一种类器官模型的制备方法

1.本发明涉及细胞生物学技术领域，特别涉及一种类器官模型的制备方法。


背景技术：

2.疾病模型或材料更能反映生理肿瘤研究长期以来一直在寻找真实患者肿瘤的特征。为了更好地概括病人的癌症，各种疾病模型被开发出来。2d生长的原代细胞体外培养丧失了肿瘤体内的形态，而模式细胞系的三维(3d)培养缺少亲本体内肿瘤异质性的特征，依赖于病人起源的原代肿瘤细胞培养技术发明的肿瘤类器官保持了原发肿瘤的分子学、基因学和病理学特征，既有体内肿瘤药敏的优点也保留了体外传统药敏试验的优点，为肿瘤的个体化治疗提供了比较好的模型。
3.但在现有技术中，肿瘤类器官还存在着培养成功率低的问题，因此需要寻找一种细胞培养成功率高的肿瘤类器官模型。


技术实现要素：

4.本发明的一个方面，是针对现有技术中的肿瘤类器官培养成功率低的问题，提供了一种类器官模型的制备方法。
5.本发明提供的技术方案为：
6.一种类器官模型的制备方法，包括以下步骤：
7.步骤1)获取癌细胞样本；
8.步骤2)从步骤1)获得的样本中收集癌细胞；
9.步骤3)使用3倍浓度的类器官培养基重悬步骤2)中收集的癌细胞，将其与2倍于培养基体积的水凝胶混匀，形成的滴液铺在培养容器中，37℃静置15～20分钟；
10.步骤4)加入与步骤3)所得到的水凝胶滴液等体积的1倍浓度的类器官培养液，放入37℃5％co2孵箱中培养，每隔3天更换一次1倍浓度的类器官培养液，直至癌细胞长至合适大小；
11.其中，所述1倍浓度的类器官培养液包含1～15ng/ml表皮生长因子、2～30ng/ml成纤维细胞生长因子、2～20ug/ml胰岛素、0.1～0.5mm维生素e、0.1～2um雌二醇或2～25ng/ml氢化可的松中的一种或几种。
12.作为优选，步骤1)所述癌细胞样本为肿瘤组织或腹水。
13.作为优选，步骤1)所述癌细胞样本为肿瘤组织，步骤2)所述收集方法为对所述肿瘤组织进行消化，所述消化使用的组织消化液包含胶原酶i、胶原酶iv、分散酶或胰酶。
14.作为优选，所述组织消化液包含胶原酶i 200～500u/ml，脱氧核糖核酸酶75～200u/ml和cacl21～3mm，用hbss配制。
15.作为优选，步骤3)所述癌细胞的密度为1
×
104～6
×
104个细胞/ml。
16.作为优选，步骤3)所述类器官培养液还包含d-葡萄糖、碳酸氢钠、丙酮酸钠、hepes、l-谷氨酰胺、1％青链霉素混合液和含5～10％胎牛血清的rpmi1640培养基。
17.作为优选，步骤3)所述类器官培养液还包含碳酸氢钠、丙酮酸钠、l-谷氨酰胺、1％青链霉素混合液和含5～10％胎牛血清的高糖dmem培养基。
18.作为优选，所述癌细胞为卵巢癌细胞。
19.本发明的另一个方面是提供了一种类器官，所述类器官由上述制备方法制得。
20.本发明的另一个方面是提供了上述类器官在培养癌细胞中的用途。
21.本发明的有益效果为：
22.本发明方法可促进肿瘤类器官快速生长，缩短培养时间，可解决类器官大小不均匀的问题，同时可实现多层类器官培养。
附图说明
23.图1为水凝胶培养卵巢癌组织类器官4天的结果图，其中，a为关键成分1的水凝胶培养；b关键成分2的水凝胶培养；c关键成分3的水凝胶培养；d关键成分4的水凝胶培养；e关键成分5的水凝胶培养；f关键成分6的水凝胶培养；g1倍浓度的类器官培养基的水凝胶培养；h没有任何关键成分的水凝胶培养；i无水凝胶1倍浓度的类器官培养基培养。
具体实施方式
24.本发明公开了一种类器官模型的制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。需要特别指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明，并且相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围的基础上对本文所述内容进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
25.在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。术语“如”、“例如”等旨在指示例性实施方案，而不意图限制本公开的范围。
26.为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
27.实施例1：来源于卵巢癌组织的类器官的构建
28.1.卵巢组织样品的收集
29.术前由手术医师提前填写好《样品收集信息表》，内容包括患者姓名、年龄、临床诊断、术前是否接受过化疗、手术时间、肿瘤类型以及是否同意肿瘤样品体外培养并体外试药等。术中快速冰冻切片确诊为上皮性卵巢癌后，在保证不影响术后病理诊断的情况下，手术医师在无菌条件下切取新鲜、质量较好的瘤组织，每例最小约0.5cm x 0.5cm x 0.5cm大小，6h内无菌运输到实验室。
30.2.卵巢癌组织类器官培养前组织处理
31.超净工作台中无菌操作，在6cm细胞培养皿中将卵巢癌组织用无菌眼科剪或刀片切成1-3mm大小，转移到15ml离心管，用含双抗的hbss离心清洗一遍，弃清洗液，组织块中加入组织消化液，每100mg组织加入1ml组织消化液，成分为：胶原酶i 200-500u/ml，脱氧核糖
核酸酶75-200u/ml，cacl
2 1-3mm，用hbss配制，37℃摇床孵育，视组织块的量消化0.5-3h。
32.不同的消化酶采用同样条件处理等量卵巢癌组织得到的原代卵巢癌细胞得率比较为胶原酶i》胶原酶iv》分散酶》胰酶。
33.3.卵巢癌组织类器官模型构建及培养
34.目测15ml离心管中癌组织已无硬块状组织，加入消化组织液等量的hbss终止消化，1000rpm4℃5min离心收集分离下来的癌细胞，用卵巢癌类器官培养基重悬离心后细胞沉淀，以1
×
10
4-6
×
104个细胞/ml的浓度接种到合适的孔板中，培养基质为非动物源性水凝胶，以3倍浓度的类器官培养基重悬原代细胞(1倍浓度的类器官培养基见表1)，与2倍体积的水凝胶混匀后形成滴液铺在孔板或培养皿中37℃静止15min后，加入等体积的1倍浓度的类器官培养基放入37℃5％co2孵箱中培养。
35.每隔3天换一次液，3-10天可以长成合适大小的类器官进行其他的实验。结果如图1所示。组织类器官培养成功率为83.3％。计算公式为：组织类器官培养成功率＝培养组织类器官成功例数
÷
总培养卵巢癌标本例数(包括手术标本、腔镜标本和穿刺标本)
×
100％
36.表11倍浓度类器官培养基主要成分配方
37.关键成分英文名称中文名称工作浓度1egf表皮生长因子1-15ng/ml2fgf成纤维细胞生长因子2-30ng/ml3insulin胰岛素2-20ug/ml4ve维生素e0.1-0.5mm5estradiol雌二醇0.1-2um6hydrocortisone氢化可的松2-25ng/ml
38.用含d-葡萄糖、碳酸氢钠、丙酮酸钠、hepes、l-谷氨酰胺、1％青链霉素混合液和5-10％胎牛血清的rpmi1640培养基配制。或用含碳酸氢钠、丙酮酸钠、l-谷氨酰胺、1％青链霉素混合液和5-10％胎牛血清的高糖dmem培养基配制。
39.实施例2：来源于卵巢癌腹水的类器官的构建
40.1.卵巢腹水样品的收集
41.采集前由手术医师提前填写好《样品收集信息表》，内容包括患者姓名、年龄、临床诊断、是否接受过放化疗、手术时间、肿瘤类型以及是否同意肿瘤样品体外培养并体外试药等。术中由手术医生取样病房中由护士取样，在保证不影响病理诊断的情况下，抽取50-100ml腹水，6h内无菌运输到实验室。
42.2.卵巢癌腹水类器官培养
43.实验室中无菌操作，1000rpm4℃5min离心收集腹水的癌细胞，用含双抗的hbss或pbs离心清洗一遍，弃清洗液，细胞沉淀中加入裂红液，每50ml腹水加入1ml裂红液，混匀静止5min后离心收集细胞沉淀，hbss或pbs离心清洗一遍待接种，接种方式及培养方式同卵巢癌组织类器官。卵巢癌腹水类器官的培养成功率100％。计算公式为：腹水类器官培养成功率＝培养腹水类器官成功例数
÷
总的培养卵巢癌腹水例数
×
100％
44.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种类器官模型的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1)获取癌细胞样本；步骤2)从步骤1)获得的样本中收集癌细胞；步骤3)使用3倍浓度的类器官培养基重悬步骤2)中收集的癌细胞，将其与2倍于培养基体积的水凝胶混匀，形成的滴液铺在培养容器中，37℃静置15～20分钟；步骤4)加入与步骤3)所得到的水凝胶滴液等体积的1倍浓度的类器官培养液，放入37℃5％co2孵箱中培养，每隔3天更换一次1倍浓度的类器官培养液，直至癌细胞长至合适大小；其中，所述1倍浓度的类器官培养液包含1～15ng/ml表皮生长因子、2～30ng/ml成纤维细胞生长因子、2～20ug/ml胰岛素、0.1～0.5mm维生素e、0.1～2um雌二醇或2～25ng/ml氢化可的松中的一种或几种。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)所述癌细胞样本为肿瘤组织或腹水。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤1)所述癌细胞样本为肿瘤组织，步骤2)所述收集方法为对所述肿瘤组织进行消化，所述消化使用的组织消化液包含胶原酶i、胶原酶iv、分散酶或胰酶。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述组织消化液包含胶原酶i 200～500u/ml，脱氧核糖核酸酶75～200u/ml和cacl21～3mm，用hbss配制。5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤3)所述癌细胞的密度为1
×
104～6
×
104个细胞/ml。6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤3)所述类器官培养液还包含d-葡萄糖、碳酸氢钠、丙酮酸钠、hepes、l-谷氨酰胺、1％青链霉素混合液和含5～10％胎牛血清的rpmi1640培养基。7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤3)所述类器官培养液还包含碳酸氢钠、丙酮酸钠、l-谷氨酰胺、1％青链霉素混合液和含5～10％胎牛血清的高糖dmem培养基。8.根据权利要求1～7任意一项中所述的制备方法，其特征在于，所述癌细胞为卵巢癌细胞。9.一种类器官，其特征在于，所述类器官由如权利要求1～7任意一项中所述的制备方法制得。10.如权利要求9所述的类器官在培养癌细胞中的用途。

技术总结
本发明公开了一种类器官模型的制备方法。本发明方法可促进肿瘤类器官快速生长，缩短培养时间，可解决类器官大小不均匀的问题，同时可实现多层类器官培养。可实现多层类器官培养。可实现多层类器官培养。


技术研发人员：王珂 于敏
受保护的技术使用者：天津市肿瘤医院（天津医科大学肿瘤医院）
技术研发日：2022.03.11
技术公布日：2023/9/20