抗结核药血清替代基质及其应用的制作方法

1.本发明涉及检测试剂技术领域，尤其是涉及一种抗结核药血清替代基质及其应用。


背景技术：

2.一线抗结核药主要包括吡嗪酰胺(pyrazinamide，pza)、异烟肼(isoniazid，inh)、乙胺丁醇(ethambutol，emb)和利福平(rifamoicin，rmp)。对这四种化合物的联合检测，其中试剂盒中替代基质的选择问题较大，作为血清样本的替代基质，需要与血清样本基质相似，在检测人血清样本时不会出现基质效应。血清基质主要组成成分为水，但利福平几乎不溶于水，且在水中很不稳定，外界因素如温度、光线、空气(氧)、金属离子等均可使利福平氧化而失效，给生产和使用带来一定的影响。异烟肼结构中含有酰肼基，受光、热、ph等影响易分解。因此如何改善抗结核药的替代基质是目前有待解决的问题。
3.有鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

4.本发明的第一目的在于提供一种抗结核药血清替代基质，以缓解现有技术中存在的抗结核药在替代基质中不稳定易失效的技术问题。
5.本发明的第二目的在于提供一种含有上述抗结核药血清替代基质在制备抗结核药检测试剂或试剂盒，或在非诊断和治疗目的的检测抗结核药中的应用。
6.为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：
7.根据本发明的一个方面，提供了一种抗结核药血清替代基质，包括吡嗪酰胺、异烟肼、乙胺丁醇和利福平中的至少一种，所述抗结核药血清替代基质包括稳定剂组分和稀释液组分；
8.所述稳定剂组分包括丁基羟基茴香醚0.1～2％wt、2,6-二叔丁基对酚0.1～2％wt和乙二胺四乙酸盐0.1～2％wt；
9.所述稀释液组分包括牛血清白蛋白和缓冲液，所述牛血清白蛋白的浓度为0.1～1％wt。
10.优选地，所述稳定剂组分包括丁基羟基茴香醚0.2～0.5％wt、2,6-二叔丁基对酚0.2～0.5％wt和乙二胺四乙酸盐0.1～2％wt。
11.优选地，所述稳定剂组分还包括β巯基乙醇、抗坏血酸和硫代硫酸盐中的至少一种；
12.优选地，β巯基乙醇、抗坏血酸和硫代硫酸盐的浓度分别独立的为0.1～0.5％wt。
13.优选地，所述缓冲液包括磷酸盐缓冲液或生理盐水。
14.优选地，所述稀释液组分还包括有机相；
15.优选地，所述有机相选自乙酸乙酯、异丙醇或二甲基亚砜；
16.优选地，所述有机相的浓度为1～4％v/v；
17.优选地，所述稀释液组分还包括表面活性剂；
18.优选地，所述表面活性剂的浓度为2～5％v/v；
19.优选地，所述表面活性剂选自非离子表面活性剂；
20.优选地，所述表面活性剂选自吐温；
21.优选地，所述表面活性剂选自吐温-20、吐温-40和吐温-80中的至少一种。
22.优选地，所述抗结核药血清替代基质包括丁基羟基茴香醚0.1～2％wt、2,6-二叔丁基对酚0.1～2％wt、乙二胺四乙酸盐0.1～2％wt、硫代硫酸盐0.1～0.5％wt、牛血清白蛋白0.1～1％wt、乙酸乙酯1～4％v/v、吐温-20 2～5％v/v和磷酸盐缓冲液。
23.优选地，所述抗结核药血清替代基质包括丁基羟基茴香醚0.5％wt、2,6-二叔丁基对酚0.5％wt、乙二胺四乙酸钠0.1％wt、硫代硫酸钠0.1％wt、牛血清白蛋白1％wt、乙酸乙酯4％v/v、吐温-20 5％v/v和磷酸盐缓冲液。
24.根据本发明的另一个方面，本发明还提供了上述抗结核药血清替代基质在制备抗结核药检测试剂或试剂盒，或在非诊断和治疗目的的检测抗结核药中的应用。
25.根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种抗结核药检测试剂或试剂盒，该试剂或试剂盒包含上述抗结核药血清替代基质；
26.优选地，所述试剂为标准品或质控品，所述标准品或质控品以权利要求1～7任一项所述的抗结核药血清替代基质为基质，所述标准品或质控品含有吡嗪酰胺、异烟肼、乙胺丁醇和利福平中的至少一种；
27.优选地，所述标准品或质控品含有吡嗪酰胺、异烟肼、乙胺丁醇和利福平。
28.根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种抗结核药检测方法，该抗结核药检测方法包括使用上述抗结核药血清替代基质作为标准品的替代基质，所述标准品中含有吡嗪酰胺、异烟肼、乙胺丁醇和利福平中的至少一种；
29.优选地，还包括使用上述抗结核药血清替代基质作为质控品的替代基质，所述质控品中含有吡嗪酰胺、异烟肼、乙胺丁醇和利福平中的至少一种；
30.优选地，所述检测方法包括：将经过前处理的待测样本使用液相色谱串联质谱检测，将检测值带入标准曲线中，计算得到样本中抗结核药的含量。
31.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
32.本发明提供的抗结核药血清替代基质中含有稳定剂组分，稳定剂组分包括丁基羟基茴香醚、2,6-二叔丁基对酚和乙二胺四乙酸盐，还可选地含有β巯基乙醇、抗坏血酸和硫代硫酸盐中的至少一种。其中丁基羟基茴香醚、2,6-二叔丁基对酚、硫代硫酸盐、抗坏血酸和β巯基乙醇具有抗氧化作用，乙二胺四乙酸盐具有螯合体系中金属离子的作用，本发明通过在抗结核药血清替代基质中添加稳定剂，实现抗结核药在替代基质中长期保存的效果。该基质配置标准品及质控品在-20℃
±
5℃储存条件下，对存放13个月内数据进行稳定性趋势检验，趋势不显著。且该基质中以牛血清白蛋白和缓冲液作为稀释液组分，使得其能较好的替代血清基质，在与血清基质进行基质比对时，内标归一化的基质因子的变异系数小于15％。
附图说明
33.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体
实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
34.图1为本发明实施例6提供的检测方法检测吡嗪酰胺、异烟肼、乙胺丁醇和利福平的质谱图；
35.图2为本发明效果例2实验中吡嗪酰胺长期稳定性趋势图；
36.图3为本发明效果例2实验中异烟肼长期稳定性趋势图；
37.图4为本发明效果例2实验中乙胺丁醇长期稳定性趋势图；
38.图5为本发明效果例2实验中利福平长期稳定性趋势图。
具体实施方式
39.下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
40.根据本发明的一个方面，本发明提供了一种抗结核药血清替代基质，本发明提供的抗结核药血清替代基质可以作为吡嗪酰胺、异烟肼、乙胺丁醇和利福平中的至少一种的替代基质。该替代基质可以作为吡嗪酰胺、异烟肼、乙胺丁醇和利福平中任一单独一种的替代基质，也可以作为上述四种抗结核药物中至少任意两种混合物的替代基质；优选地，本发明提供的抗结核药血清替代基质可以作为上述四种抗结核药物的混合物的替代基质。
41.本发明提供的抗结核药血清替代基质包括稳定剂组分和稀释液组分。
42.稳定剂组分包括丁基羟基茴香醚、2,6-二叔丁基对酚和乙二胺四乙酸盐，以及其他的任选的本领域可接受的稳定组分，包括但不限于β巯基乙醇、抗坏血酸和硫代硫酸盐中的至少一种。
43.丁基羟基茴香醚(bha)的浓度为0.1～2％wt，例如但不限于0.1、0.2、0.5、0.8、1.0、1.2、1.5、1.8或2.0％wt。2,6-二叔丁基对酚(bht)的浓度为0.1～2％wt，例如但不限于0.1、0.2、0.5、0.8、1.0、1.2、1.5、1.8或2.0％wt。乙二胺四乙酸盐的浓度为0.1～2％wt，例如但不限于0.1、0.2、0.5、0.8、1.0、1.2、1.5、1.8或2.0％wt。乙二胺四乙酸盐可选地本领域常规的盐，例如但不限于钠盐、钾盐或铵盐。β巯基乙醇的浓度为0.1～0.5％wt，例如但不限于0.1、0.2、0.3、0.4或0.5％wt。抗坏血酸的浓度为0.1～0.5％wt，例如但不限于0.1、0.2、0.3、0.4或0.5％wt。硫代硫酸盐的浓度为0.1～0.5％wt，例如但不限于0.1、0.2、0.3、0.4或0.5％wt。硫代硫酸盐可选地本领域常规的盐，例如但不限于钠盐、钾盐或铵盐。
44.稀释液组分包括牛血清白蛋白和缓冲液，所述牛血清白蛋白的浓度为0.1～1％wt，例如可以为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1％wt。缓冲液可选择本领域常规的缓冲液，例如但不限于磷酸盐缓冲液或生理盐水。
45.丁基羟基茴香醚(bha)和2,6-二叔丁基对酚(bht)不溶于水，易溶于有机试剂，因此稀释液组分中优选还含有有机相，有机相有助于bha和/或bht溶解，且利福平易溶于有机相，将bha和/或bht两种脂溶性抗氧剂溶于有机相，利于利福平长期稳定保存。在一些可选的实施方式中，有机相包括乙酸乙酯、异丙醇或二甲基亚砜，优选为乙酸乙酯。有机相的浓
度优选为1～4％v/v，例如但不限于1、2、3或4％v/v。在一些可选的实施方式中，所述稀释液组分中还含有表面活性剂，有机相可以和表面活性剂形成水包油型乳化剂，有利于抗结核药的长期保存。表面活性剂优选为非离子表面活性剂，更优选为吐温系列表面活性剂，例如但不限于吐温-20、吐温-40和吐温-80中的至少一种，优选为吐温-20。表面活性剂的浓度优选为2～5％v/v，例如但不限于2、3、4或5％v/v。
46.在一些优选的实施方式中，抗结核药血清替代基质包括丁基羟基茴香醚0.1～2％wt、2,6-二叔丁基对酚0.1～2％wt、乙二胺四乙酸盐0.1～2％wt、硫代硫酸盐0.1～0.5％wt、牛血清白蛋白0.1～1％wt、乙酸乙酯1～4％v/v、吐温-20 2～5％v/v和磷酸盐缓冲液。
47.进一步优选的实施方式中，抗结核药血清替代基质包括丁基羟基茴香醚0.5％wt、2,6-二叔丁基对酚0.5％wt、乙二胺四乙酸钠0.1％wt、硫代硫酸钠0.1％wt、牛血清白蛋白1％wt、乙酸乙酯4％v/v、吐温-20 5％v/v和磷酸盐缓冲液。
48.根据本发明的另一个方面，本发明还提供了上述抗结核药血清替代基质在制备抗结核药检测试剂或试剂盒，或在非诊断和治疗目的的检测抗结核药中的应用。
49.根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种抗结核药检测试剂或试剂盒，该试剂盒包含上述抗结核药血清替代基质。
50.在一些可选的实施方式中，所述试剂为标准品，所述标准品中含有吡嗪酰胺、异烟肼、乙胺丁醇和利福平中的至少一种，优选含有吡嗪酰胺、异烟肼、乙胺丁醇和利福平，该标准品以上述抗结核药血清替代基质作为基质。
51.在一些可选的实施方式中，所述试剂为质控品，所述质控品中含有吡嗪酰胺、异烟肼、乙胺丁醇和利福平中的至少一种，优选含有吡嗪酰胺、异烟肼、乙胺丁醇和利福平，该质控品以上述抗结核药血清替代基质作为基质。
52.在一些可选的实施方式中，所述试剂盒中包括上述标准品、质控品和上述抗结核药血清替代基质中的至少一种。可以理解的是，所述试剂盒中还可选地含有本领域可接受的用于检测抗结核药的试剂或耗材，包括但不限于流动相、分析物、内标和萃取试剂、沉淀试剂和ph调节剂中的至少一种。
53.根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种抗结核药检测方法，该抗结核药检测方法包括对吡嗪酰胺、异烟肼、乙胺丁醇和利福平中的至少一种进行检测，优选同时对吡嗪酰胺、异烟肼、乙胺丁醇和利福平进行检测。该抗结核药检测方法使用上述抗结核药血清替代基质作为标准品的替代基质。当该检测方法对吡嗪酰胺、异烟肼、乙胺丁醇和利福平中的至少一种进行检测时，所述标准品中含有对应分析物，并以上述抗结核药血清替代基质作为标准品基质。
54.在一些可选的实施方式中，所述检测方法还包括使用上述抗结核药血清替代基质作为质控品的替代基质，所述质控品中含有吡嗪酰胺、异烟肼、乙胺丁醇和利福平中的至少一种。
55.需要说明的是，本发明提供的抗结核药检测方法是非诊断和治疗目的的，其检测的血清样本来源例如但不限于小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、兔、雪貂、猫、狗、山羊、绵羊、奶牛、猪、马、猴或人。非诊断和治疗目的的检测抗结核药的实例例如可以为但不限于来源于上述哺乳动物的样本为实验动物样本，采用本发明的检测方法以提供实验结果，进一步用于抗结核药物作用机制研究或者药代动力学研究等领域；并且，知晓待测样本中的抗结核药的
含量，也不意味着其可以直接反应样本的健康状况，因此本发明提供的检测方法是非诊断和治疗目的的。本发明提供的抗结核药检测方法的关键发明构思在于采用上述抗结核药血清替代基质作为标准品的替代基质，在多种定量检测手段中均需要使用标准品构建标准曲线，因此本发明对具体的检测手段不做限制，具体的检测手段例如但不限于液相色谱法、气相色谱法、质谱法、高效液相色谱法和液相色谱串联质谱法等，只要使用以本发明提供的抗结核药血清替代基质作为标准品的替代基质，则属于本发明提供的抗结核药检测方法。
56.在一些可选的实施方式中，所述检测方法包括：将经过前处理的待测样本使用液相色谱串联质谱检测，将检测值带入标准曲线中，计算得到样本中抗结核药的含量。其中前处理优选使用液液萃取法对样本进行前处理。
57.在一些可选的实施方式中，色谱条件优选如下：流动相包括流动相a和流动相b；所述流动相a为水相，所述流动相b为有机相；所述流动相中含有甲酸和甲酸铵。流动相a进一步优选为含有0.1％v/v甲酸和5mm甲酸铵的水溶液；流动相b优选为甲醇。
58.液相色谱检测的洗脱程序优选如下：0min，流动相a 88％，流动相b12％；0.5min，流动相a 88％，流动相b12％；1.5min，流动相a 2.0％，流动相b 98％；3.0min，流动相a 2.0％，流动相b 98％；3.1min，流动相a 88％，流动相b12％；4.5min，流动相a 88％，流动相b12％。
59.在一些可选的实施方式中，质谱检测的离子源参数为如下：气帘气：25psi；碰撞气：7psi；离子源喷雾电压：5500v；离子源温度：500℃；离子源气体1：55psi；和，离子源气体2：60psi；正离子模式。质谱参数优选为表10记载的质谱参数。
60.在一些可选的实施方式中，所述标准曲线为标准品中分析物的含量与标准品检测值的对应关系；所述标准品检测值为标准品与内标的峰值比，所述峰值包括峰高或峰面积；优选以标准品浓度为自变量xi，以对应浓度标准品和内标的峰面积比值为因变量yi，计算线性回归方程y＝ax+b和相关系数r。
61.下面结合优选实施例进一步说明本发明的技术方案和技术效果。
62.下述实施例中涉及的试剂如表1所示，仪器如表2所示：
63.表1实验试剂
[0064][0065]
表2分析仪器
[0066]
仪器名称型号品牌液相色谱串联质谱仪ab sciex triple quad tm4500mdsciex
[0067]
表3其他仪器
[0068]
仪器名称型号品牌96孔板振荡器mb100-4a杭州奥盛96孔板离心机h2050r湘仪电子天平十万分之一梅特勒10μl移液器0.5-10μleppendorf200μl移液器20-200μleppendorf1000μl移液器100-1000μleppendorf
[0069]
实施例1
[0070]
本实施例提供了一种抗结核药血清替代基质，按照如下配方将各组分混合：
[0071]
稳定剂组分：0.5％wt丁基羟基茴香醚、0.5％wt 2,6-二叔丁基对酚、0.1％wt乙二胺四乙酸二钠、0.1％wtβ巯基乙醇和0.1％wt抗坏血酸。
[0072]
稀释液组分：1wt％牛血清白蛋白和磷酸盐缓冲液。
[0073]
将乙二胺四乙酸二钠、硫代硫酸钠、β巯基乙醇和牛血清白蛋白按照配方量溶解于磷酸盐缓冲液，得到抗结核药血清替代基质。
[0074]
实施例2
[0075]
本实施例提供了一种抗结核药血清替代基质，按照如下配方将各组分混合：
[0076]
稳定剂组分：0.2％wt丁基羟基茴香醚、0.2％wt 2,6-二叔丁基对酚、0.1％wt乙二
胺四乙酸二钠和0.5％wtβ巯基乙醇。
[0077]
稀释液组分：1wt％牛血清白蛋白和磷酸盐缓冲液。
[0078]
将丁基羟基茴香醚、2,6-二叔丁基对酚、乙二胺四乙酸二钠、β巯基乙醇和牛血清白蛋白按照配方量溶解于磷酸盐缓冲液，得到抗结核药血清替代基质。
[0079]
实施例3
[0080]
本实施例提供了一种抗结核药血清替代基质，按照如下配方将各组分混合：
[0081]
稳定剂组分：0.5％wt丁基羟基茴香醚、0.5％wt 2,6-二叔丁基对酚、0.1％wt乙二胺四乙酸二钠、0.5％wt硫代硫酸钠和0.5％wt抗坏血酸。
[0082]
稀释液组分：1wt％牛血清白蛋白、1％v/v乙酸乙酯和磷酸盐缓冲液。
[0083]
将丁基羟基茴香醚、2,6-二叔丁基对酚、乙酸乙酯和牛血清白蛋白按照配方量溶解于磷酸盐缓冲液，得到抗结核药血清替代基质。
[0084]
实施例4
[0085]
本实施例提供了一种抗结核药血清替代基质，按照如下配方将各组分混合：
[0086]
稳定剂组分：0.2％wt丁基羟基茴香醚、0.2％wt 2,6-二叔丁基对酚、0.1％wt乙二胺四乙酸二钠和0.1％wt硫代硫酸钠。
[0087]
稀释液组分：1wt％牛血清白蛋白、4％v/v乙酸乙酯、2％v/v吐温-20和磷酸盐缓冲液。
[0088]
将丁基羟基茴香醚、2,6-二叔丁基对酚、乙二胺四乙酸二钠、硫代硫酸钠、乙酸乙酯、吐温-20和牛血清白蛋白按照配方量溶解于磷酸盐缓冲液，得到抗结核药血清替代基质。
[0089]
实施例5
[0090]
本实施例提供了一种抗结核药血清替代基质，按照如下配方将各组分混合：
[0091]
稳定剂组分：0.5％wt丁基羟基茴香醚、0.5％wt 2,6-二叔丁基对酚、0.1％wt乙二胺四乙酸二钠和0.1％wt硫代硫酸钠。
[0092]
稀释液组分：1wt％牛血清白蛋白、4％v/v乙酸乙酯、5％v/v吐温-20和磷酸盐缓冲液。
[0093]
将丁基羟基茴香醚、2,6-二叔丁基对酚、乙二胺四乙酸二钠、硫代硫酸钠、乙酸乙酯、吐温-20和牛血清白蛋白按照配方量溶解于磷酸盐缓冲液，得到抗结核药血清替代基质。
[0094]
实施例6
[0095]
本实施例提供了一种抗结核药血清替代基质，按照如下配方将各组分混合：
[0096]
稳定剂组分：0.5％wt丁基羟基茴香醚、0.5％wt 2,6-二叔丁基对酚、0.1％wt乙二胺四乙酸二钠和0.1％wt硫代硫酸钠。
[0097]
稀释液组分：1wt％牛血清白蛋白、4％v/v乙酸乙酯、5％v/v吐温-20和生理盐水。
[0098]
将丁基羟基茴香醚、2,6-二叔丁基对酚、乙二胺四乙酸二钠、硫代硫酸钠、乙酸乙酯、吐温-20和牛血清白蛋白按照配方量溶解于生理盐水，得到抗结核药血清替代基质。
[0099]
对比例1
[0100]
本对比例提供了一种抗结核药血清替代基质，按照如下配方将各组分混合：
[0101]
稳定剂组分：0.1％wt乙二胺四乙酸二钠、0.1％wt硫代硫酸钠和0.1％wt抗坏血
酸；
[0102]
稀释液组分：1wt％牛血清白蛋白和磷酸盐缓冲液。
[0103]
将乙二胺四乙酸二钠、硫代硫酸钠、抗坏血酸和牛血清白蛋白按照配方量溶解于磷酸盐缓冲液，得到抗结核药血清替代基质。
[0104]
实施例7
[0105]
本实施例提供了一种抗结核药的检测方法，该检测方法检测抗结核药吡嗪酰胺、异烟肼、乙胺丁醇和利福平，包括如下步骤：
[0106]
(一)试剂配制：
[0107]
(1.1)抗结核药物储备液及次级储备液配置，参见表4和表5。
[0108]
表4
[0109]
化合物称重稀释液定容体积浓度编号吡嗪酰胺100mg甲醇10ml10mg/mlssc-pza异烟肼100mg甲醇10ml10mg/mlssc-inh乙胺丁醇100mg甲醇10ml10mg/mlssc-emb利福平100mg甲醇10ml10mg/mlssc-rmp
[0110]
表5
[0111][0112]
(1.2)替代基质：按照上述实施例配制。
[0113]
(1.3)校准品及质控品配置：
[0114]
校准品c1配置：取编号为ssc-pza储备液1ml，编号为sub-ssc-inh次级储备液0.4ml，编号为sub-ssc-emb次级储备液0.4ml，编号为sub-ssc-rmp次级储备液0.16ml，加入替代基质398.44ml。
[0115]
校准品c6配置：取编号ssc-pza储备液3.15ml，编号为ssc-inh储备液0.57ml，编号为ssc-emb储备液0.435ml，编号为sub-ssc-rmp储备液0.39ml，加入替代基质295.455ml。
[0116]
校准品c2～c6和质控品lqc、mqc和hqc使用c1和c6按照不同比例混合配制，比例参见表6。
[0117]
表6
[0118] c2c3c4c5lqcmqchqcc1(ml)6050402570.54519c6(ml)152535504.53056
[0119]
校准品和质控品配制后目标浓度如表7所示。
[0120]
表7
[0121][0122]
(1.4)内标萃取液：吡嗪酰胺的内标采用吡嗪酰胺-15
n,d3，异烟肼的内标采用异烟肼-d4，乙胺丁醇的内标采用乙胺丁醇-d4，利福平的内标采用利福平-d4，将各内标溶解于甲醇中，各内标的浓度分别为：吡嗪酰胺-15
n,d3约2.00μg/ml、异烟肼-d4约0.20μg/ml、乙胺丁醇-d4约0.02μg/ml、利福平-d4约1.00μg/ml。
[0123]
(二)样品处理方法：
[0124]
(1)加校准品、质控品溶液：移取50μl标准品溶液/质控品溶液，分别加至新的96孔板中。
[0125]
(2)加血清样本：移取50μl血清样本，分别加至96孔板中。
[0126]
(3)加内标萃取液：移取200μl内标萃取液，分别加入到以上对应的96孔板中，封板
后，1500rpm充分震荡10min。
[0127]
(4)离心：于4℃、4000rpm离心10min。取100μl上清液置于新的96孔板中。
[0128]
(5)稀释：加入300μl纯化水稀释上清液，封板后，1500rpm充分震荡5min。
[0129]
(6)离心：于4℃、4000rpm离心5min。
[0130]
(7)检测：将96孔板置于仪器中，1μl进样检测。
[0131]
(三)lc-ms/ms分析：
[0132]
(3.1)液相方法：
[0133]
(1)流动相组成：
[0134]
表8
[0135]
名称制备方法流动相a水(含0.1％甲酸+5mm甲酸铵)流动相b甲醇洗针液甲醇：乙腈：异丙醇＝1:1:1洗泵液10％异丙醇
[0136]
(2)梯度：
[0137]
表9
[0138]
时间(min)流速(ml/min)流动相a(％)流动相b(％)00.688.012.00.50.688.012.01.50.62.098.03.00.62.098.03.10.688.012.04.50.688.012.0
[0139]
(3.2)质谱方法：
[0140]
(1)离子信息：
[0141]
表10
[0142]
[0143][0144]
表10中标*表示定量离子对。
[0145]
(2)离子源参数
[0146]
表11
[0147][0148]
采用本实施例方法，使用实施例5替代基质检测吡嗪酰胺、异烟肼、乙胺丁醇和利福平的质谱图如图1所示。
[0149]
效果例1热加速稳定性验证
[0150]
(1)验证方法：
[0151]
分别使用实施例1～6和对比例1的替代基质配制目标化合物，然后分别放置于-80℃和37℃，每个样本重复三次，比较三天后-80℃与37℃条件下化合物与内标峰面积比值(area ratio)，检测方法同实施例6。
[0152]
(2)可接受标准：-80℃与37℃条件下稳定性样品相比偏差均在
±
15％以内，满足要求。
[0153]
(3)结果：实施例1～6的替代基质-80℃与37℃条件下稳定性样品相比偏差均在
±
15％以内，满足要求。实施例5的替代基质在对四个化合物的测定中，结果最优。
[0154]
表12吡嗪酰胺热加速稳定性
[0155][0156]
表13异烟肼热加速稳定性
[0157][0158][0159]
表14乙胺丁醇热加速稳定性
[0160][0161]
表15利福平热加速稳定性
[0162][0163]
效果例2和效果例3采用实施例5的替代基质，实施例7的方法检测。
[0164]
效果例2长期稳定性验证
[0165]
(1)验证方法：按照一定时间间隔，在每个时间点随机取在正常储存温度条件下(2℃～8℃)储存的试剂盒检测，每次取2盒，每盒检测3次。对这些稳定性研究数据进行统计处理，使用公式(1)～公式(4)进行趋势显著性检验。
[0166][0167][0168]
b1＝slope(,)
………………………………………………………
公式(3)；
[0169]
t0.05，n-2＝tinv(0.05,n-2)
………………………………………………
公式(4)。
[0170]
当|b1|＜t0.05，n-2时，表示趋势不显著，否则趋势显著。
[0171]
(2)可接受标准：对实时稳定性研究数据进行统计处理，其中包括在正常储存温度条件下(-20
±
5℃)保存13个月质控品的数据，对这些数据进行趋势显著性检验，趋势应不显著。
[0172]
(3)结果：如表16～19和图2～图5所示。
[0173]
表16吡嗪酰胺(pza)长期稳定性验证结果
[0174][0175][0176]
表17异烟肼(inh)长期稳定性验证结果
[0177][0178][0179]
表18乙胺丁醇(emb)长期稳定性验证结果
[0180][0181][0182]
表19利福平(rmp)长期稳定性验证结果
[0183][0184][0185]
效果例3基质效应
[0186]
(1)验证方法：使用至少6批来自不同供体的空白血清，对于每批血清，应该通过计算血清存在下的峰面积(由空白血清提取后加入分析物和内标测得)，与含替代基质的相应峰而积(由替代基质提取后加入分析物和内标测得)比值，计算每一分析物和内标的基质因
子，进一步通过分析物的基质因子除以内标的基质因子，计算经内标归一化的基质因子。
[0187]
(2)可接受标准：从6批基质计算的内标归一化的基质因子的变异系数小于15％。
[0188]
(3)结果：
[0189]
表20人血清基质中吡嗪酰胺和吡嗪酰胺-15
n,d3的基质效应分析
[0190][0191]
表21人血清基质中异烟肼和异烟肼-d4的基质效应分析
[0192][0193][0194]
表22人血清基质中乙胺丁醇和乙胺丁醇-d4的基质效应分析
[0195][0196]
表23人血清基质中利福平和利福平-d4的基质效应分析
[0197][0198][0199]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

技术特征：
1.一种抗结核药血清替代基质，其特征在于，所述抗结核药包括吡嗪酰胺、异烟肼、乙胺丁醇和利福平中的至少一种，所述抗结核药血清替代基质包括稳定剂组分和稀释液组分；所述稳定剂组分包括丁基羟基茴香醚0.1～2％wt、2,6-二叔丁基对酚0.1～2％wt和乙二胺四乙酸盐0.1～2％wt；所述稀释液组分包括牛血清白蛋白和缓冲液，所述牛血清白蛋白的浓度为0.1～1％wt。2.根据权利要求1所述的抗结核药血清替代基质，其特征在于，所述稳定剂组分包括丁基羟基茴香醚0.2～0.5％wt、2,6-二叔丁基对酚0.2～0.5％wt和乙二胺四乙酸盐0.1～2％wt。3.根据权利要求1所述的抗结核药血清替代基质，其特征在于，所述稳定剂组分还包括β巯基乙醇、抗坏血酸和硫代硫酸盐中的至少一种；优选地，β巯基乙醇、抗坏血酸和硫代硫酸盐的浓度分别独立的为0.1～0.5％wt。4.根据权利要求1所述的抗结核药血清替代基质，其特征在于，所述缓冲液包括磷酸盐缓冲液或生理盐水。5.根据权利要求1所述的抗结核药血清替代基质，其特征在于，所述稀释液组分还包括有机相；优选地，所述有机相选自乙酸乙酯、异丙醇或二甲基亚砜；优选地，所述有机相的浓度为1～4％v/v；优选地，所述稀释液组分还包括表面活性剂；优选地，所述表面活性剂的浓度为2～5％v/v；优选地，所述表面活性剂选自非离子表面活性剂；优选地，所述表面活性剂选自吐温；优选地，所述表面活性剂选自吐温-20、吐温-40和吐温-80中的至少一种。6.根据权利要求1～5任一项所述的抗结核药血清替代基质，其特征在于，所述抗结核药血清替代基质包括丁基羟基茴香醚0.1～2％wt、2,6-二叔丁基对酚0.1～2％wt、乙二胺四乙酸盐0.1～2％wt、硫代硫酸盐0.1～0.5％wt、牛血清白蛋白0.1～1％wt、乙酸乙酯1～4％v/v、吐温-20 2～5％v/v和磷酸盐缓冲液。7.根据权利要求6所述的抗结核药血清替代基质，其特征在于，所述抗结核药血清替代基质包括丁基羟基茴香醚0.5％wt、2,6-二叔丁基对酚0.5％wt、乙二胺四乙酸钠0.1％wt、硫代硫酸钠0.1％wt、牛血清白蛋白1％wt、乙酸乙酯4％v/v、吐温-20 5％v/v和磷酸盐缓冲液。8.权利要求1～7任一项所述的抗结核药血清替代基质在制备抗结核药检测试剂或试剂盒，或在非诊断和治疗目的的检测抗结核药中的应用。9.一种抗结核药检测试剂或试剂盒，其特征在于，包含权利要求1～7任一项所述的抗结核药血清替代基质；优选地，所述试剂为标准品或质控品，所述标准品或质控品以权利要求1～7任一项所述的抗结核药血清替代基质为基质，所述标准品或质控品含有吡嗪酰胺、异烟肼、乙胺丁醇和利福平中的至少一种；
优选地，所述标准品或质控品含有吡嗪酰胺、异烟肼、乙胺丁醇和利福平。10.一种抗结核药检测方法，其特征在于，包括使用权利要求1～7任一项所述的抗结核药血清替代基质作为标准品的替代基质，所述标准品中含有吡嗪酰胺、异烟肼、乙胺丁醇和利福平中的至少一种；优选地，还包括使用权利要求1～7任一项所述的抗结核药血清替代基质作为质控品的替代基质，所述质控品中含有吡嗪酰胺、异烟肼、乙胺丁醇和利福平中的至少一种；优选地，所述检测方法包括：将经过前处理的待测样本使用液相色谱串联质谱检测，将检测值带入标准曲线中，计算得到样本中抗结核药的含量。

技术总结
本发明提供了一种抗结核药血清替代基质及其应用，涉及检测试剂的技术领域。该抗结核药血清替代基质包括稳定剂组分和稀释液组分；稳定剂组分包括丁基羟基茴香醚0.1～2％wt、2,6-二叔丁基对酚0.1～2％wt和乙二胺四乙酸盐0.1～2％wt；稀释液组分包括牛血清白蛋白0.1～1％wt和缓冲液。该抗结核药血清替代基质可以作为吡嗪酰胺、异烟肼、乙胺丁醇和利福平中至少一种抗结核药的替代基质。该替代基质缓解了现有技术中存在的抗结核药在替代基质中不稳定且易失效的技术问题。稳定且易失效的技术问题。稳定且易失效的技术问题。


技术研发人员：张新星 郑佳 栗琳 应洪波 周继福 薛元强 赵炽娜 周立 丁亮 钱双柱
受保护的技术使用者：江苏豪思睦可生物科技有限公司 北京豪思医学检验实验室有限公司 湖南豪思生物科技有限公司
技术研发日：2023.07.05
技术公布日：2023/10/7