至主动脉弓旁，将主动脉弓与l型垫针结扎固定，打三个结确保结扎稳固，小心抽去垫针。主动脉弓狭窄成功后可观察到右颈总动脉搏动显著增强。简单间断缝合肌肉和皮肤，碘伏消毒伤口后置于保温台上恢复，苏醒后放回笼具。假手术组方法一致，只穿线不结扎。
[0024]
2、小鼠心脏超声
[0025]
小鼠脱毛后，采用面罩给异氟烷麻醉，剂量为1％-2％，之后固定在加热垫上()。小心控制异氟醚流量，使心率维持在450次/分左右。
[0026]
采用配备30mhz线性换能器的二维(2-d)引导m型超声心动图(visualsonics vevo 2100，加拿大)评估心脏的几何结构和功能。获得胸骨旁长轴视图，同时记录心率。得到心脏几何形状和功能指标：射血分数(ef)、缩短分数(fs)。每个测量指标至少经过5个连续的心脏周期取平均值。
[0027]
3、天狼猩红染色
[0028]
心肌组织分离，福尔马林固定，并石蜡包埋，切片厚度为6-7μm。天狼星红染色液滴染1h，流水稍微冲洗，去除切片表面染液，之后苏木素染色液染核8～10min，流水冲洗10min。常规脱水透明，中性树胶封固。在光学显微镜下观察，胶原纤维呈红色，细胞核蓝色，其他成分呈黄色。并计算胶原体积分数(cvf)，计算公式：cvf(％)＝平均胶原面积/总区面积
×
100％。
[0029]
4、foxm1抑制剂fdi-6实验(方案流程如图1所示)
[0030]
(1)c57bl/6小鼠随机分组，tac组构建主动脉弓缩窄模型，sham组只穿线不结扎。
[0031]
(2)手术后3天随机分组，处理组给予20mg/kg/day的fdi-6，采用腹腔注射，每天一次。对照组注射pbs，注射方法和频率与实验组保持一致。连续给药28天。
[0032]
(3)给药结束后小鼠心脏超声检测心功能，测量心重/体重(hw/bw)和肺重/胫骨长度(lw/tl)指标评估心脏肥厚和心衰情况，he染色、天狼猩红染色以及wga染色检测心肌纤维化和心肌细胞肥大水平，western blot检测细胞外基质蛋白(fibronectin/collagenⅰ/α-sma/galectin-3/anp/bnp)的表达情况，从不同处理组小鼠心脏分离的成纤维细胞进行α-sma免疫荧光染色、transwell及凝胶收缩实验检测成纤维细胞活化情况及迁移、收缩能力，western blot检测细胞(α-sma/fibronectin/collagenⅰ)的表达情况。
[0033]
(二)实验结果
[0034]
1.横向主动脉弓缩窄(tac)诱导心衰模型的建立及给药方式如图2a所示。对不同干预组小鼠施行心脏超声检测，以小鼠左心室心肌射血分数(ef％)和左心室短轴缩短率(fs％)指标评估不同干预组小鼠心功能。如图2b和2c所示，结果显示，与对照组sham相比，tac组小鼠的心肌ef值和fs值显著降低，foxm1特异性抑制剂fdi-6能够显著增加tac后的ef
和fs值。
[0035]
2.心肌纤维化和心肌细胞肥大是心脏重构的重要特征。实验中通过测量心重/体重(hw/bw)和肺重/胫骨长度(lw/tl)指标评估不同处理组的心肌细胞肥大和心衰情况，通过天狼猩红染色实验评估不同处理组的心肌纤维化，wga染色实验评估心肌细胞肥大水平。结果显示，与对照组相比，foxm1特异性抑制剂fdi-6能够显著减轻tac引起的心肌纤维化和心肌细胞肥大(图2d-g)。
[0036]
3.fibronectin、collagenⅰ、α-sma、galectin-3等细胞外基质蛋白是评估心肌纤维化的重要指标，anp和bnp水平是评估心力衰竭程度的重要指标。采用western blot检测了fibronectin、collagenⅰ、α-sma、galectin-3的表达情况。研究结果显示，与对照组相比，foxm1特异性抑制剂fdi-6能够显著降低fibronectin、collagenⅰ、α-sma、galectin-3、anp和bnp的表达量(图2h)。
[0037]
4.α-sma(acta2)是6种不同肌动蛋白亚型之一，参与平滑肌的收缩，目前被认为是肌成纤维细胞的标志。心肌重构过程牵涉心肌成纤维细胞增殖和迁移。实验中通过免疫荧光、transwell及凝胶收缩实验检验从不同处理组小鼠心脏分离的成纤维细胞的α-sma表达情况及成纤维细胞的迁移、收缩能力。研究结果显示，与对照组相比，foxm1特异性抑制剂fdi-6能够显著降低成纤维细胞α-sma表达量，减弱成纤维细胞的迁移、收缩能力(图2i-k)。
[0038]
5.α-sma、fibronectin、collagenⅰ等细胞外基质蛋白是反映心肌纤维化的重要指标，α-sma还是反映成纤维细胞向肌成纤维细胞转化程度的重要指标。采用western blot检测不同处理组小鼠心脏分离的成纤维细胞fibronectin、collagenⅰ、α-sma的表达情况。研究结果显示，与对照组相比，foxm1特异性抑制剂fdi-6能够显著降低α-sma、fibronectin和collagenⅰ的表达量(图2l)。
[0039]
6.ast、alt是反应肝功能的重要血清指标；ldh、ck是反应心肌损伤的重要血清指标；血肌酐是反应肾功能的重要血清指标。采用试剂盒检测不同处理组小鼠血清ast、alt、ldh、ck、肌酐、体重、心率，采用he染色检测不同处理组小鼠肝肾组织学形态。研究结果显示，foxm1特异性抑制剂fdi-6对于小鼠心、肝、肾无明显毒副作用(图3a-f)。
[0040]
上述实施例仅为本发明的优选实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的前提下，还可做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.抑制foxm1表达或活性的试剂在制备抗心力衰竭药物中的应用，所述心力衰竭指的是压力负荷性心力衰竭。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抑制foxm1表达或活性的试剂包括小分子foxm1抑制剂。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述foxm1抑制剂为fdi-6，其化学结构式如下所示：

技术总结
本发明公开了FOXM1抑制剂在制备抗心力衰竭药物中的应用。本发明通过使用FOXM1特异性抑制剂FDI-6抑制心脏成纤维细胞中的FOXM1活性，发现抑制FOXM1能够抑制成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化，减轻心肌纤维化和心肌肥厚，显著改善横向主动脉弓缩窄(transverse aortic constriction，TAC)诱导的心功能异常；本发明的结果表明，对于临床上压力负荷性心力衰竭的病人给予FOXM1抑制剂能够阻断心脏重构，改善心脏收缩和舒张功能，提高患者的生活质量和远期预后，具有重要的临床意义。具有重要的临床意义。具有重要的临床意义。


技术研发人员：葛均波 孙爱军 宋帅 张晓凯 黄子航 曾琳淇
受保护的技术使用者：复旦大学附属中山医院
技术研发日：2023.07.03
技术公布日：2023/9/19