自噬抑制剂在Mn

自噬抑制剂在mn
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暴露引起的ndds的预防或治疗药物上的应用
技术领域
1.本发明涉及医药技术领域，具体涉及自噬抑制剂在mn
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暴露引起的ndds的预防或治疗药物上的应用。


背景技术：

2.众所周知，重金属是神经退行性疾病(ndds)病理发展的潜在因素。其中，锰(mn)暴露导致与ndds相关的tau蛋白的病理积累已成为一个主要的公共卫生问题，然而锰诱导的神经毒性的机制仍不完全清楚，但其带来的后果却十分严重。ndds包括让人们闻之色变的阿尔茨海默病(ad)和帕金森病(pd)，会导致神经网络的结构和功能以及中枢神经系统(cns)或外周神经系统(pns)神经元的损伤，影响全球数百万人的生活。
3.锰暴露导致tau蛋白的病理积累，我们在ad大脑的突触末端发现了低聚体、错误折叠和磷酸化的tau蛋白，tau蛋白的病理积累和扩散是ndds的主要特征，与突触丧失、神经退行性变和认知功能下降密切相关，因此能使tau蛋白下降的药物通常被认为具有治疗ad、pd等ndds的潜力。如何降低mn
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暴露引起的tau蛋白升高，就是如何治疗mn
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暴露引起的ndds的关键。


技术实现要素：

4.针对现有技术中的上述问题，本发明人出人意料地发现了mn
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暴露引发的ndds的致病机理，另外本发明提供自噬抑制剂在mn
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暴露引起的ndds的预防或治疗药物上的应用。自噬抑制剂能够有效恢复自噬溶酶体降解功能，从而解决mn
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暴露引起的tau、aβ斑块、α-synuclein等特征性蛋白的沉积问题。
5.本发明采用的技术方案如下：
6.自噬抑制剂在mn
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暴露引起的ndds的治疗药物上的应用。
7.自噬抑制剂3-ma在mn
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暴露引起的重复病的治疗药物上的应用。
8.更进一步地，所述ndds为阿尔茨海默病。
9.更进一步地，所述ndds为帕金森病
10.综上所述，相比于现有技术，本发明具有如下优点及有益效果：
11.本发明首次证明了mn
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通过激活cgas-sting通路来损害自噬溶酶体降解功能，进而诱导tau、aβ斑块、α-synuclein等特征性蛋白的沉积的mn
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毒害路径，并发现使用自噬抑制剂能够有效恢复自噬溶酶体降解活性，从而解决mn
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暴露引起的tau、aβ斑块、α-synuclein等特征性蛋白的沉积问题，进而对ndds起到有效的治疗。
附图说明
12.图1为mn
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暴露激活cgas-sting通路的相关分析图。其中，a表示用100μm的mncl2对bv2细胞预处理6h，然后用转录组学(rna-seq)分析筛选后得到的差异基因图，从图中可以
看到干扰素基因、干扰素刺激基因大量表达；b表示通路分析图，显示差异基因与i型干扰素有关。c-f为分别用rt-qpcr和elisa检测apol9a、apol9b和cmpk2及ifnβ表达图，对rna-seq结果的准确性进行验证。g-i为cgas、sting在mn
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暴露后大量表达情况图。
13.图2为mn
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通过激活cgas-sting通路进而诱导tau蛋白病变分析图以及统计学分析图。其中，a-b为用100μm的mncl2对bv2细胞预处理6h，然后用western blot分析tau蛋白表达的表达分析情况图。c-f为在饮水中添加200mg/l的mn
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，连续暴露5周，实验结束后western blot分析mn暴露小鼠大脑中cgas、sting和tau的表达情况图以及统计学分析图。g为免疫荧光法检测mn暴露小鼠脑内p-tau的表达情况图。
14.图3为mn
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暴露导致自噬溶酶体功能障碍分析图。其中，a为用100μm的mncl2对bv2细胞预处理6h，采用rna-seq分析差异基因显示的自噬相关基因在mn
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刺激的bv2细胞中高表达分析图，b-g为用100μm的mncl2对bv2细胞预处理6小时，western blot分析wipi2、p62、atg5、beclin-1和lc3ii的蛋白水平情况图以及统计学分析图。
15.图4为抑制cgas-sting通路可能通过恢复自噬溶酶体降解活性减少mn
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诱导的tau病变分析图。其中，a为成功构建cgas敲除的bv2细胞(bv2
cgas-/-)并进行琼脂糖凝胶电泳验证图。b为成功构建sting敲除的bv2细胞(bv2
sting-/-)并进行琼脂糖凝胶电泳验证图。c为mn
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刺激bv2
cgas-/-和bv2
sting-/-后，rna-seq分析显示干扰素基因和干扰素刺激基因表达图。d为用mncl2(100μm)预处理bv2
cgas-/-、bv2
sting-/-和野生型(wt)bv2细胞6h，elisa检测bv2细胞培养上清中ifn-β的变化情况图。e-f为通路分析由rna-seq筛选的降低的差异基因与i型干扰素的相关情况分析图。g-o为用mncl2(100μm)处理bv2
cgas-/-、bv2
sting-/-和bv2细胞6h后，western blot检测cgas、sting、irf3、p62、wipi2、atg5、lc3b和tau的蛋白水平情况图以及统计学分析图。
16.图5为体内实验进一步验证敲除cgas和sting基因通过改善自噬-溶酶体降解功能显著减弱mn
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暴露引起的tau病变情况分析图。其中，a-f为在wt小鼠、cgas-/-和sting-/-小鼠饮水中添加200mg/l mn
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连续暴露5周，western blot检测大脑中cgas、sting、lc3b、p62和tau的蛋白水平情况图以及统计学分析图。
17.图6为自噬抑制剂3-ma通过抑制cgas-sting通路，改善mn
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暴露引起的tau病变情况分析图。其中，a为构建自噬抑制剂3-ma孵育bv2小胶质细胞阻断自噬模式图。b-d为10μm/l 3-ma作用于bv2细胞12h，成功阻断自噬电泳图以及统计学分析图。e-j为10μm/l3-ma预处理bv2小胶质细胞12h，然后用mncl2(100μm)作用6h，western blot检测cgas、sting、p62、lc3b、tau的蛋白水平情况图以及统计学分析图。
具体实施方式
18.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图以及各实施例和验证例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例和验证例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，即所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
19.在这里专用的词“实施例”，作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。本法实施例中性能指标测试，除非特别说明，采用本领域常规试验方法。本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明公开的内容。
20.除非另有说明，否则本文使用的技术和科学术语具有本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义；作为本发明中的其它未特别注明的原材料、试剂、试验方法和技术手段均指本领域内普通技术人员通常使用的原材料和试剂，以及通常采用的实验方法和技术手段。
21.本发明使用的部分材料和方法如下所述：
22.抗体和试剂
23.蛋白酶抑制剂(ar1178，boster，武汉，中国)，磷酸酶抑制剂(k1015，apexbio，美国)，ripa缓冲液(ar0102，boster，武汉，中国)。0.45μm pvdf膜(millipore，美国)，5％牛血清白蛋白(a8020，索莱宝，北京，中国)，抗lc3b(ab51520，abcam，美国)，抗beclin-1(cqa1851，cohesion biosciences，上海，中国)，抗p62/sqstm1(ab155686，abcam，美国)，抗cgas(d3o8o，cell signaling technology，美国)，抗atg5(ab108327，abcam，美国)，抗tau(ab32057，abcam，美国)，抗sting(d2p2f，cell signaling technology，美国)，抗β-actin(13e5，cell signaling technology，美国)，抗irf3(ab68481，abcam，美国)，抗wipi2(bs-8767r，博奥森，北京，中国)，抗p-tau(ab92676，abcam，美国)，抗gapdh(52902，signalway antibody，美国)，hrp标记二抗(48139，cell signaling technology，美国)。
24.细胞
25.bv2小胶质细胞购自cyagen bioscience公司(中国广州)。细胞在rpmi 1640(vivacell，上海，中国)中，在37℃和5％ co2的条件下培养，添加10％胎牛血清(biological industries，以色列)和1％青霉素-链霉素溶液(biological industries，以色列)。利用crispr/cas9技术构建cgas(mb21d1)和sting(tmem173)基因敲除细胞模型。分离并富集单克隆进行筛选。通过pcr和测序对菌落进行基因分型，以获得和验证bv2
cgas-/-和bv2
sting-/-细胞系。bv2、bv2
cgas-/-和bv2
sting-/-细胞系在无血清培养基中暴露于不同浓度的mn(50-200μm/l)6h、12h和24h，并采用cck-8法(apexbio，美国)评估mn的细胞毒性。3-ma(selleck，美国)在10μm/l浓度下作用12h，阻断bv2细胞自噬。
26.小鼠
27.c57bl/6小鼠购自中国农业科学院兰州兽医研究所。cgas-/-和sting-/-小鼠由zhengfan jiang(peking university)惠赠。所有小鼠均按照实验动物管理使用指南在spf条件下喂养于兰州大学实验动物中心。实验组采用锰含量为200mg/l的氯化锰溶液喂养小鼠5周，建立锰暴露小鼠模型。
28.转录组学(rna-seq)
29.按照trlzol试剂(life technologie，美国)说明书提取细胞的总rna。使用nanodrop2000(thermo fisher scientific，美国)测定rna的浓度和纯度。使用agilent bioanalyzer 2100系统(agilent technologies，美国)的rna nano 6000检测试剂盒评估rna的完整性。这些文库在illumina novaseq平台上进行测序，根据说明生成150bp的配对序列。采用deseq2进行差异表达分析。当deseq2筛选到的基因的p值《0.01和fold change≥2时被认定为差异表达基因。通过聚类分析对差异表达基因进行go富集分析。使用kobas数据库和聚类分析软件对差异表达基因进行kegg通路分析。
30.采用如表1所示的引物序列对rna-seq筛选到的差异表达基因进行rt-qpcr验证。
31.表1rt-qpcr引物序列
novaseq平台上进行测序。deseq2进行差异表达分析。图3清楚地看到rna-seq分析表明mn
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暴露后与自噬相关的基因大量表达；western blot检测自噬相关蛋白的表达，结果显示wipi2、p62和lc3ii在mn
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暴露后表达增加。从而证明mn
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暴露损坏了自噬溶酶体降解功能。
44.实施例3.mn
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暴露通过激活cgas-sting通路损坏了自噬溶酶体降解功能
45.本实施例探讨mn
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暴露是否激活cgas-sting通路损坏了自噬溶酶体降解功能，以下为本实施例的具体研究步骤和相关数据分析：
46.(1)利用crispr/cas9技术构建bv2
cgas-/-和bv2
sting-/-细胞模型。图4清晰显示cgas和sting蛋白在等位基因中完全消失，表明成功构建了bv2
cgas-/-和bv2
sting-/-细胞模型。
47.(2)bv2、bv2
cgas-/-和bv2
sting-/-细胞系在含有100μm/l mn
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的培养基中暴露6h，建立锰暴露细胞模型。trlzol试剂提取细胞的总rna。使用nanodrop2000测定rna的浓度和纯度。使用agilent bioanalyzer 2100系统的rna nano 6000检测试剂盒评估rna的完整性。在illumina novaseq平台上进行测序。采用deseq2进行差异表达分析。图4中清楚地显示cgas和sting敲除后，干扰素基因和干扰素刺激基因在mn
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的刺激下表达量显著下降；通路分析显示这些差异基因与i型干扰素相关；elisa检测显示β干扰素在cgas和sting敲除后表达显著降低。
48.(3)western blot检测cgas-sting通路、自噬溶酶体相关蛋白及tau的表达，图4中清楚地显示mn
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刺激bv2
cgas-/-和bv2
sting-/-细胞，wipi2、p62和lc3ii表达显著下降；tau蛋白表达亦显著降低。
49.(4)构建cgas-/-和sting-/-小鼠，采用锰含量为200mg/l的氯化锰溶液喂养小鼠5周，建立锰暴露cgas-/-和sting-/-小鼠模型。实验结束后western blot检测小鼠脑组织中cgas-sting通路、自噬溶酶体相关蛋白及tau的表达。图5中清晰显示cgas和sting完全消除，表明成功构建cgas-/-和sting-/-小鼠模型；mn
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暴露后导致脑组织中p62和lc3ii表达明显降低；tau在锰暴露小鼠脑组织中表达亦明显降低。
50.以上通过体内外实验证明mn
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暴露通过激活cgas-sting通路损坏了自噬溶酶体降解功能的神经毒性机制；抑制cgas-sting通路可以通过恢复自噬溶酶体降解功能缓解锰暴露引发的tau病。
51.实施例4.自噬抑制剂3-ma通过抑制cgas-sting通路来改善tau病
52.本实施例探讨通过使用自噬抑制剂能否起到通过恢复受损的自噬溶酶体功能改善mn
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暴露引发的tau病的作用。以下为本实施例的具体研究步骤和相关数据分析：
53.(1)3-ma在10μm/l浓度下预处理bv2细胞12h，阻断细胞自噬。然后bv2细胞在含有100μm/l mn
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的培养基中暴露6h，建立锰暴露细胞模型。图6清楚地显示lc3-ii表达降低，p62表达显著升高，表明3-ma阻断了细胞自噬。
54.(2)western blot检测上述细胞中cgas-sting通路、自噬溶酶体相关蛋白及tau的表达。图6清楚地显示3-ma处理后cgas、sting、p62、lc3-ii和tau表达在mn
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刺激下显著降低。
55.以上数据表明通过使用3-ma治疗后，mn
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暴露诱导的tau病可以被逆转。这些结果表明，自噬抑制剂(3-ma)通过抑制cgas-sting通路，恢复受损的自噬溶酶体降解功能，从而清除由于锰暴露诱导的tau的聚集。
56.以上所述实施例和验证例仅表达了本技术的具体实施方式，其描述较为具体和详
细，但并不能因此而理解为对本技术保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本技术技术方案构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本技术的保护范围。

技术特征：
1.自噬抑制剂在mn
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暴露引起的ndds的预防或治疗药物上的应用。2.自噬抑制剂3-ma在mn
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暴露引起的ndds的预防或治疗药物上的应用。3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述ndds为阿尔茨海默病。4.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述ndds为帕金森病。

技术总结
本发明公开了自噬抑制剂在Mn


技术研发人员：王慧 张鑫 刘菁菁 钟诗音 张志敏 常旭红
受保护的技术使用者：兰州大学
技术研发日：2023.07.18
技术公布日：2023/10/15