一种以腺病毒为载体的流行性腹泻病毒疫苗及其制备方法

1.本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种以腺病毒为载体的流行性腹泻病毒疫苗及其制备方法。


背景技术：

2.猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea，ped)是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,pedv)引起的传染性消化道疾病。ped对猪只危害严重，临床特征为发病猪呕吐、腹泻、脱水，对一周龄以内仔猪的危害较大，可导致100％发病率及50％～100％致死率，对世界养猪业造成了极大的损失。
3.pedv属于尼多病毒目(nidovirales)冠状病毒科(coronaviridac)冠状病毒属(coronavirus)的成员，基因组为单股正链rna。而冠状病毒又分为α冠状病毒、β冠状病毒、γ冠状病毒和δ冠状病毒，pedv属于α冠状病毒。目前，pedv流行毒株主要分为g1(经典型)和g2(变异型)2个基因型，其中g1基因型包括g1a和g1b 2个基因亚型，g2基因型包括g2a、g2b和g2c 3个基因亚型。pedv编码的s蛋白(spike protein)为病毒粒子表面的纤突糖蛋白，s蛋白能促进病毒粒子与细胞表面受体融合，帮助病毒侵入细胞，并介导感染宿主体内中和抗体的产生，在预防pedv的感染中发挥重要作用。
4.疫苗接种是预防该病的方法之一，但是由于病毒毒株变异速度快，目前研制的疫苗的预防效果并不理想。目前，猪场pedv仍然存在，其可能是目前商品化疫苗与流行毒株的抗原性不匹配。因此，筛选新型的pedv疫苗候选毒株迫在眉睫。
5.腺病毒(adenovirus，ad)常感染呼吸道，可作为载体递送基因，因此可用于基因治疗及疫苗研发。腺病毒载体是目前最常用的疫苗载体之一，复制缺陷型和复制型腺病毒均被用作潜在的疫苗载体，具有表达量高同时能诱导强烈特异性体液免疫和细胞免疫反应的特点，又具有宿主广、制备方便、安全性好、经济性强等优点。
6.若能以腺病毒为载体开发出一种有效且高效的猪流行性腹泻病毒疫苗对于猪流行性腹泻病毒的防治具有极为重要的意义。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供一种以腺病毒为载体的猪流行性腹泻病毒疫苗，可同时刺激机体产生细胞免疫和体液免疫，免疫效果好，安全性高。
8.为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
9.本发明的第一个方面，提供一种表达载体，所述表达载体含有seq id no:1所示核苷酸序列。
10.本发明通过将s蛋白基因的大部分稀有密码子更改为高使用频率密码子进行密码子优化。其次，将高频密码子和低频密码子均匀分布于s蛋白基因，适当地提高s蛋白基因的gc含量，并将g、c核苷酸在整个s基因中尽可能均衡分布。基因优化前，pedv s蛋白基因的gc含量为41.1％。基因优化后gc含量提升至52.2％，与原始s蛋白基因序列的同源性为
73.6％。调整密码子使用偏差以适应目标宿主的最高表达谱，cai(密码子适应指数)从0.67上调至0.85(0.8-1.0的cai被认为有利于高表达)。本发明通过将密码子优化后，大大提升了疫苗的免疫原性。
11.在本发明的一些实施方式中，所述核苷酸序列为经密码子优化后的序列。
12.在本发明的一些实施方式中，所述载体含有dna质粒、rna表达质粒或病毒载体。
13.在本发明的一些实施方式中，所述载体为病毒载体；优选地，所述载体为腺病毒载体。
14.在一些实例中，所述腺病毒载体为ad1载体、ad2载体、ad3载体、ad4载体、ad5载体、ad6载体、ad7载体、ad8载体、ad9载体、ad10载体、ad11载体、ad12载体、ad13载体、ad14载体、ad15载体、ad16载体、ad17载体、ad18载体、ad19载体、ad20载体、ad21载体、ad22载体、ad23载体、ad24载体、ad25载体、ad26载体、ad27载体、ad28载体、ad29载体、ad30载体、ad31载体、ad32载体、ad33载体、ad34载体、ad35载体、ad36载体、ad37载体、ad38载体、ad39载体、ad40载体、ad41载体、ad42载体、ad43载体、ad44载体、ad45载体、ad46载体、ad47载体、ad48载体、ad49载体、ad50载体、ad51载体、或ad52载体中的至少一种。
15.在本发明的一些实施方式中，所述腺病毒载体为ad5载体。
16.进一步的，所述腺病毒载体为复制缺陷型ad5载体。
17.在本发明的一些实施方式中，所述载体以调控seq id no：1所示核酸序列的表达。
18.本发明的第二个方面，提供一种用于预防和/或治疗猪流行性腹泻病的腺病毒载体疫苗，包括负载有seq id no:1所示核苷酸序列的腺病毒载体。
19.在本发明的一些实施方式中，所述腺病毒载体为ad5载体。
20.在本发明的一些实施方式中，所述药物或疫苗的剂型为注射剂、滴鼻剂或喷雾剂。在实际应用时，可以根据需要进行调整和选择，如选择单一的剂型进行免疫，或者选择多种混合剂型进行免疫。
21.在本发明的一些实施方式中，所述猪流行性腹泻病的腺病毒载体疫苗中还包括但不限于药学上可接受的佐剂、免疫调节剂、载体、稀释剂、赋形剂等。可以根据具体的需要选择适合的佐剂、免疫调节剂、载体、稀释剂或赋形剂等。
22.本发明所述腺病毒载体疫苗还可以和其他药物联用。
23.本发明的第三个方面，提供一种前述腺病毒载体疫苗的制备方法，包括如下步骤：
24.(1)合成含有seq id no:1所示核苷酸序列的目的基因；
25.(2)将目的基因连接至admax腺病毒系统的穿梭质粒载体上，得到腺病毒穿梭质粒；
26.(3)将腺病毒穿梭质粒、admax腺病毒系统的骨架质粒共转染至细胞进行重组腺病毒的包装。
27.在本发明的一些实施方式中，步骤(2)所述穿梭质粒载体为pdc316。
28.本发明的有益效果是：
29.(1)本发明以人5型腺病毒为载体，构建了表达pedv g2b型s蛋白全长重组腺病毒载体疫苗，利用小鼠和猪进行疫苗的免疫原性评价，结果表明其可以可同时刺激机体产生细胞免疫和体液免疫，elisa抗体水平检测结果显示肌肉注射ad5-pedv_s第14天即可产生较高的血清igg抗体，其中滴鼻免疫组抗体水平差于肌肉注射组，而好于商业弱毒苗组；中
和抗体水平检测结果显示无论是肌肉注射还是滴鼻免疫组均能产生较高的中和抗体。滴鼻免疫相对于肌肉注射免疫能够减少猪只的应激反应，并且其操作简便。在目前猪场非洲猪瘟疫情防控压力下，滴鼻免疫更适合在规模化猪场进行免疫。
30.(2)本发明构建的腺病毒载体疫苗利用母猪免疫接种实验验证了其可以显著增强pedv的肌注及滴鼻免疫效力，可同时刺激机体产生细胞免疫和体液免疫，并且该疫苗只需要通过肌肉接种一针即可产生较好的免疫效力，保护性好，安全性高。
31.(3)本发明疫苗制备方法快速简便，安全高效，可在短期内实现大规模生产，适用于猪流行性腹泻病毒的预防，具有良好的免疫原性，在相同剂量下能够诱导更高水平的抗体表达。
附图说明
32.图1为pdc316-pedv s双酶切鉴定图；
33.图2为s蛋白的表达结果，1：预染marker；2：转染pdc316-pedv s细胞；3：转染pdc316空载体细胞；4：空白hek293细胞；
34.图3为重组腺病毒包装(200μm)；
35.图4为ad5-pedv_s凝胶电泳图，1为ad5-pedv_s，2为阴性对照；
36.图5为ad5-pedv_swestern blotting检测，m：预染marker；1：ad5-pedv_s感染细胞，2：pdc316空载体感染细胞，3：空白细胞；
37.图6为elisa抗体水平检测结果；
38.图7为中和抗体水平检测结果；
39.图8为重组腺病毒ad5-pedv s免疫小鼠诱导产生的脾细胞il-2、ifn-γ表达水平(p＝0.0005)；
40.图9为elisa法检测血清和乳汁中pedv s蛋白的igg及iga抗体滴度结果；
41.图10为利用cv777(g1b型)和kb4(g2a型)两株pedv毒株对免疫母猪血清及初乳进行中和抗体水平检测结果；
42.图11为ad5-pedv s疫苗免疫猪后的保护反应情况；
43.图12为不同免疫处理组的病理图；
44.图13为不同免疫处理组的粪便中的病毒拷贝数情况。
具体实施方式
45.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
46.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
47.应当明确的是，下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
48.本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖
非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法或制品不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法或制品所固有的要素。
49.实施例1
50.1.s蛋白基因优化及合成
51.重组pedv疫苗的目标抗原为pedv毒株ch/tp-4-4/2018(genbank号：mk140814.1)的s蛋白。通过对s蛋白基因进行优化，提高s蛋白的表达水平，从而提高了疫苗的免疫原性。
52.首先，通过将s蛋白基因的大部分稀有密码子更改为高使用频率密码子进行密码子优化。其次，将高频密码子和低频密码子均匀分布于s蛋白基因，适当地提高s蛋白基因的gc含量，并将g、c核苷酸在整个s基因中尽可能均衡分布。
53.基因优化前，pedv s蛋白基因的gc含量为41.1％。基因优化后gc含量提升至52.2％，与原始s蛋白基因序列的同源性为73.6％。调整密码子使用偏差以适应目标宿主的最高表达谱，cai(密码子适应指数)从0.67上调至0.85。(0.8-1.0的cai被认为有利于高表达。)
54.s蛋白基因优化之后，在翻译起始密码子前面加入kozak序列，并在整个序列上游插入酶切位点ecori，下游插入酶切位点hindiii，对基因序列进行合成。s蛋白基因优化序列(酶切位点为ecori和hindiii)见seq id no:1。
55.2.载体构建和s蛋白体外表达鉴定
56.2.1载体构建
57.以上合成的基因序列，分别用ecori和hindiii酶切，回收目的基因片段，将其连接至admax腺病毒系统(加拿大microbix biosystems inc.)的穿梭质粒pdc316上，转化dh5-α感受态，涂布amp
r lb平板，挑单克隆进行菌落pcr鉴定，并对pcr鉴定为阳性的克隆进行测序验证。s蛋白基因优化后的质粒记为pdc316-pedv s。pdc316-pedv s双酶切鉴定如图1所示。
58.2.2s蛋白的体外表达鉴定
59.将以上构建的穿梭质粒和pdc316载体，使用转染试剂jetprime(polyplus，ref，114-15)转染至hek293细胞，48小时后收细胞进行wb检测。实验方法如下：
60.转染：实验前一天，hek293细胞以8
×
105细胞/孔接种6孔板，于37℃、5％co2细胞培养箱中培养过夜。转染时，每个转染孔取对应质粒2μg，加入到200μl转染buffer中，混匀，加入转染试剂2μl，轻轻混匀，室温放置10分钟。将质粒和转染试剂混合液轻轻滴加到6孔板中，轻摇混匀。细胞于37℃、5％co2细胞培养箱中培养，4小时后将培养基换成新鲜的含5％fbs的dmem培养基，48小时后收集细胞，制备样品，进行wb检测。
61.样品制备：转染48小时后，小心地吸弃培养基，用pbs重悬细胞，500g离心5分钟，弃上清。细胞用200μlripa缓冲液(thermo scientific,prod#89900)，另外添加适量蛋白酶抑制剂和核酸酶重悬，冰浴15分钟，4℃12000rpm离心5分钟，取上清，加入1/4体积含有200mmol/l dtt的5
×
sds-page上样缓冲液，95℃加热5分钟，冻存，用于wb检测。
62.western blot检测：使用10孔的4-20％sds-page梯度胶进行sds-page，上样量每孔30μl。电泳条件：80v，15min；120v，直到溴酚蓝刚好从凝胶中出来为此。将sds-page胶上的蛋白质通过电转仪转移到聚偏二氟乙烯膜(pvdf膜)上，电转条件为200ma，1小时。电转完成后，将pvdf膜用5％脱脂奶粉封闭1小时，然后以1:2000的稀释度加入抗pedv s蛋白鼠多
克隆抗体，4℃放置过夜。将膜用wb洗涤液洗涤4次，每次于摇床上摇动10分钟。然后加入以1:5000稀释于5％脱脂奶粉的hrp标记的羊抗鼠igg抗体(bioss,bs-0296g-hrp)，室温孵育2小时。用wb洗涤液将膜洗涤4次，使用beyoecl star(beyotime，cat.no.p0018aft)进行化学发光反应，使用化学发光成像仪采集不同曝光时间的图像。结果如图2所示。
63.3.重组腺病毒包装、制备和鉴定
64.3.1重组腺病毒包装
65.将以上构建好的载体pdc316-pedv s与admax腺病毒系统的骨架质粒pbhglox_e1,3cre共转染hek293细胞进行重组腺病毒的包装。过程如下：
66.a)转染前一天，将hek293细胞接种于六孔板中，每孔8
×
105个细胞,培养基为dmem+10％fbs+1％双抗，置37℃含5％co2细胞培养箱中培养过夜。
67.b)待细胞生长至底面积的80-90％时，取骨架质粒(pbhglox_e1,3cre)和穿梭质粒，用jetprime转染试剂按其所附说明书进行转染。具体步骤为：
68.(1)每个转染孔取骨架质粒1.6μg，穿梭质粒0.4μg，混和均匀；质粒用200μlbuffer培养基进行稀释。
69.(2)取2μl jetprime转染试剂加入到稀释于buffer中混匀。
70.(3)将转染试剂和质粒混合物室温放置10min，然后加入到细胞中。
71.c)转染后第二天，将长满的细胞传代于25cm2细胞培养瓶中，用含5％fbs的dmem培养基继续培养，每天观察，待细胞长满瓶底时，再传入75cm2细胞培养瓶中，每天观察细胞出毒迹象。出毒现象为细胞变大变圆，呈葡萄状，并开始出现明显噬斑，如图3。待细胞大部分病变并从底部脱落时进行收毒。
72.d)将出毒的细胞反复冻融三次。12000g离心10分钟，收集含病毒的上清液，弃沉淀。将表达s全长蛋白基因优化序列的毒种标记为ad5-pedv_s。
73.3.2重组腺病毒鉴定
74.3.2.1pcr扩增s基因全序列及测序鉴定
75.使用pdc316载体的通用引物，扩增s蛋白的全序列，引物序列如下：
76.pdc316-f:acgtgggtataagaggcg
77.pdc316-r:cgatgctagacgatccag
78.取20μl疫苗候选株毒种液，加入10μl蛋白酶k，58℃消化30min释放病毒基因组，再100℃5min，以此为模版扩增s蛋白基因序列。
79.琼脂糖凝胶电泳结果显示能扩增到单一目的条带，片段大小正确(图4)。将目的条带进行胶回收并测序，比对结果表明，测序结果序列完全正确。
80.3.2.2目标抗原表达鉴定
81.将不同构建重组腺病毒感染hek293细胞，48小时后收集细胞进行目标抗原的western blot检测，ad5-pedv_s可检测到目标蛋白的明显表达。结果如图5所示。
82.3.2.3重组腺病毒培养
83.hek293细胞在37℃、5％co2条件下贴壁培养。毒种接种48小时后，当细胞活度下降到40％以下时，将细胞瓶反复冻融三次。12000g离心10分钟，收集含病毒的上清液，弃沉淀。
84.3.2.4重组腺病毒纯化
85.采用diamond layer 700ba(博格隆)分离纯化腺病毒颗粒。层析柱用a液(pbs，
ph7.4)平衡；缓慢的将样品推入loop管中；上样结束，0.6ml/min，分管收集洗脱峰，平衡至uv基线；100％b洗杂，b液为1m naoh+1m nacl ph7.5。
86.3.3ad5-pedv s的鉴定和滴度测定
87.3.3.1pcr扩增目标蛋白基因全序列和测序鉴定
88.实验方法和过程同3.2.1。琼脂糖凝胶电泳结果显示能扩增到单一目的条带，片段大小正确。将目的条带进行胶回收并测序，比对结果表明，测序结果序列完全正确。
89.3.3.2感染滴度测定
90.待hek293细胞生长密度约为80-90％时，消化细胞并计数细胞量；用含有5％fbs的dmem培养液制备细胞悬液，每板需要11ml浓度为1
×
105/ml的细胞悬液；按每孔100μl(即1
×
104个细胞)加入2个96孔板；制备感染样品。
91.接种样品：将96孔板中的11、12两列各加入100μl 5％ fbs的dmem，做阴性对照；依次加入96孔板中的a-h排，各加100μl标记为8个连续梯度稀释的样品溶液；盖上第一个板并在37℃ co2培养箱中培养；同样步骤操作第二块板；盖上第二个板并在37℃ co2培养箱中培养。
92.通过计算可得ad5-pedv_s的tcid
50
为1
×
10
8.24
/ml。
93.3.3.3病毒颗粒数测定
94.病毒样品经sds处理后测定a260nm值(uvsds法)测定病毒颗粒数：取ad5-pedv_s注射液200μl加等体积0
·
2％sds溶液裂解，振荡混匀。56℃水浴中放置10min。等温度降至室温时瞬时离心，12000rpm离心5分钟，取上清。以病毒稳定液与0
·
2％sds溶液等体积混匀后的溶液作空白对照，测定波长260nm与280nm处的吸光值。平行实验2次。计算公式：病毒颗粒数＝a260nm
×
稀释倍数
×1·1×
10
12
。经纯化后的ad5-pedv_s的病毒颗粒数为到2.0
×
10
11
vp/ml。
95.4.pedv g2b型s蛋白重组腺病毒小鼠免疫特性的研究
96.4.1疫苗体液免疫反应检测
97.60只spf级雌性balb/c小鼠(6-8周龄)，随机分成6组，每组10只。根据表1所示分组情况对小鼠进行ad5-pedv_s免疫。肌肉注射方式为后大腿内侧注射200μl，滴鼻免疫方式为将小鼠用异氟烷麻醉，经鼻腔滴入200μl。并分别于一免14天后按照同样剂量进行二免。分组情况如表1所示。
98.表1小鼠免疫分组情况表
[0099][0100]
小鼠于免疫后特定时间点采血，分离血清，使用elisa法检测血清中pedv s蛋白的igg抗体滴度。elisa抗体水平检测结果显示小鼠肌肉注射ad5-pedv_s第14天即可产生较高的血清igg抗体，其中滴鼻免疫组抗体水平差于肌肉注射组，而好于商业弱毒苗组(图6)。
[0101]
中和抗体水平检测结果显示无论是肌肉注射还是滴鼻免疫组均能产生较高的中和抗体，ad5-pedv-s肌注组平均中和抗体滴度为1：267，滴鼻组为1：118，商业灭活苗和弱毒苗为1：14，空载体组和pbs组为0(如图7)。
[0102]
4.2细胞免疫反应检测
[0103]
按4.1免疫方式进行免疫，于一免后14天处死小鼠，分离脾淋巴细胞。机械法处理脾脏组织呈单细胞悬液，用pbs调节细胞浓度为106个/ml。使用pedv病毒液刺激培养6小时，同时加入蛋白分泌阻断剂阻断细胞因子分泌。固定破膜后，加il-2和ifn-γ抗体各1μg，混匀后4℃避光染色30min。加400μl pbs，重悬细胞，立即上机检测。用ze5流式细胞仪检测，采用everest软件对数据进行分析。结果如图8所示，ad5-pedv s肌注或滴鼻免疫组均能产生较高的ifn-γ表达，ad5-pedv s肌注组与对照组具有显著差异(p＝0.0005)，ad5-pedv s滴鼻组与对照组具有显著差异(p＝0.0127)。il-2也有升高，但是差异不显著。
[0104]
5.pedv g2b型s蛋白重组腺病毒猪免疫原性的评价
[0105]
5.1疫苗在母猪上的免疫反应检测
[0106]
40只商品母猪，随机分成8组，每组5只。根据表2所示分组情况对母猪进行免疫。肌肉注射方式为耳后颈部肌肉注射2ml，滴鼻免疫方式为经鼻腔滴入2ml。a，b，c及d组于产前5周对妊娠母猪进行一免，并分别于产前2周照同样剂量进行二免；e组及f组仅于产前5周对妊娠母猪进行免疫接种；g组及h组仅于产前2周对妊娠母猪进行免疫接种。每日观察母猪精神状况，食欲，体温等，分组情况如表2所示。
[0107]
表2母猪免疫分组情况表
[0108][0109]
注：表2中使用的ad5-pedv s滴度为2
×
109tcid
50
。
[0110]
于母猪产仔后3日采集乳汁、血清，分离血清，使用elisa法检测血清和乳汁中pedv s蛋白的igg及iga抗体滴度。检测结果如图9所示。
[0111]
图9a为免疫母猪乳汁中的pedv iga抗体水平，结果显示a组(ad5-pedv s肌注免疫两针组)抗体滴度显著高于b组(ad5-pedv s滴鼻免疫两针组)(p＝0.0122)和c组(商业灭活苗组)(p＝0.0122)。
[0112]
图9b为免疫母猪乳汁中的pedv igg抗体水平，结果显示a组(ad5-pedv s肌注免疫两针组)抗体滴度显著高于h组(ad5-pedv s产前2周滴鼻免疫一针组)(p＝0.0241)。
[0113]
图9c为免疫母猪血清中的pedv iga抗体水平，结果显示a组(ad5-pedv s肌注免疫两针组)抗体滴度显著高于c组(商业灭活苗组)(p＝0.0278)；e组(ad5-pedv s产前5周肌注免疫一针组)抗体滴度显著高于f组(ad5-pedv s产前5周滴鼻免疫一针组)(p＝0.0051)和h组(ad5-pedv s产前2周滴鼻免疫一针组)(p＝0.0010)。
[0114]
图9d为免疫母猪血清中的pedv igg抗体水平，结果显示a组(ad5-pedv s滴鼻免疫两针组)显著高于f组(ad5-pedv s产前2周滴鼻免疫一针组)(p＝0.0060)，e组(ad5-pedv s产前5周肌注免疫一针组)显著高于f组(ad5-pedv s产前2周滴鼻免疫一针组)(p＝0.0314)。
[0115]
elisa抗体水平检测结果显示各组母猪免疫后均能产生较高的血清、乳汁igg及iga抗体，ad5-pedv s肌肉注射组抗体滴度显著高于滴鼻免疫组和商业灭活苗组，且ad5-pedv s两针肌注组与产前5周一针肌注组无显著差异。
[0116]
利用cv777(g1b型)和kb4(g2a型)两株pedv毒株对免疫母猪血清及初乳进行中和抗体水平检测，结果如图10所示。
[0117]
图10a为免疫母猪血清中的中和效价检测结果，血清对kb4/2a株的中和活性检测结果显示a组(ad5-pedv s肌注免疫两针组)与b(ad5-pedv s滴鼻免疫两针组)，c(商业灭活苗组)和d组(pbs对照组)均具有显著差异(p《0.0001)；e组(ad5-pedv s产前5周肌注免疫一针组)与f组(ad5-pedv s产前2周滴鼻免疫一针组)(p《0.0001)，g组(ad5-pedv s产前2周肌注免疫一针组)(p＝0.0003)和h组(ad5-pedv s产前2周滴鼻免疫一针组)(p《0.0001)均具有显著差异。血清对cv777株的中和活性结果显示a组(ad5-pedv s肌注免疫两针组)与b(ad5-pedv s滴鼻免疫两针组)(p＝0.0032)，c(商业灭活苗组)(p＝0.0026)和d组(pbs对照组)(p＝0.0004)具有显著差异。
[0118]
图10b为免疫母猪乳汁中的中和效价检测结果，乳汁对kb4/2a株的中和活性检测
结果显示a组(ad5-pedv s肌注免疫两针组)与b(ad5-pedv s滴鼻免疫两针组)(p＝0.0396)，c组(商业灭活苗组)(p＝0.0019)和d组(pbs对照组)(p＝0.0002)均有显著差异；e组与d组(pbs对照组)(p＝0.0126)和h组(ad5-pedv s产前2周滴鼻免疫一针组)(p＝0.0302)存在显著差异。乳汁对cv777株的中和活性结果显示a组(ad5-pedv s肌注免疫两针组)与b组(ad5-pedv s滴鼻免疫两针组)(p＝0.0014)，c组(商业灭活苗组)(p＝0.0260)和d组(pbs对照组)(p＝0.0006)具有显著差异。
[0119]
由以上结果可知，无论是肌肉注射还是滴鼻免疫组均能产生较高的中和抗体，肌注免疫组中和抗体滴度显著高于滴鼻组和商业灭活苗，且ad5-pedv s两针肌注组与产前5周一针肌注组无显著差异。
[0120]
5.2疫苗在仔猪上的保护反应检测
[0121]
随机挑选5.1中免疫母猪所产3日龄仔猪，具体分组如表3所示。a，b，c和d四组每头仔猪通过口服的方式摄入2ml浓度为1
×
106tcid
50
的pedv病毒液。e组不做操作。
[0122]
表3乳猪攻毒保护分组情况表
[0123][0124]
注：“2次”是指分别在产前5周、产前2周免疫一次。
[0125]
攻毒后每日观察并记录仔猪的精神状态、采食量、排便情况、体重及体温的测定以及粪便血清采集。
[0126]
根据粪便进行临床症状评估见表4及图11a，结果表明ad5-pedv s肌注免疫组腹泻症状较轻且到攻毒第5、6日趋于好转；滴鼻组腹泻症状评分处于上升趋势，但好于pbs对照组。由图11b为攻毒仔猪日增重曲线图，ad5-pedv s肌注免疫组仔猪日增重比较稳定；滴鼻组的日增重变化较大；商业灭活苗组的仔猪日增重处于下降的趋势；而pbs对照组的仔猪日增重处于下降的趋势且下降幅度大于其它组。生存曲线结果表明ad5-pedv s肌注免疫组和商业灭活苗组仔猪攻毒后一直存活；滴鼻组在攻毒第七天有1头仔猪死亡；pbs对照组在第三天有2头仔猪死亡，第六天5头仔猪全部死亡(图11c)。
[0127]
表4临床症状评分表
[0128]
[0129][0130]
攻毒后第7天处死仔猪，采空肠组织，进行多聚甲醛固定，通过he染色检测小肠组织的病理变化，在光镜下观察到本试验动物部分小肠组织黏膜上皮细胞脱落和炎性细胞浸润，d组(pbs对照组-攻毒)(图12d)可见且相对明显(黏膜层见大量黏膜上皮细胞脱落)，a组(ad5-pedv s肌注免疫组)(图12a)，b组(ad5-pedv s滴鼻免疫组)(图12b)，c组(商业灭活苗组)(图12c)和e(空白对照-未攻毒)(图12e)组未见明显病理改变。如图12所示。
[0131]
每日采集攻毒小猪粪便，提取核酸，利用pedv荧光定量方法对粪便中的病毒含量进行定量。结果显示，pbs对照组仔猪粪便中病毒拷贝数显著高于其它组；而ad5-pedv s肌注组、滴鼻组和商业灭活苗组相比于pedv对照组，病毒拷贝数显著降低，结果见图13。
[0132]
综上所述，结合攻毒小猪临床表征、小肠病理切片和粪便中pedv定量检测分析，表明ad5-pedv s肌注及滴鼻免疫均能对pedv感染仔猪具有一定地保护作用，并且肌注接种免疫组保护率好于滴鼻组。
[0133]
前述的实例仅是说明性的，用于解释本发明所述方法的一些特征。所附的权利要求旨在要求可以设想的尽可能广的范围，且本文所呈现的实施例仅是根据所有可能的实施例的组合的选择的实施方式的说明。因此，申请人的用意是所附的权利要求不被说明本发明的特征的示例的选择限制。在权利要求中所用的一些数值范围也包括了在其之内的子范围，这些范围中的变化也应在可能的情况下解释为被所附的权利要求覆盖。

技术特征：
1.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有seq id no:1所示核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述核苷酸序列为经密码子优化后的序列。3.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述载体含有dna质粒、rna表达质粒或病毒载体。4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述载体为病毒载体；优选地，所述载体为腺病毒载体。5.根据权利要求3或4所述的表达载体，其特征在于，所述载体以调控seq id no：1所示核酸序列的表达。6.用于预防和/或治疗猪流行性腹泻病的腺病毒载体疫苗，包括负载有seq id no:1所示核苷酸序列的腺病毒载体。7.根据权利要求6所述的腺病毒载体疫苗，其特征在于，所述腺病毒载体为ad5载体。8.根据权利要求6所述的腺病毒载体疫苗，其特征在于，所述药物或疫苗的剂型为注射剂、滴鼻剂或喷雾剂。9.权利要求6～8任一项所述腺病毒载体疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)合成含有seq id no:1所示核苷酸序列的目的基因；(2)将目的基因连接至admax腺病毒系统的穿梭质粒载体上，得到腺病毒穿梭质粒；(3)将腺病毒穿梭质粒、admax腺病毒系统的骨架质粒共转染至细胞进行重组腺病毒的包装。10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述穿梭质粒载体为pdc316。

技术总结
本发明涉及一种以腺病毒为载体的流行性腹泻病毒疫苗及其制备方法。本发明对S基因序列进行密码子优化得到新的S基因序列，使用腺病毒为载体，构建了表达PEDV G2b型S蛋白全长重组腺病毒载体疫苗，利用小鼠和猪进行疫苗的免疫原性评价，结果表明其可同时刺激机体产生细胞免疫和体液免疫，免疫效果好，安全性高，适用于猪流行性腹泻病的防治。用于猪流行性腹泻病的防治。用于猪流行性腹泻病的防治。


技术研发人员：张斌 宋鑫 岳华 汤承 任玉鹏 陈曦
受保护的技术使用者：西南民族大学
技术研发日：2023.02.14
技术公布日：2023/7/11