重组单域抗体及其构建方法

1.本发明属于生物医学领域，涉及一种高效表达的重组单域抗体组合物及其构建方法。


背景技术：

2.抗体指机体在抗原刺激下，由b淋巴细胞增殖分化的浆细胞所产生的一种可与相应抗原特异性结合的免疫球蛋白，可以为机体提供有效的保护。抗体是由4条多肽链以对称的结构组成的一种y字形单体，其中两条较长的相对分子质量大的为重链，两条短的相对分子质量小的为轻链。重链以h链表示，轻链以l链表示。抗体分子链之间通过二硫键和非共价键进行连接，按结构可分为恒定区和可变区，可变区在顶端位置，是抗原的结合部位。在淋巴细胞进行分化的过程中，抗体可变区的v基因和恒定区的c基因位于dna的不同区域，这些抗体基因进行重排构成多样的抗体重链或轻链，然后进行完整的转录和翻译。
3.1993年，hamers
–
casterman等发现，骆驼血清中除了常规的抗体外，还有大量类似免疫球蛋白g的分子。这类分子天然缺失传统抗体轻链和重链恒定区的一部分，但仍具备对抗原的结合力，这类抗体被称为重链抗体。其抗原结合区仅由可变区片段构成，其相当于传统抗体抗原结合片段的功能等同物。人们把重链抗体的抗原识别区片段称为vhh(variable domain ofthe heavy chain ofheavy-chain antibody，vhh)，并开发了只含有vhh结构域的单域抗体(single domain antibody，sdab)。通过免疫骆驼科动物，经菌体展示，可筛选获得特异性单域抗体，由于其特异性好、分子量小、生物组织穿透力好、易于改造等优点，在诊断、疾病治疗等方面得到应用。单域抗体的生产大多数采用原核表达系统，虽然生产成本低产量高，但产生的单域抗体可能发生错误折叠而丧失生物活性。因此，开发一种高效产生单域抗体的方法具有重要意义。
4.近年来，无血清培养基和转染试剂的不断改良，使哺乳动物细胞表达系统得到快速发展。无血清培养基的改良提高细胞的培养密度，而转染试剂的改良提高了细胞的转染率，这两者的组合极大地降低了哺乳动物细胞瞬时表达系统的成本，并且哺乳动物细胞表达系统作为最高级的表达系统，其形成的单域抗体具有天然的活性构象。
5.质粒载体作为决定单域抗体表达水平的关键要素，其构建方法尤为重要。载体的构建极其复杂，涉及启动子、内含子、蛋白质编码区、非翻译区、polya信号、载体骨架等等。特殊地，针对表达单域抗体，分泌信号肽的选择和分泌信号肽下游氨基酸序列是促进单域抗体高效分泌的关键。因此，如何避免繁琐的载体构建过程，获得一种可以极大提高单域抗体表达水平的载体构建方法是利用哺乳动物细胞产生单域抗体的难题。


技术实现要素：

6.针对上述问题，本发明通过密码子优化和信号肽的添加，得到的重组单域抗体，不仅具有高生物活性，通过载体表达具有较高的蛋白质产量，可以满足单域抗体应用的前、中期要求。
7.第一方面，本发明提供一种重组单域抗体，所述重组单域抗体的氨基酸序列为在单域抗体的n端添加信号肽氨基酸序列，在单域抗体的c端设置终止密码子氨基酸序列所构成的氨基酸序列。
8.进一步的，所述单域抗体选自vhh1、vhh2、vhh3、vhh4、vhh5和vhh6中的一种或多种。
9.进一步的，所述单域抗体vhh1、vhh2、vhh3、vhh4、vhh5和vhh6的氨基酸序列分别如：seq id no:2、seq id no:6、seq id no:8、seq id no:10、seq id no:12、seq id no:14所示。
10.进一步的，所述信号肽序列选自azu、a2、hc、ifnα2和il-2中的一种或多种。
11.进一步的，优选在单域抗体和信号肽序列之间添加促分泌序列，所述促分泌序列选自evqlv、qvqlv和dvqlv中的一种或多种。
12.在本发明的一个具体实施方式中，本发明的重组单域抗体相应的核苷酸序列为在单域抗体的5’端添加信号肽核苷酸序列，在单域抗体的3’端设置终止密码子核苷酸序列所构成的核苷酸序列。
13.所述单域抗体vhh1、vhh2、vhh3、vhh4、vhh5和vhh6的核苷酸序列分别如：seq id no:1、seq id no:5、seq id no:7、seq id no:9、seq id no:11、seq id no:13所示；
14.进一步的，所述信号肽核苷酸序列选自azu、a2、hc、ifnα2和il-2中的一种或多种的核苷酸序列。
15.进一步的，优选在单域抗体的5＇端添加促分泌序列的核苷酸序列，所述促分泌序列选自evqlv、qvqlv和dvqlv中的一种或多种。
16.进一步，优选在重组单域抗体相应的核苷酸序列5＇端添加kozak基序gccacc。
17.第二方面，本发明提供一种重组单域抗体的核苷酸序列构建方法，所述方法包括如下步骤：
18.s1选择单域抗体，在单域抗体氨基酸n端添加信号肽序列，在c端添加密码子终止序列，获得重组单域抗体氨基酸序列；
19.s2将重组单域抗体氨基酸序列通过密码子优化方法生成dna序列；并在dna序列的5＇端加上kozak基序gccacc，得到重组单域抗体的核苷酸序列。
20.进一步，在步骤s1中，优选在单域抗体的5＇端添加促分泌序列氨基酸序列，所述促分泌序列选自evqlv、qvqlv和dvqlv中的一种或多种。
21.第三方面，本发明提供一种表达重组单域抗体的质粒构建方法：
22.s1选择单域抗体，在单域抗体氨基酸n端添加信号肽序列，在c端添加密码子终止序列，获得重组单域抗体氨基酸序列；
23.s2将重组单域抗体氨基酸序列通过密码子优化方法生成dna序列；并在dna序列的5＇端加上kozak基序gccacc，得到重组单域抗体的cdna序列；
24.s3将cdna序列插入至表达载体，得到重组单域抗体的质粒。
25.进一步，在步骤s1中，优选在单域抗体的5＇端添加促分泌序列氨基酸序列，所述促分泌序列选自evqlv、qvqlv和dvqlv中的一种或多种。
26.进一步的，s1中所述单域抗体选自vhh1、vhh2、vhh3、vhh4、vhh5和vhh6中的一种或多种。
27.进一步的，s1中所述信号肽可选自azu、a2、hc、secrecon、ifnα2和il-2中的一种或多种。
28.更进一步的，所述重组单域抗体还可以在该重组单域抗体羧基端加上亲和纯化标签。
29.进一步的，所述亲和纯化标签优选6
×
his标签。
30.进一步的，终止密码子优选tga。
31.第四方面，本发明提供可表达第一方面所述重组单域抗体的表达载体。
32.进一步的，所述表达载体为载有重组单域抗体的表达载体。
33.第五方面，本发明提供一种重组单域抗体组合物在制备生物抗体制品中的应用。
34.进一步的，所述重组单域抗体组合物含有本发明第一方面的重组单域抗体。
35.进一步的，所述单域抗体组合物还可以为本发明第一方面的重组单域抗体联合其抗体的组合物。
36.进一步的，所述应用包含制备诊断、检测、病原性疾病治疗和癌症治疗等生物制品中的应用。
37.进一步的，所述生物制品包括诊断试剂、检测试剂、疫苗制剂、多肽制品等。
38.第六方面，本发明提供一种表达重组单域抗体的质粒在在制备生物抗体制品中的应用。
39.进一步的，所述质粒为载有重组单域抗体的表达质粒。
40.有益效果
41.本发明通过密码子优化和信号肽的添加，得到的重组单域抗体大小在10-15kda，产量为182.8mg/l到336.4mg/l，不仅具有高生物活性，而且具有较高的蛋白质产量，可以满足单域抗体应用的前、中期要求。
附图说明
42.图1不同信号肽对重组重链抗体分泌表达的影响
43.图2vhh1和优化后的vhh1(optivhh1)的表达及产量比较
44.图3五种单域抗体优化后的表达及产量测定
45.图4优化后的vhh1和vhh2活性测定
46.图5优化后的vhh3和vhh4活性测定
具体实施方式
47.实施例1信号肽的筛选
48.1.1质粒构建：用传统的基因工程方法在vhh1的5’端分别连接azu(genbank np_001691)、a2(genbankaby61983.1)、hc(genbank qbk47494.1)、secrecon(genbank bbd75655.1)、ifnα2(genbank np_000596)、il-2(genbank np_000577.2)的信号肽序列，在其3’端连接人igg的fc，克隆至载体ptt5的hindⅲ和notⅰ位点，vhh1的核苷酸序列为seq id no:1，vhh1的氨基酸序列为seq id no:2。
49.seq id no:1
50.gagtctgggggagccgcggcgcaggctggagggtctctgagactctcctgtgcagcctctgcatac
51.acctttagtagcaactgcgtaggttggttccgccaggttccaggcaaggagcgcgagggggtcgc
52.gcgttatgatggcagtggtgatccaagatacgcagattccgtgaagggccgattcaccatctccaca
53.gacaacgccaaggcaactctgtatctgcaaatggacagcctgaaacccgaggacactgccatgtac
54.tactgtgcggcaggttgggctctgggttggcccgccacctgtgactattcctactggggccagggg
55.accctggtcaccgtctcctca
56.seq id no:2
57.esggaaaqaggslrlscaasaytfssncvgwfrqvpgkeregvarydgsgdpryadsvkgrftistdn
58.akatlylqmdslkpedtamyycaagwalgwpatcdysywgqgtlvtvss
59.1.2细胞培养：用293sfm培养expi293f细胞，24h后1300rpm,5min离心，收集细胞用新鲜的293sfm重悬，使其密度为2.0
×
106cells/ml，取50ml细胞悬液于250ml摇瓶中。
60.1.3蛋白表达：取两支15ml离心管，各加入2.5ml新鲜的293sfm，在其中一支中加入100μg无菌pdna，混匀，在另一支中加入500μg pei(25k)转染试剂，颠倒混匀10s。将稀释的pei快速加入至稀释的pdna中，涡旋混匀10s，静置5min，随后逐滴加入摇瓶中，于37℃，120rpm摇床中培养7天后，5000rpm离心，10min，收集上清。
61.1.4标准品制备：用proteina纯化il2-vhh1-fc的培养物上清，经sds-page鉴定，纯度在95％以上，用bca试剂盒测定其浓度。
62.1.5elisa定量：用碳酸氢盐缓冲液(ph 9.6)将纯化的灭活sva病毒稀释至浓度为4μg/ml，每孔加入100μl，4℃过夜包被；pbst洗涤5次，拍干；用0.5％bsa封闭，100μl/孔，37℃孵育1h；pbst洗涤5次，拍干；用pbst对标准品和待测培养上清稀释100倍，加入包被板中，倍比稀释，使每孔的最终体积为100μl，37℃孵育1h；pbst洗涤5次，拍干；用pbst稀释hrp标记的小鼠抗人igg fc单克隆抗体(abacm,uk)15000倍，100μl/孔，37℃孵育1h；pbst洗涤5次，拍干；加入tmb溶液显示，100μl/孔，37℃显色15min；加入终止液，50μl/孔；于450nm读取吸光值，绘制标准曲线，计算样本的浓度。
63.信号肽在分泌蛋白前体和膜蛋白前体靶向内质网的过程中起着至关重要的作用，对于特定的分泌蛋白和表达宿主，不同的信号肽发挥的作用不同。
64.本发明研究了azu、a2、hc、ifnα2和il-2的信号肽对vhh1的作用。如图1所示，带有azu、a2、ifnα2三种信号肽的vhh1的表达水平明显高于带有其他三种信号肽的表达水平，其中带有ifnα2信号肽的表达水平最高。
65.实施例2vhh的优化及产量分析
66.2.1质粒构建
67.在vhh1的seq id no:2氨基酸序列的n端加上dvqlv，并在vhh1的n端和c端分别连接ifnα2信号肽和6
×
his标签，得到seq id no:3所示氨基酸序列。对seq id no:3进行密码子优化后在所得dna序列的5＇端加上kozak基序gccacc，在3＇端加上终止密码子tga，其dna序列为seq id no:4，优化后的vhh1命名为optivhh1(seq id no:4)。合成该基因，并克隆至载体ptt5，的hindⅲ和notⅰ位点。
68.seq id no:3
69.maltfallvallvlscksscsvgdvqlvesggaaaqaggslrlscaasaytfssncvgwfrqvpgker
70.egvarydgsgdpryadsvkgrftistdnakatlylqmdslkpedtamyycaagwalgwpatcdysyw
71.gqgtlvtvsshhhhhh
72.seq id no:4
73.gccaccatggccctgaccttcgccctgctggtggccctgctggtgctgagctgcaagagcagctgc
74.agcgtgggcgacgtgcagctggtggagagcggcggcgccgccgcccaggccggcggcagcctgc
75.ggctgagctgcgccgccagcgcctacaccttcagcagcaactgcgtgggctggttccggcaggtg
76.cccggcaaggagcgggagggcgtggcccggtacgacggcagcggcgacccccggtacgccgaca
77.gcgtgaagggccggttcaccatcagcaccgacaacgccaaggccaccctgtacctgcagatggac
78.agcctgaagcccgaggacaccgccatgtactactgcgccgccggctgggccctgggctggcccgcc
79.acctgcgactacagctactggggccagggcaccctggtgaccgtgagcagccaccaccaccacca
80.ccactga
81.2.2蛋白表达及产量分析
82.取两支15ml离心管，各加入2.5ml的293sfm，在其中一支管中加入100μg无菌pdna混匀，在另一支中加入500μg pei(25k)转染试剂，颠倒混匀10s。将稀释的pei快速加入至稀释的pdna中，涡旋混匀10s，静置5min，随后逐滴加入expi293f细胞摇瓶中。将expi293f细胞摇瓶放入摇床中培养(37℃，120rpm)，4天后离心(5000rpm,10min)收获培养上清。
83.sds-page分析(图2a)和免疫印迹(图2b)显示，optivhh1的表达量明显高于vhh1的表达量，定量分析结果显示，优化后其产量增加了约一倍，达到254.5
±
20.9mg/l(图2c)。
84.2.3蛋白质纯化和抗体结合活性检测
85.将100ml培养上清与300ml的平衡缓冲液(500mm nacl，20mm tris，5％甘油，ph 8.0)混合，加载至镍树脂填料(ge healthcare)，用200ml的缓冲液(500mm nacl，20mm tris，30mm咪唑，5％甘油，ph 8.0)洗脱杂蛋白，最后用洗脱缓冲液(500mm nacl，20mm tris，500mm咪唑，5％甘油，ph 8.0)洗脱目的蛋白，用pbs稀释至100μm。
86.用碳酸氢盐缓冲液(ph 9.6)将纯化的灭活sva稀释至1μg/ml，100μl/孔进行包被，4℃过夜；pbst洗涤5次，拍干；用0.5％bsa封闭，100μl/孔，37℃孵育1h；pbst洗涤5次，拍干；用pbst溶液对纯化的vhh1和optivhh1分别稀释至10nmol/l、1nmol/l、0.5nmol/l、0.25nmol/l、0.125nmol/l、0.0675nmol/l、0.03375nmol/l、0.016875nmol/l，加入包被板中，使每孔的最终体积为100μl，37℃孵育1h；pbst洗涤5次，拍干；用pbst稀释hrp标记的抗6
×
his多克隆抗体(bethyl laboratories,usa)5000倍，100μl/孔，37℃孵育1h；pbst洗涤5次，拍干；加入tmb溶液显示，100μl/孔，37℃显色15min；加入终止液，50μl/孔于450nm处读取光密度；用graphpad prism软件中绘制曲线，计算达到最大吸光度一半时所需的抗体浓度。
87.如图2d显示，vhh1和optivhh1的吸光曲线几乎重叠，vhh1达到最大吸光度一半的浓度为0.25nm，而optivhh1为0.26nm，表明密码子优化显著提高了蛋白的表达量，而没有影响其抗体的结合活性
88.实施例3不同单域抗体的优化后的效果比较
89.按照实施例2的方法对vhh2、vhh3、vhh4、vhh5和vhh6等5种单域抗体分别进行质粒构建、蛋白表达和纯化、表达量和活性检测，其中回收率计算方法如下：
90.样品进行sds-page分析，用image j软件对sds-page分析图进行灰度分析，得出目的条带灰度占总灰度的百分比，用该百分比乘以该管的总蛋白浓度即为纯化后的目的蛋白浓度。该管的总蛋白浓度由bca试剂盒测定。
91.回收率＝(纯化后目的蛋白浓度
×
纯化后收集的总体积)/(培养上清中目的蛋白浓度
×
收获的培养上清体积)。
92.单域抗体vhh2、vhh3、vhh4、vhh5和vhh6的核苷酸序列分别如：seq id no:5、seq id no:7、seq id no:9、seq id no:11、seq id no:13所示；其对应的氨基酸序列分别如：seq id no:6、seq id no:8、seq id no:10、seq id no:12、seq id no:14所示。
93.seq id no:5
94.gagtctgggggaggctcggtgcaggctggagggtctctgagactctcctgtgcagcctctggatac
95.acctacagtagcggctgcatgggctggttccgccaggctccagggaaggagcgcgagggggtcgc
96.aactagtgatagtgatggtaggacaagttacgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccaa
97.agacaacgccaagaacactctgtatctgcaaatgaacagcctgaaacctgaggacactgccatgta
98.ctactgtgcggcagagccgagggccatcgtcatgagtggtggttactgctaccctccccctctcggt
99.tactggggccaggggacccaggtcactgtctcctca
100.seq id no:6
101.esgggsvqaggslrlscaasgytyssgcmgwfrqapgkeregvatsdsdgrtsyadsvkgrftiskdn
102.akntlylqmnslkpedtamyycaaepraivmsggycyppplgywgqgtqvtvss
103.seq id no:7
104.gagtctgggggaggctcggtgcaggctggagggtctctgagactctcctgtgcagcctctggatac
105.acctacaatagccactgcatgggctggttccgccaggctccggggagggagcgcgactgggttgca
106.tttatgcatacagctgacagtaccacaagatatgccgactccgtgaagggccgattcaccatctccc
107.gtgacaacgccaagaacacgctgtatctccaaatgaacagcctgaaatctgaggacactgccatgt
108.actactgtgcggcagatagccggtaccggccctattatagtagctgcccgcgctctacagacgatcta
109.tactggggccaggggacccaggtcaccgtctcctca
110.seq id no:8
111.esgggsvqaggslrlscaasgytynshcmgwfrqapgrerdwvafmhtadsttryadsvkgrftisr
112.dnakntlylqmnslksedtamyycaadsryrpyysscprstddlywgqgtqvtvss
113.seq id no:9
114.gagtctgggggaggctcggtgcaggctggagactctctgagactctcctgtgtagcctctagcatg
115.tccaatatcaactgcatgggctggttccgccaggctccagggaaggagcgcgagggggtcgcactg
116.ctttatacgcgtgccagtggcacaatctatgccgactccgtgaagggccgattcaccatctcccaag
117.acccggtcaagaacacgctgtatctagaaatgaacacgctgaaacctgaggacactgccacgtact
118.actgtgcggcagattcttataactgccatttagggtcttggtatcatttcactcgttaccggggccag
119.gggacccaggtcaccgtctcctca
120.seq id no:10
121.esgggsvqagdslrlscvassmsnincmgwfrqapgkeregvallytrasgtiyadsvkgrftisqdpv
122.kntlylemntlkpedtatyycaadsynchlgswyhftryrgqgtqvtvss
123.seq id no:11
124.gagtcagggggaggcttggtgcagcctggggggtctctgagactctcctgtgtagcctctggaacg
125.gtcttcagtatcaatgatattagtattaatcacctgggctggtaccgccaggctccagggaaggaac
126.gcgagttggtcgcggctatcactgctgatggtacatcagcctatgaagactccgtgaagggccgatt
127.catcatctccagagacgacgccaaaaagatggtgtatctgcaaatgaacagcctgaaacccgagga
128.cacggccgtctattactgtaatggtctaagggcctcgaatgcgggttgggagcctcgctttggtact
129.tggggccaggggacccaggtcacc
130.seq id no:12
131.esggglvqpggslrlscvasgtvfsindisinhlgwyrqapgkerelvaaitadgtsayedsvkgrfiisr
132.ddakkmvylqmnslkpedtavyycnglrasnagweprfgtwgqgtqvt
133.seq id no:13
134.gagtctgggggaggctcggtgcagactggagggtctctgacactctcctgtgcagcctctggcag
135.caccgtcactatcggctcgatgggctggttccgccaggctccagggaaggagcgcgagggggtcg
136.cgcttatttatactggacgcggtagcacgaactatgccgactccgtgaagggccgattcaccatctc
137.ccaaggcaacgccaagaacacggtgtatctgcaaatgaacagcctgaaacctgaggacactgcca
138.tatactactgtgcagcagcccccgggcgccccagtctgaagtacgagatgcgacaggtggactttc
139.gttactggggccaggggacccaggtc
140.seq id no:14
141.esgggsvqtggsltlscaasgstvtigsmgwfrqapgkeregvaliytgrgstnyadsvkgrftisqgn
142.akntvylqmnslkpedtaiyycaaapgrpslkyemrqvdfrywgqgtqv
143.结果显示，所有优化重组后的vhh都在培养上清总蛋白中占比较高(图3a)，纯度在50％以上(表1)。所有vhh的产量都超过190mg/l，最高达到336.4mg/l(图3、表1)。所有vhh的回收率在76％以上，除vhh6外，其他vhh亲和纯化后的回收率都在86％以上(表1)，优化后的vhh2、vhh3、vhh4、vhh5、vhh6的核苷酸序列如seq id no:15-seq id no:19所示。
144.表1五种优化的单域抗体的表达效果比较
[0145][0146]
单域抗体活性检测结果显示，所测试的单域抗体均在纳摩尔或亚纳摩尔浓度即可达到最高光密度值的一半，说明所测试的抗体具有高活性(图4，图5)。
[0147]
优化后的vhh2(seq id no:15)：
[0148]
gccaccatggccctgaccttcgccctgctggtggccctgctggtgctgagctgcaagagcagctgc
[0149]
agcgtgggcgaggtgcagctggtggagagcggcggcggcagcgtgcaggccggcggcagcctgc
[0150]
ggctgagctgcgccgccagcggctacacctacagcagcggctgcatgggctggttccggcaggccc
[0151]
ccggcaaggagcgggagggcgtggccaccagcgacagcgacggccggaccagctacgccgacag
[0152]
cgtgaagggccggttcaccatcagcaaggacaacgccaagaacaccctgtacctgcagatgaaca
[0153]
gcctgaagcccgaggacaccgccatgtactactgcgccgccgagccccgggccatcgtgatgagcg
[0154]
gcggctactgctaccccccccccctgggctactggggccagggcacccaggtgaccgtgagcagcc
[0155]
accaccaccaccaccactga
[0156]
优化后的vhh3(seq id no:16)：
[0157]
gccaccatggccctgaccttcgccctgctggtggccctgctggtgctgagctgcaagagcagctgc
[0158]
agcgtgggccaggtgcagctggtggagagcggcggcggcagcgtgcaggccggcggcagcctgc
[0159]
ggctgagctgcgccgccagcggctacacctacaacagccactgcatgggctggttccggcaggccc
[0160]
ccggccgggagcgggactgggtggccttcatgcacaccgccgacagcaccacccggtacgccgac
[0161]
agcgtgaagggccggttcaccatcagccgggacaacgccaagaacaccctgtacctgcagatgaa
[0162]
cagcctgaagagcgaggacaccgccatgtactactgcgccgccgacagccggtaccggccctacta
[0163]
cagcagctgcccccggagcaccgacgacctgtactggggccagggcacccaggtgaccgtgagca
[0164]
gccaccaccaccaccaccactga
[0165]
优化后的vhh4(seq id no:17)：
[0166]
gccaccatggccctgaccttcgccctgctggtggccctgctggtgctgagctgcaagagcagctgc
[0167]
agcgtgggccaggtgcagctggtggagagcggcggcggcagcgtgcaggccggcgacagcctgc
[0168]
ggctgagctgcgtggccagcagcatgagcaacatcaactgcatgggctggttccggcaggcccccg
[0169]
gcaaggagcgggagggcgtggccctgctgtacacccgggccagcggcaccatctacgccgacagc
[0170]
gtgaagggccggttcaccatcagccaggaccccgtgaagaacaccctgtacctggagatgaacac
[0171]
cctgaagcccgaggacaccgccacctactactgcgccgccgacagctacaactgccacctgggca
[0172]
gctggtaccacttcacccggtaccggggccagggcacccaggtgaccgtgagcagccaccaccac
[0173]
caccaccactga
[0174]
优化后的vhh5(seq id no:18)：
[0175]
gccaccatggccctgaccttcgccctgctggtggccctgctggtgctgagctgcaagagcagctgc
[0176]
agcgtgggcgacgtgcagctggtggagagcggcggcggcctggtgcagcccggcggcagcctgc
[0177]
ggctgagctgcgtggccagcggcaccgtgttcagcatcaacgacatcagcatcaaccacctgggct
[0178]
ggtaccggcaggcccccggcaaggagcgggagctggtggccgccatcaccgccgacggcaccagc
[0179]
gcctacgaggacagcgtgaagggccggttcatcatcagccgggacgacgccaagaagatggtgta
[0180]
cctgcagatgaacagcctgaagcccgaggacaccgccgtgtactactgcaacggcctgcgggcca
[0181]
gcaacgccggctgggagccccggttcggcacctggggccagggcacccaggtgacccaccaccac
[0182]
caccaccactga
[0183]
优化后的vhh6(seq id no:19)：
[0184]
gccaccatggccctgaccttcgccctgctggtggccctgctggtgctgagctgcaagagcagctgc
[0185]
agcgtgggcgacgtgcagctggtggagagcggcggcggcagcgtgcagaccggcggcagcctga
[0186]
ccctgagctgcgccgccagcggcagcaccgtgaccatcggcagcatgggctggttccggcaggcc
[0187]
cccggcaaggagcgggagggcgtggccctgatctacaccggccggggcagcaccaactacgccga
[0188]
cagcgtgaagggccggttcaccatcagccagggcaacgccaagaacaccgtgtacctgcagatga
[0189]
acagcctgaagcccgaggacaccgccatctactactgcgccgccgcccccggccggcccagcctga
[0190]
agtacgagatgcggcaggtggacttccggtactggggccagggcacccaggtgcaccaccaccac
[0191]
caccactga。

技术特征：
1.一种重组单域抗体，所述重组单域抗体的氨基酸序列为在单域抗体的n端添加信号肽氨基酸序列，在单域抗体的c端设置终止密码子氨基酸序列所构成的氨基酸序列。2.如权利要求1所述重组单域抗体，其特征在于，所述单域抗体选自vhh1、vhh2、vhh3、vhh4、vhh5和vhh6中的一种或多种，所述单域抗体vhh1、vhh2、vhh3、vhh4、vhh5和vhh6的氨基酸序列分别如：seq id no:2、seq id no:6、seq id no:8、seq idno:10、seq id no:12、seq id no:14所示。3.如权利要求1或2所述重组单域抗体，所述信号太序列选自azu、a2、hc、secrecon、ifnα2、和il-2中的一种或多种。4.如权利要求1-3任一项所述重组单域抗体，在单域抗体和信号肽序列之间添加促分泌序列，所述促分泌序列选自evqlv、qvqlv和dvqlv中的一种或多种。5.如权利要求1-4任一项所述重组单域抗体，所述重组单域抗体相应的核苷酸序列为在单域抗体的5’端添加信号肽核苷酸序列，在单域抗体的3’端设置终止密码子核苷酸序列所构成的核苷酸序列，所述单域抗体vhh1、vhh2、vhh3、vhh4、vhh5和vhh6的核苷酸序列分别如：seq id no:1、seq id no:5、seq id no:7、seq id no:9、seq id no:11、seq id no:13所示。6.一种重组单域抗体的核苷酸序列构建方法：所述方法包括如下步骤：s1选择单域抗体，在单域抗体氨基酸n端添加信号肽序列，在c端添加密码子终止序列，获得重组单域抗体氨基酸序列；s2将重组单域抗体氨基酸序列通过密码子优化方法生成dna序列；并在dna序列的5＇端加上kozak基序gccacc，得到重组单域抗体的核苷酸序列。7.一种重组单域抗体组合物在制备生物抗体制品中的应用，所述重组单域抗体组合物含有权利要求1-5任一项所述的重组单域抗体。8.如权利要求7所述的应用，其中所述单域抗体组合物含有权利要求1-5任一项所述的重组单域抗体联合其抗体的组合物。9.如权利要求7或8所述的应用，所述应用包含制备诊断、检测、病原性疾病治疗和癌症治疗等生物制品中的应用。10.一种表达重组单域抗体的质粒在在制备生物抗体制品中的应用，其中所述质粒为载有权利要求1-5任一项所述的重组单域抗体的表达质粒。

技术总结
本发明属于生物医学领域，涉及一种可高效表达的重组单域抗体，所述重组单域抗体的氨基酸序列为在单域抗体的N端添加信号肽氨基酸序列，在单域抗体的C端设置终止密码子氨基酸序列所构成的氨基酸序列，所述单域抗体选自VHH1、VHH2、VHH3、VHH4、VHH5和VHH6中的一种或多种，所述信号太序列选自Azu、A2、HC、Secrecon、IFNα2和IL-2中的一种或多种。本发明通过密码子优化和信号肽的添加，得到的单域抗体组合物不仅具有高生物活性，而且具有较高的蛋白质产量，可以满足单域抗体应用的前、中期要求。期要求。


技术研发人员：郭慧琛 谭书桢 孙世琪 穆素雨 董虎 王嘉宁 白满元 滕志东 吴金恩 张韵 尹双辉
受保护的技术使用者：中国农业科学院兰州兽医研究所
技术研发日：2023.05.11
技术公布日：2023/10/6