自我维持能力提高的间充质干细胞的筛选方法及由此筛选出的间充质干细胞与流程

1.本技术要求于2020年12月7日提交的韩国专利申请第10-2020-0169835号的优先权，所述说明书全文为本技术的参考文献。
2.本发明涉及一种自我维持能力提高的间充质干细胞的筛选方法。


背景技术：

3.间充质干细胞(mesenchymal stem cell)为一种多能性(multipotent)细胞，分离自骨髓、脂肪组织、胎盘、脐带血等多种组织，可分化为骨骼、软骨、肌肉、脂肪和成纤维细胞。正在积极开展研究，通过利用间充质干细胞的特性再生不可再生的组织或细胞，以利用间充质干细胞作为各种疾病的治疗剂。然而，作为一种细胞治疗剂，间充质干细胞的问题在于，供体变异(donor variation)大，生产良率低，生产成本高，在体内存活时间短，从而不具有长期治疗效果。
4.因此，在用于开发干细胞治疗剂的干细胞的生产中，需要筛选具有高增殖潜能和良好疗效的间充质干细胞。


技术实现要素：

5.技术问题
6.本发明的一方面提供一种自我维持能力提高的间充质干细胞的筛选方法，其包括：培养间充质干细胞后，测量自我维持因子(mscs self-maintenance factor，msmf)的表达或活性水平。
7.本发明的另一方面提供一种根据所述方法筛选的间充质干细胞。
8.本发明的另一方面提供一种细胞凋亡抑制剂，其包括间充质干细胞或自我维持因子(mscs self-maintenance factor，msmf)，所述间充质干细胞经过基因工程改造以减少msmf的表达或与亲本细胞相比抑制msmf的表达。
9.本发明的另一方面提供一种用于预防或治疗肌肉疾病的药物组合物，其包括间充质干细胞或自我维持因子(mscs self-maintenance factor，msmf)，所述间充质干细胞经过基因工程改造以分泌msmf或与亲本细胞相比过度表达msmf。
10.本发明的另一方面提供一种用于预防或治疗肌肉疾病的药物组合物，其包括自我维持因子(mscs self-maintenance factor，msmf)作为活性成分。
11.本发明的另一方面提供一种用于预防或改善肌肉疾病的保健功能食品组合物，其包括自我维持因子(mscs self-maintenance factor，msmf)作为活性成分。
12.本发明的另一方面提供一种细胞治疗剂，其包括间充质干细胞或自我维持因子(mscs self-maintenance factor，msmf)，所述间充质干细胞经过基因工程改造以分泌msmf或与亲本细胞相比过度表达msmf。
13.本发明的另一方面提供一种预防或治疗肌肉疾病的方法，其包括：向有需要的个
no：10所示的第二引物组。
22.所述msmf的表达或活性水平的测量可以选自由逆转录聚合酶反应、竞争性逆转录聚合酶反应、实时逆转录聚合酶反应、rnase保护分析法、northern印迹法和dna芯片。另外，可以选自白质芯片分析、免疫测定法、配体结合分析、基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(matrix desorption/ionization time of flight mass spectrometry，maldi-tof)分析、表面加强激光解析电离飞行时间质谱(surface enhanced laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，seldi-tof)分析、放射线免疫分析、放射免疫扩散法、欧氏(ouchterlony)免疫扩散法、火箭免疫电泳、组织免疫染色、补体结合分析法、二维电泳分析法、液相色谱-质谱法(liquid chromatography-mass spectrometry，lc-ms)，液相色谱-质谱/质谱法(liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry，lc-ms/ms)、蛋白印迹法和酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay，elisa)。
23.通过分离与未用msmf的表达或活性抑制剂处理的对照组相比所述msmf的表达或活性水平降低的间充质干细胞，可以筛选出培养基中自我维持能力所提高的间充质干细胞。在一实施例中，经证实，随着msmf表达的降低，间充质干细胞的迁移能力、集落形成能力和细胞增殖能力下降。另外，经证实，所述间充质干细胞的倍增时间增加。因此，msmf的表达或活性在所述自我维持能力所提高的间充质干细胞中增加，并且可以通过分离所述msmf的表达或活性被维持或降低的间充质干细胞来获得所需细胞。根据所述方法，其优点在于，不仅可以早期筛选出增殖能力强的间充质干细胞以降低生产成本，还可以实现间充质干细胞的大规模生产。
24.本发明的另一方面提供一种根据所述方法筛选的间充质干细胞。本发明的又一方面提供一种细胞凋亡抑制剂，其包括间充质干细胞和/或自我维持因子(mscs self-maintenance factor，msmf)，所述间充质干细胞经过基因工程改造以减少(msmf)的表达或与亲本细胞相比抑制msmf的表达。本发明的再一方面提供一种抑制细胞凋亡的方法，其包括：将间充质干细胞和/或msmf在体外(in vitro)与细胞接触，或在体内(in vivo)施用于实验动物，其中，所述间充质干细胞经过基因工程改造以减少msmf的表达或与亲本细胞相比抑制msmf的表达。所述间充质干细胞可以为增加了自我维持所必需的msmf表达的。即，所述间充质干细胞可具有改善的干性(stemness)、迁移能力、集落形成能力和/或细胞增殖能力。另外，所述间充质干细胞可具有缩短的细胞倍增时间(doubling time)。即，msmf的表达与倍增时间可以呈负相关。
25.如本文所用，术语“基因工程(genetic engineering)”或“基因工程改造(genetically engineered)”是指将至少一种的基因修饰(genetic modification)引入细胞或由其产生的细胞。例如，可以对所述间充质干细胞或宿主细胞进行基因工程改造以增加msmf或其活性片段的表达或活性，例如，其可以包括编码msmf或其活性片段的外源基因。所述活性的增加可以意味着，与给定的未经基因工程改造的亲本细胞(例如，野生型)不具有或具有的内源蛋白质或酶的活性相比，同类型的蛋白质或酶具有更高的活性。与其亲本细胞相比，所述外源基因的表达量足以增加所述间充质干细胞或宿主细胞中上述蛋白质的活性。所述外源基因可以通过表达载体导入亲本细胞内。另外，所述外源基因可以以线性多核苷酸的形式导入亲本细胞内。另外，所述外源基因可以从细胞中的表达载体(例如，质粒)
表达。此外，所述外源基因可以通过插入到细胞内的遗传物质(例如，染色体)中以表达来稳定表达。
26.本发明的另一方面提供一种用于预防或治疗肌肉疾病的药物组合物，其包括间充质干细胞和/或自我维持因子(mscs self-maintenance factor，msmf)，所述间充质干细胞经过基因工程改造以减少msmf的表达或与亲本细胞相比抑制msmf的表达。本发明的又一方面提供一种预防或治疗肌肉疾病的方法，其包括：向个体施用所述间充质干细胞和/或msmf。经过基因工程改造以分泌所述msmf或与亲本细胞相比过度表达msmf的间充质干细胞或msmf的具体内容如上所述。在一实施例中，经证实，通过将由细胞凋亡诱导的肌肉细胞与经siaurka和sidock2处理的间充质干细胞共培养，抑制细胞凋亡，并促进细胞增殖。因此，aurka和dcock2 mrna或其蛋白可用于通过抑制肌肉细胞的细胞凋亡来预防或治疗肌肉疾病。
27.所述肌肉疾病可以例如为夏科-马利-杜斯氏病(charcot-marie-tooth disease)、脊髓性肌萎缩症(spinal muscular atrophy，sma)、肌萎缩性侧索硬化症(lou gehrig’s disease)、杜兴氏肌肉萎缩症(duchenne muscular dystrophy)、强直型肌肉萎缩症(myotonic dystrophy)、肌肉减少症(sarcopenia)，肌肉萎缩症(muscular atrophy)、肌无力症(myasthenia)、肌营养不良症(muscular dystrophy)、肌强直症(myotonia)、肌张力减退(hypotonia)、肌肉衰弱(muscular weakness)、肌肉退行萎缩症(muscular dystrophy)、肌萎缩侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis)和炎症性肌病(inflammatory myopathy)等。
28.本发明的另一方面提供一种用于预防或治疗肌肉疾病的药物组合物，其包括自我维持因子(mscs self-maintenance factor，msmf)作为活性成分。根据一具体实施例，所述msmf可分离自间充质干细胞。
29.根据另一具体实施例，所述组合物还可以包括间充质干细胞。所述间充质干细胞可分泌msmf或其活性片段，或可经基因工程改造以分泌msmf或其活性片段。具体地，为了结构或治疗目的的诱导，可以通过改变、增强或补充细胞功能的方法在细胞培养物中插入或注入dna来修饰所述间充质干细胞。因此，可以组合施用所述msmf和间充质干细胞。
30.根据本发明一方面的用于预防或治疗肌肉疾病的药物组合物按照常规方法可以分别制成如散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂、气雾剂等口服制剂的形式、外用剂、栓剂和无菌注射液等的形式使用，并且为了制剂，可以包括通常用于制备药物组合物的合适的载体、赋形剂或稀释剂。
31.所述载体或赋形剂或稀释剂可以包括各种化合物或混合物，例如，乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯树胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油等。
32.在制剂的情况下，可以使用稀释剂或赋形剂制备，例如常用的填充剂、增重剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂和表面活性剂。
33.对用于口服施用的固体制剂而言，可以通过将至少一种赋形剂与所述豆类提取物混合来制备，例如淀粉、碳酸钙、蔗糖或乳糖、明胶等。另外，除了简单的赋形剂以外，还可以使用硬脂酸镁和滑石粉等润滑剂。
34.口服液体制剂包括混悬剂、口服溶液剂、乳剂、糖浆剂等，除了常用的简单稀释剂即水和液体石蜡外，还可以包括各种赋形剂，例如润湿剂、甜味剂、芳香剂和保存剂等。
35.用于非口服施用的制剂可以包括无菌水溶液、非水性溶剂、悬浮剂、乳剂、冻干制剂和栓剂。作为非水性溶剂和悬浮剂，可以使用丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油和可注射酯如油酸乙酯等。作为栓剂的基质，可以使用合成脂肪酸酯(witepsol)、聚乙二醇(macrogol)、吐温(tween)61、可可脂、月桂脂肪、甘油明胶等。
36.根据本发明一方面的用于预防或治疗肌肉疾病的药物组合物的优选剂量根据患者的状况、体重、疾病严重程度、药物类型、给药途径和周期而不同，但可以由本领域技术人员适当地选择。然而，为了获得优选效果，可以每天0.0001mg/kg至2000mg/kg的剂量施用，优选地，以0.001mg/kg至2000mg/kg的剂量施用。可以每天施用一次或分成数次施用。然而，本发明的范围不受所述剂量的限制。
37.根据本发明一方面的用于预防或治疗肌肉疾病的药物组合物可以通过多种途径施用于哺乳动物，例如大鼠、小鼠、家畜和人等。施用的所有方式可以通过例如口服、直肠或静脉、肌肉、皮下、子宫内膜或脑室内(intracerebroventricular)注射执行。
38.本发明的又一方面提供一种用于预防或改善肌肉疾病的保健功能食品组合物，其包括间充质干细胞或msmf，所述间充质干细胞经过基因工程改造以减少自我维持因子(mscs self-maintenance factor，msmf)的表达或与亲本细胞相比抑制msmf的表达。所述间充质干细胞或msmf的具体内容如上所述。
39.在根据本发明一方面的用于预防或改善肌肉疾病的保健功能食品中，当将所述化合物用作保健功能食品的添加物时，其可以直接添加，也可以与其他食品或食品成分一起使用，可以按照常规方法适当使用。活性成分的混合量可以根据预防、保健或治疗等各使用目的适当确定。
40.保健功能食品的剂型可以包括散剂、颗粒剂、丸剂、片剂或胶囊剂的形式，也可以包括任何形式的普通食品或饮料。
41.所述食品的种类不受特别限制，作为可添加所述物质的食品，可添加所述物质的食品的例子包括肉类、香肠、面包、巧克力、糖果、点心类、饼干类、披萨、拉面、其他面条类、口香糖类、包括冰淇淋的乳制品、各种汤、饮料、茶、饮品、酒精饮料和维生素复合剂等，可以包括常规意义上的所有食品。
42.通常，在制备食品或饮料时，基于100重量份的原料，所述化合物的添加量可以为15重量份或更少，优选可以为10重量份或更少。然而，以保健卫生或健康管理为目的长期摄取的情况下，所述添加量可以小于等于所述范围，并且使用天然物的馏分在安全性方面没有问题，从而所述添加量可以大于等于所述范围。
43.在根据本发明一方面的保健功能食品中，饮料可以包括各种矫味剂或天然碳水化合物作为附加成分，如常规饮料。上述天然碳水化合物可以为单糖如葡萄糖和果糖、双糖如麦芽糖和蔗糖、多糖如糊精和环糊精和糖醇如木糖醇、山梨糖醇和赤藓糖醇。作为甜味剂，可以使用如奇异果甜蛋白和甜叶菊提取物的天然甜味剂，或如糖精和阿斯巴甜的合成甜味剂等。所述天然碳水化合物的比例可以为每100ml根据本发明的饮料约0.01g至0.04g，优选约0.02g至0.03g。
44.除了上述之外，根据本发明一方面的用于预防或改善肌肉疾病的保健功能食品可
以包括各种营养剂、维生素、电解质、调味剂、着色剂、果胶酸及其盐、海藻酸及其盐、有机酸、保护性胶体增稠剂、ph调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、酒精和碳酸饮料中使用的碳酸化剂。此外，本发明的用于改善睡眠的组合物可以包括果肉，其用于生产天然果汁、果汁饮料和蔬菜饮料。这些组分可以单独或组合使用。这些添加剂的比例不受限制，但通常基于100重量份本发明的保健功能食品，通常在0.01重量份至0.1重量份的范围内选择。
45.本发明的另一方面提供一种细胞治疗剂，其包括所述间充质干细胞作为活性成分。所述间充质干细胞的具体内容如上所述。
46.如本文所用，术语“细胞治疗剂”作为以治疗、诊断和预防为目的，使用从个体分离、培养和特殊操作而制成的细胞和组织的医药品(美国fda规定)，是指为了恢复细胞或组织的功能，通过在体外增殖和选择活的自体、同种异体或异种细胞，或通过其他方法改变细胞生物学特性等一系列行为，达到治疗、诊断和预防目的的医药品。另外，术语“治疗”是指通过施用所述细胞治疗剂来改善或有益地改变疾病症状的任何行为。所述间充质干细胞具有增加的msmf表达，与炎症疾病、免疫疾病或癌症相关的fbln5、tnfaip6、anxa3、il6、pou2f2、tnfaip2、inhba、vegfa、csf2、gata3、cxcl1、hmgb1、bst2、aurka等的表达可以增加。因此，根据一实施方式，所述细胞治疗剂可用于治疗肌肉疾病、炎症疾病、免疫疾病或癌症。
47.所述炎症疾病可以例如为特应性反应、牛皮癣、皮炎、过敏反应、关节炎、鼻炎、中耳炎、喉咙痛、扁桃体炎、膀胱炎、肾炎、盆腔炎、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、强直性脊柱炎、系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，sle)、哮喘、水肿、迟发性过敏(iv型过敏)、移植物排斥、移植物抗宿主病、自身免疫性脑脊髓炎、多发性硬化症、炎症性肠病、囊性纤维化、糖尿病视网膜病变、缺血再灌注损伤、血管再狭窄、肾小球肾炎或胃肠道过敏等。
48.所述免疫疾病可以例如为类风湿性关节炎、i型糖尿病、自身免疫性疾病如多发性硬化症和系统性红斑狼疮、哮喘、脑炎(encephalitis)、炎症性肠炎、慢性阻塞性肺病、过敏反应、脓毒性休克、肺纤维化、未分化型脊椎关节病、未分化型关节病、关节炎、炎性骨质溶解、慢性病毒或细菌感染引起的慢性炎症等炎性疾病等。
49.所述癌症可以例如为多发性骨髓瘤、肺癌、肝癌、胃癌、大肠癌、结肠癌、皮肤癌、膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、甲状腺癌、肾癌、纤维肉瘤，黑色素瘤，血癌等。
50.所述细胞治疗剂可以按照制药领域的常规方法配制成适合施用于患者体内的单位剂量型药物制剂进行施用，所述制剂包括通过一次或多次施用有效的剂量。适用于该目的的剂型优选为非口服施用制剂，如注射用安瓿等注射剂、输液袋等注射剂和气雾剂等喷雾制剂等。所述注射用安瓿可以在临用前与注射液混合以配置，作为注射液，可以使用生理盐水、葡萄糖、甘露醇、林格氏液等。另外，输液袋的材料可以为聚氯乙烯或聚乙烯，例如可以包括baxter、becton dickinson、medcep、national hospital products或terumo等公司的输液袋。
51.除了所述活性成分外，所述药物制剂还可以包括一种或多种药学上可接受的常规惰性载体，例如，对注射剂而言，可以包括保存剂、镇痛剂、增溶剂或稳定剂等，对局部施用制剂而言，可以包括赋形剂、润滑剂或保存剂等。
52.如此制备的本发明的细胞治疗剂或药物制剂可以与用于移植和其他用途的其他干细胞一起或以与这些干细胞的混合物的形式使用本领域常用的施用方法施用，优选地，可以直接植活或移植到需要治疗的患者的病变区域，或者直接移植或注射到腹腔内，但不
限于此。另外，对所述施用而言，可以通过使用导管的非手术施用和切开患部后注射或移植等的手术施用方法来进行，但更优选使用导管的非手术施用方法。另外，也可以按照常规方法以非口服形式进行，例如，除了直接施用至病变之外，可以通过作为一般方法的血管内注射进行移植。
53.所述间充质干细胞的日剂量可以为1.0
×
104个细胞/kg体重至1.0
×
10
10
个细胞/kg体重，优选2.5
×
105个细胞/kg体重至5
×
107个细胞/kg体重，一次或分次施用。然而，应当理解，活性成分的实际剂量根据待治疗的疾病、疾病的严重程度、施用途径以及患者的体重、年龄和性别等各种相关因素来确定，从而所述剂量不以任何方式限制本发明的范围。
54.所述间充质干细胞可用于各种类型的治疗方案，所述治疗方案通过植活、移植或注入所需细胞群来增强、治疗或替换身体的组织或器官。
55.所述细胞治疗剂组合物可以未冷冻状态使用或冷冻以备将来使用。如果需要冷冻，可以在冷冻前将标准冷冻保存剂(例如dmso、甘油、细胞冷冻培养基(cascade biologics))添加到细胞群中。
56.如上所述，根据本发明一方面的间充质干细胞或msmf可以通过抑制肌肉细胞的细胞凋亡而用作各种肌肉疾病的预防或治疗剂，所述肌肉疾病包括扭伤、挫伤和痉挛。
57.有益效果
58.根据本发明一方面的方法可以通过筛选自我更新能力优异的间充质干细胞来减少供体变异(donor variation)，并且可以大量确保间充质干细胞，从而可用于细胞治疗剂的开发。另外，其优点在于，根据所述方法筛选的间充质干细胞可以通过增加体内的存活时间来提高治疗效果。
附图说明
59.图1a为p-high组和p-low组的倍增时间(doubling time)的示意图。
60.图1b为比较p-low组和p-high组中自我维持相关基因表达水平的结果图。
61.图1c为比较p-low组和p-high组中被选为msmf候选基因的aurka和dock2的表达水平的图表。
62.图2a为通过所选的sirna序列比较aurka和dock2的相对mrna表达的图表。
63.图2b为将siaurka和sidock2转染到间充质干细胞以敲低msmf基因后确认aurka和dock2蛋白表达水平的结果图。
64.图2c为将siaurka和sidock2转染到间充质干细胞以敲低msmf基因后通过facs确认干性的图表。
65.图3a为将siaurka和sidock2转染到间充质干细胞以敲低msmf基因后确认间充质干细胞的迁移能力的结果图。
66.图3b为将siaurka和sidock2转染到间充质干细胞以敲低msmf基因后确认间充质干细胞的集落形成与否的图表。
67.图3c为将siaurka和sidock2转染到间充质干细胞以敲低msmf基因后测量间充质干细胞的倍增时间(doubling time)的图表。
68.图3d为将siaurka和sidock2转染到间充质干细胞以敲低msmf基因后确认间充质干细胞的细胞增殖能力的结果图。
69.图3e和3f为确认抑制aurka和dock2基因的表达对参与细胞增殖的激酶akt和erk以及参与迁移能力的激酶fak和jnk的磷酸化影响的结果图。
70.图4a为10批(lot)间充质干细胞中aurka和dock2的mrna相对表达水平的比较图表。
71.图4b为依次列出10批间充质干细胞倍增时间的图表。
72.图4c为测量间充质干细胞中aurka和dock2的mrna表达水平与倍增时间之间相关性的图表。
73.图4d为确认间充质干细胞中aurka和dock2蛋白表达水平的结果图。
74.图4e和4f为确认间充质干细胞中akt、erk、fak和jnk的磷酸化水平的结果图。
75.图5a为将间充质干细胞与诱导细胞凋亡的肌肉细胞共培养，以确认根据aurka和dock2的mrna表达水平的细胞凋亡相关蛋白表达的结果图。
76.图5b为将间充质干细胞与诱导细胞凋亡的肌肉细胞共培养，以确认根据aurka和dock2的mrna表达水平的细胞凋亡减少程度的结果图。
77.图6a为将敲低aurka和dock2基因的间充质干细胞与诱导细胞凋亡的肌肉细胞共培养，以确认抑制aurka和dock2基因的表达引起的细胞凋亡相关蛋白表达的结果图。
78.图6b为将敲低aurka和dock2基因的间充质干细胞与诱导细胞凋亡的肌肉细胞共培养，以确认抑制aurka和dock2基因的表达引起的细胞凋亡减少程度的结果图。
79.图6c为确认敲低aurka基因的间充质干细胞中xcl1蛋白表达水平的结果图。
80.图7a为在肌营养不良症小鼠模型中根据间充质干细胞的aurka mrna表达水平的差异确认肌肉组织的细胞凋亡抑制功效的结果图。
81.图7b为在肌营养不良症小鼠模型中根据间充质干细胞的aurka mrna表达水平的差异确认对肌肉组织细胞凋亡抑制功效的差异的结果图。
82.图8a为在肌营养不良症小鼠模型中根据间充质干细胞的aurka mrna表达水平确认细胞保留程度的图表。
83.图8b为在肌营养不良症小鼠模型中根据间充质干细胞的aurka mrna表达水平确认肌肉组织的纤维化抑制功效的结果图。
84.图8c为在肌营养不良症小鼠模型中根据间充质干细胞的aurka mrna表达水平确认肌肉组织的纤维化程度的结果图。
具体实施方式
85.在下文中，提供了优选的实施例以帮助理解本发明。然而，以下实施例仅为了便于理解本发明而提供，本发明的内容不受以下实施例的限制。
86.【实施例】
87.实施例1、间充质干细胞的分离和培养
88.获得三星首尔医院研究审查委员会(institutional review board，irb)的批准(irb no.2011-10-134)，所有样本均在知情同意的情况下收集。通过现有已知的方法分离间充质干细胞。将分离的细胞以3
×
103个细胞/cm2的密度分配在含有10％胎牛血清(fetal bovine serum(fbs)，invitrogen-gibco)和50μg/ml庆大霉素(invitrogen-gibco)的α-最低必需培养基(minimum essential medium(mem)，invitrogen-gibco，rockville，md)中，
并在37℃和5％co2条件下培养。
89.实施例2、间充质干细胞的形态和倍增时间的确认及基因表达的比较分析
90.将所述实施例1中分离培养的间充质干细胞按照三星首尔医院的良好生产规范(good manufacturing practice，gmp)分为合格的间充质干细胞和未合格的间充质干细胞。检查根据所述标准分类的各间充质干细胞的倍增时间的结果，确认了合格的间充质干细胞具有比未合格的间充质干细胞更快的倍增时间。基于这些结果，根据倍增时间将其分为增殖高(proliferation-high，p-high)组和增殖低(proliferation-low，p-low)组，然后确认了倍增时间(doubling time)。此后，比较和分析与p-low组相比在p-high组中高表达的基因。具体而言，从p-low组和p-high组分别提取rna后，使用agilent 2100生物分析仪(agilent 2100bioanalyzer)测量rna质量(rna quality)，并分析迁移(migration)和峰(peak)模式。使用illumina hiseq 2500进行微阵列(microarray)，以比较和分析p-high组中log2倍数变化(log2 fold change)的表达比p-low组高出三倍或更高的基因。
91.图1a为p-high组和p-low组的倍增时间(doubling time)的示意图。
92.结果如图1a所示，p-high组的间充质干细胞倍增时间为28.4
±
1.2小时，而p-low组的间充质干细胞倍增时间为47.9
±
1.6小时，显示出比p-high组长1.6倍。
93.图1b为比较p-low组和p-high组中自我维持相关基因表达水平的结果图。绿色表示与p-low组相比，p-high组中表达较低的基因，红色表示与p-low组相比，p-high组中表达较高的基因。图1c为比较p-low组和p-high组中被选为msmf候选基因的aurka和dock2的表达水平的图表。
94.结果如图1b所示，在与p-low组相比，p-high组中log2倍数变化值的差异大于等于3倍的基因中，鉴定出33个参与粘附(adhesion)、分化(differentiation)、趋化性(chemotaxis)或增殖(proliferation)的基因。尤其，在所述33个基因中，与p-low组相比，在p-high组中高表达的基因被鉴定为coro1a、stx1b、hmgb1、dock2、aurka、slc9a4、chrm3、npr3、rarres2和anxa3。另外，如图1c所示，与p-low组相比，aurka和dock2在p-high组中的表达高约4倍，表明具有统计学上显着差异。因此，
95.基于上述结果，通过比较参与粘附(adhesion)、分化(differentiation)、趋化性(chemotaxis)或增殖(proliferation)的基因的表达水平，将显示出统计学上显着差异的aurka和dock2选为msmf基因的最终候选。
96.实施例3、通过敲低(knock-down)功效验证的最佳序列选择
97.3-1、aurka和dock2的sirna候选序列选择和mrna表达水平确认
98.使用所述实施例2中选为msmf基因的aurka和dock2的sirna文库验证敲低效果后，选择最佳序列。具体地，将生长培养基中以约50％培养的间充质干细胞转移至无血清培养基后，使用脂质体rnaimax(invitrogen)以25nm的浓度转染sirna文库中针对aurka和dock2各自的三个候选序列(bioneer公司)(见下表1)。48小时后，使用通用rna提取试剂盒(universal rna extraction kit)从间充质干细胞中提取rna，并使用2x强力sybr绿色预混合(2x power sybr green master mix)(ab)进行qrt-pcr。然后，通过比较相对mrna的表达，选择表现出最大敲低效果的序列作为抑制aurka和dock2表达的最佳序列。
99.【表1】
[0100][0101]
从结果可见，对siaurka而言，候选3的序列显示出最大的敲低效果，而对sidock2而言，候选2的序列显示出最大的敲低效果。
[0102]
因此，在使用siaurka的候选3序列和sidock2的候选2序列转染间充质干细胞后，比较由所选的候选引起的aurka和dock2的相对mrna表达率以确认序列的特异性。
[0103]
图2a为通过所选的sirna序列比较aurka和dock2的相对mrna表达的图表。
[0104]
从结果可见，如图2a所示，对aurka而言，与sinc和sidock2处理组相比，siaurka处理组中mrna的表达显着减少，而对dock2而言，与sinc和siaurka处理组相比，sidock2处理组中mrna的表达显着减少。即，所选的sirna序列可以对各msaf基因具有序列特异性。
[0105]
3-2、aurka和dock2蛋白表达水平的确认
[0106]
通过蛋白印迹法证实aurka和dock2蛋白的表达水平是否被所述实施例3-1中选择的sirna序列降低。具体地，将siaurka(候选3)和sidock2(候选2)分别转染到间充质干细胞，培养72小时后，用磷酸盐缓冲盐水(pbs)洗涤间充质干细胞。此后，使用含有蛋白酶抑制剂混合物(protease inhibitor cocktail)(amresco，美国艾奥瓦州索伦)的ripa缓冲液(biosesang，韩国京畿道城南)溶解后，在4℃、15000g下离心30分钟以获得上清液。取30μg蛋白进行sds-page电泳以按大小分离后，转移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride，pvdf)膜上。将所述膜用含5％脱脂乳(skim milk)的tbst室温封闭1小时，将一抗用含5％脱脂乳的tbst稀释，于4℃反应过夜。然后，用tbst洗膜3次10分钟，将二抗再次用含5％脱脂牛奶的tbst稀释，在室温反应1小时。此后，将膜用tbst洗涤3次10分钟，用ecl溶液(advansta，美国)处理后，使用凝胶成像系统(gel imaging system)(amersham imager 600，ge healthcare，英国白金汉郡)确认条带图像。使用图像j测量蛋白质的表达水平并用β-肌动蛋白(β-actin)校正。将aurka(invitrogen，加拿大)、dock2(santa cruz biotechnology，美国得克萨斯州达拉斯)和β-肌动蛋白(santa cruz biotechnology，美国
得克萨斯州达拉斯)用作一抗。
[0107]
图2b为将siaurka和sidock2转染到间充质干细胞以敲低msmf基因后确认aurka和dock2蛋白表达水平的结果图。
[0108]
结果，如图2b所示，与sinc处理对照组相比，siaurka处理组和sidock2处理组中aurka的蛋白表达水平和dock2的蛋白表达水平分别显着降低至0.51
±
0.06倍和0.76
±
0.04倍，其具有统计学上显著意义。
[0109]
3-3、干性确认
[0110]
使用所述实施例3-1中选择的序列将siaurka和sidock2转染到间充质干细胞并敲低后，进行facs以确认干性。作为间充质干细胞的标志物，通过cd44、cd73、cd90、cd105和cd166的表达鉴定，作为造血干细胞系统的标志物，使用cd14、cd11b、hla-dr(mhcii)、cd34、cd45和cd19(bd biosciences，美国)将干性与msaf sinc处理对照组进行比较。此时，使用bd facs verse流式细胞仪(bd facs verse flow cytometer)获得并分析10000个事件(event)。
[0111]
图2c为将siaurka和sidock2转染到间充质干细胞以敲低msmf基因后通过facs确认干性的图表。
[0112]
结果，如图2c所示，所述细胞均表达阳性标志物(positive marker)cd44、cd73、cd90、cd105和cd166，但没有表达阴性标志物(negative marker)cd14、cd11b、hla-dr(mhcii)、cd34、cd45和cd19。也就是说，即使aurka和dock2在间充质干细胞中被sirna敲低，也可以看出干性没有变化。
[0113]
实施例4、aurka和dock2表达抑制与迁移能力、集落形成能力、倍增时间、细胞增殖和激酶(kinase)磷酸化之间的相关性确认
[0114]
4-1、aurka和dock2表达抑制与迁移能力的相关性
[0115]
为了确认aurka和dock2表达抑制与间充质干细胞的迁移能力之间的相关性，进行了伤口愈合分析(wound healing assay)。具体地，使用含10％fbs的α-最低必需培养基(minimum essential medium(mem)，invitrogen-gibco，rockville，md)，将sinc和将所述实施例3-1中选择的siaurka、sidock2转染的间充质干细胞以1
×
105个细胞/孔分配在12孔板中，培养48小时。然后，为了抑制细胞增殖，用不含fbs的memα培养基冲洗2次，将10μg/ml的丝裂霉素c(sigma-aldrich，美国密苏里州圣路易斯)添加到memα培养基并培养2小时。此后，使用200移液器吸头进行划痕(scratch)。用培养液冲洗5次后，经过0小时和24小时后通过显微镜以40倍放大倍数拍摄图像。使用java的图像j(image j)软件对所拍摄的图像进行定量分析，细胞迁移能力用伤口闭合(wound closure)的百分比表示。
[0116]
图3a为将siaurka和sidock2转染到间充质干细胞以敲低msmf基因后确认间充质干细胞的迁移能力的结果图。
[0117]
结果，如图3a所示，sinc处理对照组的迁移能力为61.02
±
1.0％，而siaurka处理组和sidock2处理组的迁移能力分别为44.06
±
1.87％和47.18
±
2.93％。即，经证实，随着aurka和dock2基因的表达降低，间充质干细胞的迁移能力显着降低。
[0118]
4-2、aurka和dock2表达抑制与集落形成能力的相关性
[0119]
确认了aurka和dock2表达抑制与间充质干细胞的集落形成能力之间的相关性。具体地，使用含10％fbs的α-最低必需培养基(minimum essential medium(mem)，
invitrogen-gibco，rockville，md)，将sinc和将所述实施例3-1中选择的siaurka、sidock2转染的间充质干细胞以1
×
103个细胞/孔分配在6孔板中，培养14天。然后，用pbs冲洗所述细胞并用冷的100％甲醇(methanol)固定20分钟。固定后的细胞用1％结晶紫溶液(crystal violet solution)(sigma-aldrich，美国密苏里州圣路易斯)染色30分钟，用蒸馏水冲洗3次或更多次，仅计数由50个或更多个细胞组成的集落。
[0120]
图3b为将siaurka和sidock2转染到间充质干细胞以敲低msmf基因后确认间充质干细胞的集落形成与否的图表。
[0121]
结果，如图3b所示，sinc处理对照组的集落数为30.7
±
4.0，而sirna处理组和sidock2处理组的集落数分别减少到13.0
±
2.7和11.0
±
1.4。即，经证实，随着aurka和dock2基因的表达降低，间充质干细胞的形成显着减少。
[0122]
4-3、aurka和dock2表达抑制与倍增时间的相关性
[0123]
确认了aurka和dock2表达抑制与间充质干细胞的倍增时间之间的相关性。具体地，使用含10％fbs的α-最低必需培养基(minimum essential medium(mem)，invitrogen-gibco，rockville，md)，将sinc和将所述实施例3-1中选择的siaurka、sidock2转染的间充质干细胞以3
×
103个细胞/cm2的密度分配在12孔板中，并在分配0小时、24小时、72小时和144小时后，分别测量细胞数以确认倍增时间。
[0124]
图3c为将siaurka和sidock2转染到间充质干细胞以敲低msmf基因后测量间充质干细胞的倍增时间(doubling time)的图表。
[0125]
结果，如图3c所示，sinc处理对照组的倍增时间为31.1
±
0.4小时，而siaurka处理组和sidock2处理组的倍增时间分别为55.3
±
0.8小时，59.2
±
0.8小时。即，经证实，随着aurka和dock2基因的表达降低，间充质干细胞的倍增时间显着增加。
[0126]
4-4、aurka和dock2表达抑制与细胞增殖能力的相关性
[0127]
确认了aurka和dock2表达抑制与间充质干细胞的细胞增殖能力之间的相关性。具体地，使用含10％fbs的α-最低必需培养基(minimum essential medium(mem)，invitrogen-gibco，rockville，md)，将sinc和将所述实施例3-1中选择的siaurka、sidock2转染的间充质干细胞以2
×
103个细胞/孔的密度分配在96孔板中，并在分配0小时、24小时、72小时和144小时后，使用细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8(cck-8)，dojindo，日本东京)在450nm处测量吸光度。
[0128]
图3d为将siaurka和sidock2转染到间充质干细胞以敲低msmf基因后确认间充质干细胞的细胞增殖能力的结果图。
[0129]
结果，如图3d所示，细胞培养24小时后，siaurka和sidock2的处理组与sinc处理对照组相比在细胞增殖能力方面没有差异。然而，经证实，48小时后，与sinc处理对照组相比，siaurka和sidock2处理组的细胞增殖能力下降，并且随着时间的推移，细胞的增殖在更大程度上减少。
[0130]
4-5、aurka和dock2表达抑制与激酶(kinase)磷酸化的相关性
[0131]
确认了aurka和dock2表达抑制与akt、erk、fak和jnk的磷酸化之间的相关性。具体地，除了使用akt、p-akt、p-erk(r&d，minneapolis，美国明尼苏达州)、erk、fak、p-fak、jnk、p-jnk(cell signaling technology，美国马萨诸塞州丹弗斯)和β-肌动蛋白(beta-actin)(santa cruz biotechnology，美国得克萨斯州达拉斯)作为一抗外，与所述实施例3-2相同
的方法进行蛋白印迹法。
[0132]
图3e和3f为确认抑制aurka和dock2基因的表达对参与细胞增殖的激酶akt和erk以及参与迁移能力的激酶fak和jnk的磷酸化影响的结果图。
[0133]
结果，经证实，如图3e和图3f所示，aurka表达的抑制导致akt和fak磷酸化的抑制，dock2表达的抑制导致akt、erk、jnk磷酸化的抑制。即，可以看出，aurka通过akt和fak影响细胞增殖和迁移能力，dock2通过akt、erk和jnk影响细胞增殖。
[0134]
结合所述实施例4的结果可以看出，aurka和dock2基因通过影响间充质干细胞的迁移能力、集落形成能力和细胞增殖来参与自我维持。
[0135]
实施例5、aurka和dock2的表达水平与倍增时间和激酶(kinase)磷酸化的相关性确认
[0136]
5-1、间充质干细胞的aurka和dock2 mrna表达水平与倍增时间的相关性
[0137]
由于间充质干细胞存在供体变异(donor variation)大的问题，因此通过确认间充质干细胞的aurka和dock2 mrna表达水平与倍增时间之间的相关性来筛选减少供体变异的间充质干细胞。具体地，使用含10％fbs的α-最低必需培养基(minimum essential medium(mem)，invitrogen-gibco，rockville，md)，将取自10名不同供体的10个间充质干细胞以3
×
103个细胞/cm2的密度分配到25t烧瓶中，生长至80％左右时提取rna以进行qrt-pcr后，比较aurka和dock2的相对mrna表达水平。另外，确认所述10个间充质干细胞的倍增时间后，通过皮尔森(pearson)相关性分析确认了aurka和dock2基因的表达水平与细胞的倍增时间之间的相关性。
[0138]
图4a为10个不同间充质干细胞中aurka和dock2的mrna相对表达水平的比较图表。
[0139]
结果如图4a所示，msc_a在10个干细胞中aurka mrna的表达水平最高，msc_c在10个干细胞中dock mrna的表达水平最高。另一方面，对msc_j而言，aurka和dock2的mrna表达水平最低。
[0140]
图4b为依次列出10个不同间充质干细胞倍增时间的图表。
[0141]
结果如图4b所示，msc_a的倍增时间最短，为20.9
±
0.6小时，msc_j的倍增时间最长，为41.9
±
0.6小时。所述10个间充质干细胞的平均倍增时间为27.6
±
1.8小时。
[0142]
图4c为测量间充质干细胞中aurka和dock2的mrna表达水平与倍增时间之间相关性的图表。
[0143]
结果如图4c所示，aurka mrna的表达水平与倍增时间呈很强的负相关性，即r＝-0.757，dock2 mrna的表达水平与倍增时间呈强的负相关性，即r＝-0.536(p《0.01)。
[0144]
因此，间充质干细胞中aurka和dock2基因的表达水平越高，倍增时间越短，从而通过测量aurka和dock2基因的表达水平，可以很容易地筛选出具有高自我更新能力的间充质干细胞。
[0145]
5-2、间充质干细胞的aurka和dock2 mrna表达水平与aurka和dock2蛋白表达水平的相关性
[0146]
确认了间充质干细胞的aurka和dock2 mrna表达水平与aurka和dock2蛋白表达水平的相关性。具体地，除了使用在生长培养基中以约80％培养的间充质干细胞外，以与所述实施例3-2相同的方式进行蛋白印迹法。此后，筛选出aurka的mrna表达水平最高的msc a、dock2的mrna表达水平最高的msc c和aurka和dock2的mrna表达水平均相对较低的msc_j
(参见图4a)，以确认aurka和dock2的蛋白表达水平的差异。
[0147]
图4d为确认间充质干细胞中aurka和dock2蛋白表达水平的结果图。
[0148]
如图4d所示，与msc_a和msc_c相比，msc_j中aurka和dock2的蛋白表达分别降低至0.31
±
0.05倍和0.59
±
0.02倍。即，可以确认，aurka和dock2的mrna表达低的间充质干细胞也减少了代表其功能的蛋白质表达。
[0149]
5-3、间充质干细胞的aurka和dock2 mrna表达水平与激酶(kinase)磷酸化的相关性
[0150]
为了确认间充质干细胞中aurka和dock2 mrna表达水平与akt、erk、fak和jnk磷酸化之间的相关性，以与所述实施例4-5相同的方式进行蛋白印迹法。
[0151]
图4e和4f为确认间充质干细胞中akt、erk、fak和jnk的磷酸化水平的结果图。
[0152]
结果，如图4e和图4f所示，对msc_a和msc_c而言，参与细胞增殖的激酶akt和erk与参与迁移能力的激酶fak和jnk的磷酸化没有显着差异。然而，可以确认，对msc_j而言，与msc_a和msc_c相比，akt的磷酸化减少至0.46
±
0.08倍，erk的磷酸化减少至0.37
±
0.07倍。另外，可以确认，fak的磷酸化减少至0.79
±
0.03倍，jnk的磷酸化减少至0.56
±
0.05倍。
[0153]
因此，间充质干细胞中aurka和dock2的mrna和蛋白表达水平的差异影响参与细胞增殖和迁移能力的激酶的磷酸化，所述基因高表达的间充质干细胞可以通过akt和/或erk的磷酸化促进细胞增殖，并通过fak和/或jnk的磷酸化促进迁移能力。
[0154]
实施例6、间充质干细胞的aurka和dock2表达水平与细胞凋亡的相关性确认
[0155]
6-1、根据间充质干细胞的aurka和dock2基因表达水平的细胞凋亡相关蛋白的表达确认
[0156]
为了确认间充质干细胞的细胞凋亡抑制功效，证实了aurka和dock2的表达水平与裂解的parp(cleaved parp)和裂解的半胱天冬酶-3(cleaved caspase 3)的表达之间的相关性。具体地，使用含10％fbs和1u/ml青霉素/链霉素(gibco brl，纽约州格兰德岛)的杜尔贝科改良伊格尔培养基(dulbecco's modified eagle's medium(dmem)，biowest sas，法国尼阿耶)，将肌肉细胞c2c12以8
×
103个细胞/cm2的密度分配在6孔板中并培养24小时后，再使fbs饥饿(starvation)24小时以诱导细胞死亡。此后，使用插入物(insert)将诱导细胞凋亡的肌肉细胞与间充质干细胞共培养。使用裂解的多聚(adp-核糖)聚合酶(cleaved poly adp ribose polymerase(parp))(cell signaling technology，美国马萨诸塞州丹佛斯)、裂解的半胱天冬酶-3(cleaved caspase 3)(cell signaling technology，美国马萨诸塞州丹佛斯)和β-肌动蛋白(beta-actin)(santa cruz biotechnology，美国)作为一抗进行蛋白印迹法，并比较细胞凋亡程度。
[0157]
图5a为将间充质干细胞与诱导细胞凋亡的肌肉细胞共培养，以确认根据aurka和dock2的mrna表达水平的细胞凋亡相关蛋白表达的结果图。
[0158]
结果，如图5a所示，可以确认，与诱导细胞凋亡的对照组相比，与间充质干细胞共培养的实验组中裂解的parp和裂解的半胱天冬酶-3的表达水平降低。具体地，与诱导细胞凋亡的对照组相比，在与msc_a或msc_c共培养的实验组中，裂解的半胱天冬酶-3的表达水平分别降低至0.41
±
0.07和0.38
±
0.07倍，裂解的parp的表达水平分别显著降低至0.37
±
0.06和0.35
±
0.05倍(p《0.001)。然而与msc_j共培养的实验组中，裂解的半胱天冬酶-3的表达水平为0.66
±
0.07倍，裂解的parp的表达水平为0.78
±
0.01倍，与诱导细胞凋亡的对
照组略有差异。即，可见，间充质干细胞中aurka和dock2的mrna表达水平越低，抑制肌肉细胞的细胞凋亡的能力越低。
[0159]
6-2、根据间充质干细胞的aurka和dock2基因表达水平的细胞凋亡减少程度的确认
[0160]
为了确认所述实施例6-1中c2c12细胞的细胞凋亡的减少程度，使用细胞凋亡/细胞坏死检测试剂盒(apoptosis/necrosis detection kit)(abcam，美国马萨诸塞州剑桥)进行活/死染色(live/dead staining)。具体地，将以与所述实施例6-1相同方法诱导细胞凋亡的肌肉细胞和间充质干细胞共培养的实验组用pbs洗涤2次，然后用可确认细胞凋亡的apopxin绿色指示剂(apopxin green indicator)和可确认活细胞的cytocalcein紫色450(cytocalcein violet 450)在遮光状态下反应1小时。然后，将细胞用pbs洗涤2次，通过用荧光显微镜成像而获得图像。使用图像j测量凋亡细胞在总细胞中的比例。
[0161]
图5b为将间充质干细胞与诱导细胞凋亡的肌肉细胞共培养，以确认根据aurka和dock2的mrna表达水平的细胞凋亡减少程度的结果图。
[0162]
结果如图5b所示，与诱导细胞凋亡的对照组相比，与间充质干细胞共培养的实验组中细胞凋亡均受到抑制。具体地，在诱导细胞凋亡的对照组中，凋亡细胞的百分比为52.04
±
1.93％，而在与msc_a、msc_c或msc_j共培养的实验组中，分别降低至22.50
±
2.17％、25.72
±
1.53％和31.87
±
1.99％(p《0.001)。尤其，对与aurka的mrna表达水平最高的msc_a共培养的实验组而言，与与msc_j共培养的实验组相比，凋亡细胞的比例显着降低(p《0.001)。
[0163]
由此可见，aurka和dock2的mrna表达水平低的间充质干细胞与诱导细胞凋亡的肌肉细胞共培养时，抑制细胞凋亡的功效降低。
[0164]
实施例7、aurka和dock2基因表达抑制与细胞凋亡之间的相关性确认
[0165]
7-1、aurka和dock2基因表达抑制引起的细胞凋亡相关蛋白的表达确认
[0166]
为了确认aurka和dock2基因的敲低是否影响细胞凋亡抑制功效，分别将间充质干细胞、sinc和经所述实施例3-1中选择的siaurka或sidock2处理的间充质干细胞与诱导细胞凋亡的肌肉细胞共培养后，以与所述实施例6-1相同的方法确认蛋白质表达。
[0167]
图6a为将敲低aurka和dock2基因的间充质干细胞与诱导细胞凋亡的肌肉细胞共培养，以确认抑制aurka和dock2基因的表达引起的细胞凋亡相关蛋白表达的结果图。
[0168]
结果如图6a所示，与对照组(诱导细胞凋亡的肌肉细胞)相比，与间充质干细胞共培养的实验组显着减少了裂解的半胱天冬酶-3和裂解的parp的蛋白表达。具体地，与诱导细胞凋亡的对照组相比，与间充质干细胞、sinc处理组、siaurka处理组和sidock2处理组共培养的肌肉细胞中裂解的半胱天冬酶-3的表达水平分别降低了0.34
±
0.04、0.30
±
0.02、0.52
±
0.05和0.40
±
0.04倍(p《0.001)。另外，经证实，与诱导细胞凋亡的对照组相比，与间充质干细胞、sinc处理组、siaurka处理组和sidock2处理组共培养的肌肉细胞中裂解的parp的表达水平分别降低了0.39
±
0.07、0.45
±
0.04、0.72
±
0.043和0.54
±
0.045倍(msc、sinc和sidock2，p《0.001；siaurka，p《0.01)。尤其，经证实，与sinc处理组相比，与诱导细胞凋亡的肌肉细胞共培养的siaurka处理组中，裂解的半胱天冬酶-3和解列的parp的表达水平在统计学上显着增加(p《0.01)。
[0169]
7-2、aurka和dock2基因表达抑制引起的细胞凋亡减少程度的确认
[0170]
为了确认aurka和dock2基因表达抑制引起的细胞凋亡减少程度，分别将间充质干细胞、sinc和经所述实施例3-1中选择的siaurka或sidock2处理的间充质干细胞与诱导细胞凋亡的肌肉细胞共培养后，以与所述实施例6-2相同的方法确认。
[0171]
图6b为将敲低aurka和dock2基因的间充质干细胞与诱导细胞凋亡的肌肉细胞共培养，以确认抑制aurka和dock2基因的表达引起的细胞凋亡减少程度的结果图。
[0172]
结果，如图6b所示，经证实，与间充质干细胞共培养的实验组与对照组(诱导细胞凋亡的肌肉细胞)相比显着抑制了细胞凋亡。具体地，在诱导细胞凋亡的对照组中，细胞凋亡率为41.73
±
1.03％，而对与间充质干细胞、sinc处理组、siaurka处理组和sidock2处理组共培养的肌肉细胞而言，分别降低至17.93
±
1.40％、17.79
±
2.06％、32.75
±
2.24％和25.62
±
2.29％(p《0.001)。尤其，经证实，与sinc处理组相比，与诱导细胞凋亡的肌肉细胞共培养的siaurka处理组的细胞凋亡率显着增加(p《0.001)。
[0173]
因此，当aurka被敲低时，细胞凋亡抑制功效大大降低，由此可见，间充质干细胞对肌肉细胞的细胞凋亡抑制功效受aurka的影响大于受dock2的影响。
[0174]
7-3、aurka基因表达抑制引起的xcl1蛋白表达水平的变化确认
[0175]
证实了间充质干细胞对肌肉细胞的凋亡抑制功效是否与aurka基因的表达水平直接相关。具体地，使用所述实施例3-1中选择的sirna敲低间充质干细胞中的aurka基因后，确认了细胞凋亡抑制功效。除了将xcl1(r&d，美国明尼苏达州明尼阿波利斯)和β-肌动蛋白(santa cruz biotechnology，美国)用作一抗之外，以与所述实施例3-2相同的方法进行蛋白印迹法。
[0176]
图6c为确认敲低aurka基因的间充质干细胞中xcl1蛋白表达水平的结果图。
[0177]
结果，如图6c所示，随着aukra基因的表达被抑制，参与细胞凋亡抑制的蛋白质xcl1的表达水平降低。具体地，与sinc处理组相比，siaurka处理组的xcl1表达水平降低了0.44
±
0.07倍(p《0.01)。即，aurka基因可以直接影响xcl1的表达，从而表现出间充质干细胞对肌肉细胞的细胞凋亡抑制功效。
[0178]
实施例8、间充质干细胞的aurka mrna表达水平与肌肉组织的细胞凋亡之间的相关性确认
[0179]
8-1、根据间充质干细胞的aurka mrna表达水平的肌肉细胞的细胞凋亡的抑制确认
[0180]
通过膜联蛋白v(annexin v)染色确认了根据aurka mrna表达水平的间充质干细胞的肌肉细胞凋亡抑制功效。具体地，将间充质干细胞以1
×
105个细胞/100μl的单剂量施用至肌营养不良症小鼠模型(mdx)的尾静脉。此时，使用aurka的mrna表达水平最高的mcs_a、aurka的mrna表达水平中值的mcs_e和aurka的mrna表达水平最低的mcs_j，所述aurka为所述实施例7的结果中确定直接影响细胞凋亡抑制的aurka。1周后，处死小鼠并通过分离小腿肌肉而获得组织。然后，除了使用膜联蛋白v(abcam，美国马萨诸塞州剑桥)和β-肌动蛋白(santa cruz biotechnology，美国得克萨斯州达拉斯)作为一抗之外，以与所述实施例3-2相同的方法确认蛋白表达。
[0181]
图7a为在肌营养不良症小鼠模型中根据间充质干细胞的aurka mrna表达水平的差异确认肌肉组织的细胞凋亡抑制功效的结果图。
[0182]
结果，如图7a所示，当施用mcs_a和mcs_e时，与mdx对照组相比，膜联蛋白v的表达
水平分别降低了0.58
±
0.05和0.67
±
0.04倍，但当施用mcs_j时，与对照组无统计学上显著差异。即，可以证实aurka的mrna表达水平越低，细胞凋亡抑制功效越低。
[0183]
8-2、根据间充质干细胞的aurka mrna表达水平的肌肉细胞的细胞凋亡程度的确认
[0184]
通过膜联蛋白v染色确认了根据aurka mrna表达水平的肌肉细胞的细胞凋亡抑制程度。具体地，以与所述实施例8-1相同的方法分离mdx小鼠模型的大腿和小腿肌肉后，用石蜡组织切片(paraffin tissue section)洗涤所切下的组织，并在室温下用5％封闭液反应。然后，将其与以1/500浓度稀释的膜联蛋白抗体(abcam，英国剑桥)在4℃下反应18小时。将反应完成的组织洗涤后，与alexa594 affinipure羊抗兔igg(h+l)二抗(thermo fisher scientific，伊利诺伊州罗克福德)室温反应1小时，用hoechst 33342(thermo fisher scientific，伊利诺伊州罗克福德)复染(counter-stain)，使用carl zeiss lsm 700共聚焦显微镜系统从组织获得荧光图像。通过java的图片j软件对所拍摄的图像进行定量分析，以获得相对于mdx对照组的值。
[0185]
图7b为在肌营养不良症小鼠模型中根据间充质干细胞的aurka mrna表达水平的差异确认对肌肉组织细胞凋亡抑制功效的差异的结果图。
[0186]
结果，如图7b所示，当施用mcs_a、mcs_f和mcs_l时，与mdx对照组相比，膜联蛋白v的相对强度分别降低了0.41
±
0.05、0.43
±
0.07和0.64
±
0.06倍。尤其，当施用aurka表达最高的mcs_a时，与施用aurka表达最低的mcs_j时相比，膜联蛋白v的相对强度显着降低。即，aurka mrna高表达的间充质干细胞更有效地抑制受损肌肉细胞的细胞凋亡，从而所述间充质干细胞可用于肌肉疾病的治疗剂。
[0187]
实施例9、间充质干细胞的aurka mrna表达水平与肌肉组织的纤维化抑制功效的确认
[0188]
9-1、根据间充质干细胞的aurka mrna表达水平的肌肉组织的保留程度的确认
[0189]
确认了根据肌营养不良症小鼠模型(mdx)的腿部肌肉中保留的间充质干细胞数量的肌肉组织的纤维化抑制功效。具体地，在以与所述实施例8-1相同的方法分离mdx小鼠模型的大腿和小腿肌肉后，使用gentra puregene组织试剂盒(gentra puregene tissue kit)(qiagen inc.)提取dna，并使用人alu(human alu)引物进行实时pcr(real-time pcr)。
[0190]
图8a为在肌营养不良症小鼠模型中根据间充质干细胞的aurka mrna表达水平确认细胞保留程度的图表。
[0191]
结果，如图8a所示，在施用msc_a、msc_f和msc_j的肌营养不良症小鼠模型的腿部肌肉中保留的间充质干细胞数量分别为41.23
±
5.60、42.68
±
8.71和16.96
±
8.44。尤其，可以确认，当施用aurka mrna表达水平最低的msc_j时，肌营养不良症小鼠模型的腿部肌肉中保留的间充质干细胞数量最少。即，aurka mrna高表达的间充质干细胞迁移到受损的肌肉细胞，更多的细胞保留在受损区域，从而有助于恢复肌肉。
[0192]
9-2、根据间充质干细胞的aurka mrna表达水平的肌肉细胞的纤维化抑制的确认
[0193]
通过纤连蛋白的表达与否，确认了根据aurka mrna的表达水平的肌肉组织的纤维化抑制功效。具体地，除了使用纤连蛋白(fibronectin)(abcam，美国马萨诸塞州剑桥)和β-肌动蛋白(santa cruz biotechnology，美国得克萨斯州达拉斯)作为一抗之外，以与所述
实施例8-2相同的方法确认蛋白表达。
[0194]
图8b为在肌营养不良症小鼠模型中根据间充质干细胞的aurka mrna表达水平确认肌肉组织的纤维化抑制功效的结果图。
[0195]
结果，如图8b所示，当施用mcs_a、mcs_e和mcs_j时，与对照组相比，纤连蛋白的表达水平分别降低了0.54
±
0.04、0.60
±
0.03和0.71
±
0.05倍。即，aurka mrna高表达的间充质干细胞可以通过降低纤连蛋白的表达，有效抑制受损肌肉细胞的纤维化。
[0196]
9-3、根据间充质干细胞的aurka mrna表达水平的肌肉细胞的纤维化确认
[0197]
通过胶原蛋白的积累与否，确认了根据aurka mrna的表达水平的肌肉组织的纤维化抑制功效。具体地，以与所述实施例8-1相同的方法洗涤mdx小鼠模型的大腿肌肉组织后，在室温下与天狼星红(picro-sirius red)(溶液a)反应1小时。然后，用酸化水(acidified water)(溶液b)洗涤2次，封片(mounting)后，使用scanscope获得图像。通过java的图片j软件对所拍摄的图像进行定量分析，以获得相对于mdx对照组的值。
[0198]
图8c为在肌营养不良症小鼠模型中根据间充质干细胞的aurka mrna表达水平确认肌肉组织的纤维化程度的结果图。
[0199]
结果，如图8c所示，当施用mcs_a、mcs_e和mcs_j时，与对照组相比，胶原蛋白的积累分别减少了0.26
±
0.04、0.27
±
0.03和0.73
±
0.04倍。即，aurka mrna高表达的间充质干细胞可以通过减少胶原蛋白的表达，有效抑制受损肌肉细胞的纤维化。
[0200]
本发明的上述描述仅用于例示，本发明所属领域的普通技术人员将理解，在不改变本发明的技术精神或基本特征的情况下，可以容易地将其修改为其他具体形式。因此，应当理解，如上所述的实施例在所有方面都是示例性的，而不是限制性的。

技术特征：
1.一种自我维持能力提高的间充质干细胞的筛选方法，其包括：培养间充质干细胞后，测量自我维持因子(mscs self-maintenance factor，msmf)的表达或活性水平。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述间充质干细胞来源于脐带、脐带血、骨髓、脂肪、肌肉神经、皮肤、羊膜、绒毛膜、蜕膜或胎盘。3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述msmf为参与粘附、分化、趋化性或增殖的基因。4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述基因选自fbkn4、olr1、tnfaip6、anxa3、ilo6、pou2f2、tnfaip2、serpine2、inhba、vegra、hmgb1、csf2、gata3、pcsk6、syn1、f2rl1、dock2、slcoq4、stx1b、rarres2、cxcl1、fgf7、plau、scg2、nr4a3、cord01a、chrm3、npr3、bst2m、gata4m、creg1m、fgf7m、tpel5和aurka。5.一种间充质干细胞，其通过权利要求1所述的方法筛选。6.根据权利要求5所述的间充质干细胞，其中，所述间充质干细胞为msmf表达增加的间充质干细胞。7.一种间充质干细胞，其经过基因工程改造以分泌自我维持因子(mscs self-maintenance factor，msmf)或与亲本细胞相比过度表达msmf。8.一种用于预防或治疗肌肉疾病的药物组合物，其包括间充质干细胞或自我维持因子(mscs self-maintenance factor，msmf)，所述间充质干细胞经过基因工程改造以分泌msmf或与亲本细胞相比过度表达msmf。9.一种用于预防或治疗肌肉疾病的药物组合物，其包括自我维持因子(mscs self-maintenance factor，msmf)作为活性成分。10.根据权利要求9所述的药物组合物，其还包括：间充质干细胞。11.根据权利要求9所述的药物组合物，其中，所述msmf从间充质干细胞中分离。12.一种用于预防或改善肌肉疾病的保健功能食品组合物，其包括间充质干细胞或自我维持因子(mscs self-maintenance factor，msmf)，所述间充质干细胞经过基因工程改造以分泌msmf或与亲本细胞相比过度表达msmf。13.一种细胞治疗剂，其包括间充质干细胞作为活性成分，其中，所述间充质干细胞经过基因工程改造以分泌自我维持因子(mscs self-maintenance factor，msmf)或与亲本细胞相比过度表达msmf。14.根据权利要求13所述的细胞治疗剂，其用于治疗肌肉疾病、炎症疾病、免疫疾病或癌症。15.一种预防或治疗肌肉疾病的方法，其包括：向有需要的个体施用药学有效量的间充质干细胞或自我维持因子(mscs self-maintenance factor，msmf)，所述间充质干细胞经过基因工程改造以分泌msmf或与亲本细胞相比过度表达msmf。16.一种包括间充质干细胞或自我维持因子(mscs self-maintenance factor，msmf)的组合物在治疗肌肉疾病中的用途，其中，所述间充质干细胞经过基因工程改造以分泌msmf或与亲本细胞相比过度表达msmf。17.一种包括间充质干细胞或自我维持因子(mscs self-maintenance factor，msmf)的组合物在制备肌肉疾病治疗剂中的用途，其中，所述间充质干细胞经过基因工程改造以分泌自我维持因子(msmf)或与亲本细胞相比过度表达msmf。

技术总结
本发明涉及一种自我维持能力提高的间充质干细胞的筛选方法，其中可以筛选自我更新能力优异的间充质干细胞来减少供体变异，并且可以大量确保自我更新能力优异的间充质干细胞，并用于细胞治疗剂的开发。并用于细胞治疗剂的开发。并用于细胞治疗剂的开发。


技术研发人员：藏钟旭 田洪培 朴相彦 金宣姃
受保护的技术使用者：恩塞尔有限公司
技术研发日：2021.11.19
技术公布日：2023/10/11