可视化检测嗜麦芽窄食单胞菌的RPA-LFS引物探针组合及其应用的制作方法

可视化检测嗜麦芽窄食单胞菌的rpa-lfs引物探针组合及其应用
技术领域
1.本发明涉及嗜麦芽窄食单胞菌检测领域，具体为可视化检测嗜麦芽窄食单胞菌的rpa-lfs引物探针组合及其应用。


背景技术：

2.嗜麦芽窄食单胞菌(stenotrophomonas maltophilia，s.maltophilia，sma)是一种革兰阴性菌，广泛存在于自然环境中。随着广谱抗菌药物的广泛使用以及创伤性操作的增多，sma的分离率逐年上升，已成为医院获得性感染的重要病原菌之一，位于临床分离的非发酵菌第3位。sma是虚弱宿主体内的一种重要的机会性病原体，能够危及免疫功能低下人群的生命安全。患有脑膜炎、癌症、慢性阻塞性肺病或囊性纤维化患者易感嗜麦芽窄食单胞菌，最常见的临床表现是肺炎、菌血症、伤口感染和尿路感染。在慢性感染中，嗜麦芽窄食单胞菌可以形成小群变异体，在临床标本中很难检测到。常规的检测方法为生化-培养法，但这种方法耗时较久，易耽误治疗。聚合酶链式反应技术(polymerase chain reaction，pcr)等分子生物学方法虽然检测时间短、精度高，但局限于精密的仪器和专业的技术人员，难以打破实验室的壁垒，无法实现现场即时检测(point ofcare testing，poct)。因此，建立一种方便、快捷、灵敏的检测方法，对于快速诊断嗜麦芽窄食单胞菌至关重要。
3.重组酶聚合酶扩增技术(recombinantpolymerase amplification，rpa)是由piepengurg等研究者于2006年研发的一种不依赖于精密仪器、可在37-42℃恒温环境、较短时间内扩增目的基因的分子技术。相较于其他等温扩增技术，rpa扩增技术操作更方便，反应体系更简单。rpa反应体系主要包括关键酶、能量供应体系(三磷酸腺苷)、稳定反应体系(tris、醋酸钾、醋酸镁)组成。rpa反应的关键酶主要包括三种：dna聚合酶、t4噬菌体uvsx重组酶和辅助因子uvsy、单链结合蛋白。重组蛋白酶t4 uvsx在辅助因子uvsy的帮助下，与引物结合，形成dna核蛋白微丝复合物。核蛋白微丝能迅速找到目的基因片段，引物与其同源序列紧密结合，uvsx脱落，随后在dnapol作用下对目的基因片段进行扩增反应。在此过程中，单链结合蛋白与被置换的dna单链结合，防止单链恢复成双链。该过程不断循环可指数型扩增目的基因，直至反应体系中能量耗尽。rpa反应需要两条引物，其引物比典型的pcr引物更长，通常为30～35bp。通过primer primer、primerrpa等工具设计候选上下游引物，再根据灵敏度、产物产量、产物/噪音比和扩增时间对引物对进行筛选，以获得最佳引物对。为了进行快速rpa分析，rpa扩增子长度通常不超过500bp，理想长度为100～200bp。与传统pcr技术相比，rpa技术不需要精密的仪器和专业的技术人员，甚至可以在室外环境、室温条件完成扩增反应。
4.侧流层析试纸条技术(lateral flow strips，lfs)是以纳米胶体金颗粒(aunps)作为信号标签的纸基即时检测装置。lfs与rpa联合使用，数分钟内通过目测即可观察检测结果。rpa-lfs反应需要特异的探针和下游引物。探针中部插入四氢呋喃(thf)位点，3’端连接阻断基团，5’端标记荧光基团。下游引物5’端标记生物素。rpa-lfs反应可形成5’端带有
荧光标记且3’端带有生物素标记的二元复合产物。将产物滴加于核酸试纸条上，扩增产物会与金标抗荧光基团抗体结合，形成三元复合物。当三元复合物扩散到检测线时，该复合物会被抗生物素抗体捕获，检测线显色。扩增产物继续流动到质控线时，金标抗体与质控线上的二抗结合，质控线显色。当检测线和质控线均显色时，检测结果为阳性；当检测线不显色而质控线显色时，检测结果为阴性。如果试纸条出现以下两种情况，则数据不可用：1、质控线和检测线均不显色；2、检测线显色而质控线不显色。
5.目前，rpa-lfs已经被成功的用于多种病原菌的分子诊断。而对于嗜麦芽窄食单胞菌，rpa-lfs的检测方法还没有建立。本发明旨在建立一种改良的rpa-lfs技术，实现对嗜麦芽窄食单胞菌的快速检测。


技术实现要素：

6.本发明的目的是针对现有技术的缺陷，提供可视化检测嗜麦芽窄食单胞菌的rpa-lfs引物探针组合及其应用，以解决上述背景技术提出的问题。
7.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：本发明提供可视化检测嗜麦芽窄食单胞菌的rpa-lfs引物探针组合，包括f/r/p引物探针组合；
8.所述f/r/p引物探针组合中；
9.f的序列(5
’‑3’
)为：tgagcggaggcaggatccacggctacatctg；
10.r的序列(5
’‑3’
)为：biotin-ctggccattctattccatcgccagttct tc；
11.p的序列(5
’‑3’
)为：fitc-tgagcggaggcaggatccacggctacat ctg[thf]cagggcttcaatccgc-/c3-spacer/。
[0012]
嗜麦芽窄食单胞菌rpa-lfs检测引物探针组合的应用，所述f/r/p引物探针组合可用于嗜麦芽窄食单胞菌的rpa-lfs的检测，为最佳的引物探针组合。
[0013]
本发明利用rpa-lfs技术开发了建立了一种结合rpa和lfs技术的嗜麦芽窄食单胞菌快速可视化检测方法，该方法在37℃，反应8min可以完成嗜麦芽窄食单胞菌的鉴定，并且具有良好的种间特异性和灵敏度；使用rpa-lfs、pcr和细菌培养法对临床样本进行一致性检验。结果显示，rpa-lfs与pcr法的检测结果相同，与培养法的检测一致性为99.07％。rpa-lfs检测技术可实现快速、便携地检测未知菌种，特异性强，灵敏度高，在poct的应用中具有良好的发展前景，对嗜麦芽窄食单胞菌的鉴定具有重要的意义。
[0014]
本发明的有益效果是：本发明首先以嗜麦芽窄食单胞菌特异性序列(nc_010943.1)为模板设计了4组候选引物对，通过琼脂糖凝胶电泳检测其扩增性能及引物二聚体的形成情况，筛选出最佳引物对。根据最佳引物对设计特异性的探针，当使用lfs检测时受到引物二聚体的影响，产生了假阳性信号；通过对引物和探针的碱基错配消除了引物二聚体，lfs无假阳性信号产生。对该检测体系进行了严格的功效测试，从而建立了一种改进的rpa-lfs系统用于检测嗜麦芽窄食单胞菌。该方法与pcr相比，检测结果准确一致，与培养-生化方法的重合率为99.07％，kappa指数值为0.9718。本方法摆脱了仪器和专业技术的桎梏，具有较高的灵敏度和特异性，可实现嗜麦芽窄食单胞菌的现场即时检测。
附图说明
[0015]
图1为本发明rpa-lfd方法的原理示意图；
[0016]
图2为本发明最佳引物探针组合的设计；
[0017]
(a)通过rpa扩增性能筛选引物，琼脂糖凝胶图像显示了针对nc_010943.1基因序列的4对引物的扩增结果，引物组合名称标注于泳道的上方；(b)碱基错配示意图，左边为错配前的引物二聚体，右边为错配后的引物二聚体；(c)错配前后rpa-lfs检测结果，引物-探针组合标记于lfs上方；
[0018]
图3为本发明rpa-lfs反应条件的优化；
[0019]
(a)rpa-lfs反应最佳反应时间的优化；(b)rpa-lfs反应最佳反应温度的优化；
[0020]
图4为本发明rpa-lfs检测系统的特异性；
[0021]
(a)对12株临床常见的标准菌株进行rpa-lfs检测，每一条lfs的顶部标注了菌株atcc编号；(b)对12株临床分离的嗜麦芽窄食单胞菌进行rpa-lfs检测；
[0022]
图5为本发明rpa-lfs方法的最低检测限；
[0023]
(a)使用不同浓度的嗜麦芽窄食单胞菌基因组检测rpa-lfs体系的灵敏度；(b)spss软件分析rpa-lfs体系的最低检测限，水平虚线表示95％的检测限；(c)在反应体系中加入10ng的人类基因组dna，检测rpa-lfs的抗干扰性。
具体实施方式
[0024]
下面结合附图对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易被本领域人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
[0025]
实施例：
[0026]
标准菌株和临床分离菌株：
[0027]
以嗜麦芽窄食单胞菌为研究对象，建立可特异性鉴定该病原菌的rpa-lfs的快速检测方法。收集了1株嗜麦芽窄食单胞菌标准菌株，12株嗜麦芽窄食单胞菌的临床分离株，它们来源于患者的痰液、尿液和血液。收集了12种临床常见的标准病原菌，包括溶血葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、表皮性葡萄球菌、大肠杆菌、鲍曼不动杆菌、流感嗜血杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、粪肠球菌、屎肠球菌、白色念珠菌、副溶血性弧菌用于检测该方法的特异性；所有菌株均由连云港市第二人民医院检验科提供，均已采用参考培养-生化方法鉴定；表1列出了研究中使用的菌株。
[0028]
表1：本发明中用到的标准菌株及atcc编号
[0029][0030]
为探该rpa-lfs检测方法在临床标本中的适用性，在连云港市第二人民医院检验科微生物室收集了108例临床标本，其中57例来自于痰液，30例来自于尿液，21例来自于血液。
[0031]
微生物基因组的提取：
[0032]
将冻存的嗜麦芽窄食单胞菌接种于哥伦比亚血琼脂平板，置于35℃微生物培养箱培养24小时。挑取培养皿上的单菌落，置于5ml luria-bertani培养基中，在35℃振荡培养箱中震荡培养12小时。根据细菌基因组提取试剂盒说明书提取嗜麦芽窄食单胞菌基因组dna，保存于-20℃备用。基因组dna浓度使用超微量分光光度计定量。其他菌株和临床样本使用加热煮沸法提取dna，挑取菌苔置于100μl tris-edta中，100℃加热煮沸10分钟，释放基因组dna。12000rpm离心5分钟，取上清转移至无菌ep管，保存于-20℃备用。
[0033]
rpa引物设计：
[0034]
在ncbi网站检索嗜麦芽窄食单胞菌特异性序列nc_010943.1。使用primer premier 5软件设计引物对，由通用生物有限公司(中国)合成。引物设计原则如下：引物长度30-35bp；gc含量30％-70％；扩增子长度100-500bp；最大单核苷酸重复长度为5。使用基础型rpa试剂盒筛选最佳引物对。
[0035]
rpa反应：
[0036]
rpa反应体系共50μl，向含有酶组分的反应管中加入29.4μl反应缓冲液、2.4μl 10μm上游引物、2.4μl 10μm下游引物、13.2μl基因组模板和2.5μl 280nm醋酸镁溶液。上下颠倒充分混匀反应管内溶液，瞬时离心。将反应管置于37℃水浴锅孵育30分钟。rpa反应完成后，使用等体积的苯酚-氯仿-异戊醇(25:24:1)混合液抽提rpa扩增产物。12000rpm离心5分钟，取上清，加入适量dna上样缓冲液，通过2％琼脂糖凝胶电泳分离(90v，30min)，在紫外灯下观察rpa反应产物。
[0037]
rpa-lfs反应的探针的设计：
[0038]
根据rpa反应筛选出最佳引物对后，将上游引物向3’端方向延长16bp即为探针序
列。探针的5’端使用fitc标记，3’端使用c3-间臂基团(3
’‑
block)修饰，探针中部的一个碱基使用四氢呋喃取代，其中至少30bp位于thf位点的5’端，至少15bp位于其3’端。下游引物的5’端使用生物素标记。
[0039]
rpa-lfs程序：
[0040]
使用nfo型rpa试剂盒(安普未来，中国)进行rpa-lfs反应。rpa-lfs反应体系共50μl，向含有酶组分的反应管中加入29.4μl反应液、2.1μl 10μm上游引物、2.1μl 10μm下游引物、0.6μl 10μm探针、13.2μl基因组模板溶液和2.5μl 280nm醋酸镁溶液。上下颠倒充分混匀反应管内溶液，瞬时离心。将反应管置于37℃水浴锅孵育12分钟。使用双蒸水将反应产物稀释20倍，取50μl稀释液滴加入试纸条的加样孔中，等待显色。阳性反应观察到两条红线，包括控制线和检测线，但阴性反应和空白对照反应只观察到控制线。
[0041]
rpa-lfs反应条件优化：
[0042]
为实现rpa反应条件的最优化，对其反应时间和温度进行了改良。控制反应温度为37℃，将反应时间分别设置为0、2、4、6、8、10、12分钟，根据lfs显色情况筛选最佳反应时间。控制反应时间，分别在22、27、32、37、42、47、52℃进行rpa扩增，根据lfs显色情况筛选最佳反应温度。
[0043]
最低检出限(limit ofdetection,lod)分析：
[0044]
使用双蒸水梯度稀释嗜麦芽窄食单胞菌基因组dna(107、106、105、104、103、102、101cfu/ml)用于检测rpa-lfs体系的灵敏度。取1μl基因组dna稀释液加入rpa-lfs反应管中，补双蒸水至13.2μl，使得每个反应分别含有104、103、102、101、100、10-1
、10-2
cfu嗜麦芽窄食单胞菌的基因组，其余步骤如前文所述。每组浓度进行10次独立实验，通过对10个独立实验的概率回归分析，确定该方法的最低检测限(limit of detection，lod)，即95％的概率检测出阳性产物的最低浓度。
[0045]
检测临床标本：
[0046]
通过与微生物培养法和qpcr检测法进行比较来评估rpa-lfs法在临床标本检测中的实际应用价值。临床样本使用哥伦比亚血琼脂平板进行培养，置于35℃微生物培养箱培养18-48小时。使用vitek 2全自动微生物分析系统进行菌种鉴定。根据基因序列nc_010943.1设计qpcr引物，对临床样本使用qpcr法进行检测。根据公式:(共同阳性样本个数+共同阴性样本个数)
÷
样品总数
×
100％，计算rpa-lfs法与另外两种方法的符合率，通kappa指数来评估该方法与其他方法的一致性。
[0047]
结果如下：
[0048]
rpa引物的设计和筛选：
[0049]
根据嗜麦芽窄食单胞菌特异性基因序列nc_010943.1设计出4组引物对(表2)。以嗜麦芽窄食单胞菌基因组为模板，对4组候选引物对进行基础型rpa反应，通过2％琼脂糖凝胶电泳检测目标产物(图2a)。4组引物对均产生了与预期大小一致的靶向条带，分别为470bp、163bp、369bp和189bp，但在无模板对照(no template control，ntc)中出现了少量小于100bp的引物二聚体条带。相比之下，引物对1具有较亮的目标条带，并且无肉眼可见的引物二聚体。因此，选择引物对1用于探针的设计。
[0050]
表2：rpa引物对序列
[0051][0052]
注：f，上游引物；r，下游引物。
[0053]
rpa-lfs系统中最佳引物-探针组合的改进与确定；
[0054]
根据引物对1的上游引物设计探针，修饰后的探针和引物见表3，通过rpa-lfs检测引物探针组合f1/r1/p1的扩增性能及是否存在假阳性的情况。结果如图2b所示，f1/r1/p1引物-探针组合提供了正确的阳性信号(检测线和质控线上都有可见的红色条带)，这表明f1/r1/p1引物-探针组合具有良好的扩增性能。然而，在无模板对照组中，检测线上也显示出一条可见的弱化红带，表明f1/r1/p1引物探针组合存在假阳性扩增。考虑到rpa反应环境下可能发生不利的引物相互作用，产生较低分子量的dna副产物(《100bp)，即“引物噪音”。为减少“引物噪音”的产生，我们在引物中适当引入了碱基错配。错配原则如下：对具有四个以上连续配对碱基的区域进行碱基错配；靠近3’端的3个碱基不能替换；每条引物上替换的碱基不超过5个；不能有连续的2个碱基替换；优先使用a-g互换，t-c互换。f1/r1/p1引物-探针组合可产生的引物二聚体和碱基错配如图2c所示。当要引入适当碱基错配后，无模板对照组的假阳性信号消失(图2b)，将修改后的引物-探针组合命名为f/r/p。总体而言，获得了最佳的引物-探针组合为f/r/p，可用于嗜麦芽窄食单胞菌的rpa-lfs检测。
[0055]
表3：rpa-lfs探针序列
[0056][0057]
注：f，上游引物；r，下游引物；p，探针；下划线代表碱基突变位点。
[0058]
rpa-lfs反应条件的优化：
[0059]
为实现rpa反应条件的最优化，对其反应时间和温度进行了改良。控制反应温度为37℃，将反应时间分别设置为0、2、4、6、8、10、12分钟(图3a)。结果显示，反应4分钟时检测线
出现颜色较弱的条带，在8分钟时检测线条带清晰明亮。8分钟后，随着反应时间的延长，检测线无明显变化。控制反应时间，分别在22、27、32、37、42、47、52℃进行rpa扩增(图3b)。在反应温度为22℃时，检测线无条带，27℃时检测线出现较浅的条带。反应温度在37-42℃范围内，具有较为清晰的阳性条带。当反应温度达到52℃时，检测线无条带。综合时间、经济成本，rpa-lfs法的最佳反应条件为37℃，反应8分钟。
[0060]
rpa-lfs检测的特异性分析：
[0061]
为评价rpa-lfs检测法是否能特异性检测嗜麦芽窄食单胞菌，使用12种临床常见致病菌和12株嗜麦芽窄食单胞菌临床分离株进行rpa-lfs检测。如图4所示，使用其它致病菌基因组作为rpa-lfs反应模板时，检测线未出现阳性信号，当使用临床分离的嗜麦芽窄食单胞菌基因组dna作为模板时，检测线上出现了明显的阳性信号。本发明建立的rpa-lfs检测体系对嗜麦芽窄食单胞菌具有良好的特异性，与其他病原菌无交叉反应。
[0062]
rpa-lfd方法对嗜麦芽窄食单胞菌的检出限：
[0063]
为评估rpa-lfs方法的最低检测限，以梯度稀释的嗜麦芽窄食单胞菌基因组dna(107、106、105、104、103、102、101cfu/ml)为反应模板。反应体系中含有104cfu基因组时，检测线上出现强的阳性信号，随着模板浓度的降低，阳性条带的颜色减弱。当浓度低至10-1cfu时，阳性信号完全消失(图5a)。此外，为了进一步确定rpa-lfs检测的准确lod，对所有浓度进行10次独立的检测。结果显示，当反应体系中基因组含量为100cfu时，有9次为阳性结果，基因组含量为10-1
cfu时，有1次结果呈阳性。通过spss软件对10次检测的结果进行probit回归分析(图5b)。在95％的阳性概率下，rpa-lfs反应的最低检测限为1.107cfu。为了测试该系统是否能抵抗其他物种基因组的干扰，除了在反应体系中加入嗜麦芽窄食单胞菌基因组外，额外加入10ng的人类基因组dna。结果显示，该方法检测灵敏度不受人类dna的影响(图5c)。
[0064]
rpa-lfs在临床标本检测中的应用：
[0065]
通过与qpcr法和传统微生物培养法比较，评估rpa-lfs方法在临床中的实际应用价值(表4)。对收集的108例临床标本进行检测，结果显示，rpa-lfs法和qpcr法检测108例标本中有23例样本呈现嗜麦芽窄食单胞菌阳性，而采用微生物培养法检测只检测出22例样本为阳性。本发明建立的rpa-lfs方法与qpcr法的符合率为100％，与传统培养-生化方法的阳性符合率为99.07％，kappa指数值为0.9718。
[0066]
表4：rpa-lfs与qpcr法和传统微生物培养法比较
[0067][0068]
病原微生物的即时、精确诊断是临床检验不可忽视的难点之一。本发明公开了一种改良型的rpa-lfs方法，用于检测嗜麦芽窄食单胞菌。
[0069]
据统计，嗜麦芽窄食单胞菌是美国重症监护病房2015-2017年从肺炎患者临床样本中分离出的最常见的6种病原体之一，常与金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆
菌等混合生长，传统的微生物分离培养技术对于鉴定嗜麦芽窄食单胞菌具有一定挑战性。pcr技术快速准确、灵敏度高，但该方法需要复杂的反应仪器且用时较长，不适用于病原微生物的现场检测。rpa扩增技术是基于重组聚合酶的分子扩增方式，相较于其他分子扩增技术，rpa可在较低的温度中进行，不依赖于仪器的精准温控，有利于poct的发展。将rpa技术与lfs检测方法联合使用，可在短时间内实现对靶基因的快速可视化检测。
[0070]
本发明根据嗜麦芽窄食单胞菌特异性序列nc_010943.1设计引物和探针。该基因序列由fraser等研究者于2019年首次鉴定为嗜麦芽窄食单胞菌的保守序列，可用于嗜麦芽窄食单胞菌的鉴定。在设计探针过程中，发现下游引物和探针产生的引物二聚体会导致假阳性信号的发生，因此本发明引入碱基错配以避免假阳性信号。据文献报道，rpa反应可允许少许错配碱基的引入，但要避免在3’端引入错配。在引入错配碱基后，本发明建立了适用于特异性检验嗜麦芽窄食单胞菌的引物-探针序列f/r/p。通过优化反应时间和温度，确定了rpa-lfs体系的最佳反应条件为37℃，扩增时间为8min。根据probit回归分析，以梯度稀释的嗜麦芽窄食单胞菌基因组为模板，确定该体系检测嗜麦芽窄食单胞菌的最低检出限为1.107cfu，且灵敏度不受其它物种基因组干预。通过对108例临床来源的微生物样本进行检测以验证临床适用性，本发明建立的rpa-lfs方法与qpcr检测结果相符，具有一致性。但由于反应时间的缩短、检测设备的简易，以及碱基错配位点的引入，rpa-lfs体系的灵敏度略低于qpcr检测法。与传统的“金标准”生化培养法相比，rpa-lfs较为灵敏，阳性符合率为99.07％，两种检测方法的kappa指数值为0.9718，具有良好的一致性。
[0071]
以上实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

技术特征：
1.可视化检测嗜麦芽窄食单胞菌的rpa-lfs引物探针组合，其特征在于：包括f/r/p引物探针组合；所述f/r/p引物探针组合中；f的序列(5
’‑3’
)为：tgagcggaggcaggatccacggctacatctg；r的序列(5
’‑3’
)为：biotin-ctggccattctattccatcgccagttct tc；p的序列(5
’‑3’
)为：fitc-tgagcggaggcaggatccacggctacat ctg[thf]cagggcttcaatccgc-/c3-spacer/。2.根据权利要求1所述的引物探针组合在嗜麦芽窄食单胞菌rpa-lfs检测中或检测试剂盒的制备中的应用。3.嗜麦芽窄食单胞菌rpa-lfs检测引物探针组合的应用，其特征在于：所述f/r/p引物探针组合用于嗜麦芽窄食单胞菌的rpa-lfs的检测，为最佳的引物探针组合。

技术总结
本发明公开了可视化检测嗜麦芽窄食单胞菌的RPA-LFS引物探针组合及其应用，本发明首先以嗜麦芽窄食单胞菌特异性序列(NC_010943.1)为模板设计了4组候选RPA引物对，通过琼脂糖凝胶电泳检测各引物对的扩增性能及引物二聚体的形成情况，筛选出最佳引物对。根据最佳引物对设计特异性的探针序列，当使用LFS检测时受到引物二聚体的影响，产生了假阳性信号；通过对引物和探针序列引入碱基错配消除了引物和探针之间的引物二聚体，LFS无假阳性信号产生。对该检测体系进行了严格的功效测试，从而建立了一种改进的RPA-LFS系统用于检测嗜麦芽窄食单胞菌。该方法与PCR相比，检测结果准确一致，与培养-生化方法的重合率为99.07％，kappa指数值为0.9718。kappa指数值为0.9718。kappa指数值为0.9718。


技术研发人员：高绪柱 季拓 高玉芝
受保护的技术使用者：连云港市第二人民医院（连云港市临床肿瘤研究所）
技术研发日：2023.03.08
技术公布日：2023/7/11