一种脑瘫的生物学标志物及其用途

1.本发明涉及医疗器械烘干装置技术领域，具体为一种脑瘫的生物学标志物及其用途。


背景技术：

2.脑瘫是一种永久性的运动功能障碍，发病率约为2-3
‰
，是儿童时期最常见的身体残疾。随着医疗技术的发展，cp患儿的寿命有望延长至接近人口平均寿命。最近，加拿大政府的一份报告指出，到2023年，65岁以上的cp患者数量将增加到目前的三倍。在他们成长的过程中会经历身心健康的严重打击，因此他们的生活质量普遍较低。除此以外，cp是基于临床表现、神经系统体征(标准化运动/神经系统评估)以及神经影像学的临床诊断。cp患者所表现出的运动障碍在类型、严重程度及合并症上也不一致。因此，由于cp症状体征的高度异质性及缺乏实验室检查证据，cp的诊断难度大，需要有经验的专科医生进行严密的随访。
3.脑性瘫痪(cp)是儿童时期最常见的身体残疾，其病因复杂、具有高度异质性。然而，其具体的病理机制目前尚不清楚，为此，我们提出一种实用性更高的脑瘫的生物学标志物及其用途。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种脑瘫的生物学标志物及其用途，解决了现有的问题。
5.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：用于脑瘫的生物学标志组合物，包括甘油磷脂酸、溶血磷脂酰胆碱、甘油二酯和磷脂酰乙醇胺。
6.优选的，生物学标志组合物用于脑瘫患者的诊断。
7.与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
8.本发明中，51种差异代谢物质富集于多种功能代谢途径，尤其是甘油磷脂代谢和胆碱代谢。另外，富集于甘油磷脂代谢、逆行内源性大麻素信号、甘油酯代谢、胆碱代谢和神经营养素信号通路的18种脂类在cp血清中发生了显著变化。我们应用支持向量机(svm)构建了包含17种代谢物和脂质的多元分类模型，可以将cp病例与健康对照区分开。根据功能通路筛选出甘油磷脂酸(pa(18:3/22:6))、溶血磷脂酰胆碱(lpc(24:1))、lpc(15:0)、甘油二酯(dg(15:0/18:3/0:0))和磷脂酰乙醇胺(pe(18:0/16:0))组成一组生物学标志物可以作为cp的候选生物学标志物。并且，pa(18:3/22:6)、lpc(22:6)、lpc(20:2)和甘油三酯(tg(18:0/18:0/18:0))组成的生物标志物对于鉴别由粗大运动功能分级(gmfcs)判定的重症cp有较高的准确性。
9.本发明通过非靶向代谢组学和脂质组学进行分析，在cp中成功地鉴定了几种异常的小分子和代谢途径，这些分子将为进一步的病理学研究和生物标志物的开发提供有价值的信息。
附图说明
10.图1为本发明运动严重程度示意图；
11.图2为本发明代谢物分析示意图；
12.图3为本发明脂质物质分析示意图；
13.图4为本发明代谢物和脂质中筛选变量示意图。
具体实施方式
14.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
15.具体实施案例1:
16.1、实验前准备
17.(11)受试者筛选
18.经伦理委员会批准(批准号:xyfy2020-kl087-01)，并由参与本研究的每位参与者的监护人签署书面知情同意书。
19.cp患者30例(70％为男性，平均年龄＝24.2月，sd＝2.22，年龄范围＝12-48月)和30个没有神经发育障碍的早产儿作为对照组(平均年龄＝23.7个月，sd＝2.41，范围＝12-48个月)。cp和对照组的临床特征如表1所示。
20.由有经验的临床儿科医生评估和分类运动障碍的运动体征(痉挛、共济失调、运动障碍等)和解剖分布(单瘫、双瘫、三瘫、偏瘫和四肢瘫)。使用脑瘫大运动功能分类系统(gmfcs)对参与者进行了临床表征，以测量5个级别的运动严重程度(图1)。如果参与者(a)早产(出生时胎龄《37周，(b)临床确诊脑瘫，(c)年龄在12-48月龄之间，则纳入研究。如果(a)有严重感染、严重的肝肾功能损害，或者(b)他们在6个月内接受了手术，则不纳入研究队列。
21.表1患者的基线特征
22.[0023][0024]
(12)实验仪器
[0025]
傅里叶变换质谱q-exactive系统，thermo公司；超高效液相色谱vanquishhorizon系统，thermo公司；behc18色谱柱(100mm
×
2.1mmi.d.，1.7μm)，waters公司；jxdc-20型氮气吹扫仪，上海净信实业发展有限公司；lng-t88型台式快速离心浓缩干燥器，太仓市华美生化仪器厂；wonbio-96c型高通量组织破碎仪，上海万柏生物科技有限公司；sbl-10td型超声波清洗机300w-10l，宁波新芝生物科技股份有限公司；centrifuge5430r型高速冷冻离心机，德国eppendorf公司；newclassicmfms105du型电子天平，瑞士梅特勒公司。
[0026]
(13)试剂
[0027]
色谱纯甲醇(fisher公司)，色谱纯乙腈(fisher公司)，色谱纯甲酸(fisher公司)，
色谱纯水(fisher公司)，色谱纯异丙醇(fisher公司)，色谱纯乙酸铵(sigma-aldrich公司)，mtbe(adamas-beta公司)。
[0028]
2、用于诊断脑瘫患者的分析
[0029]
(21)样本制备
[0030]
(211)取50mg或者200μl样本于ep管中，加入80μl甲醇和400μlmtbe，涡旋混匀30s后，超声提取30min(5℃，40khz)；
[0031]
(212)将样品静置于-20℃，30min后高速离心(13000rmp，4℃)15min；
[0032]
(213)移取350μl上清液，在真空浓缩仪中干燥，100μl复溶液(异丙醇：乙腈＝1：1)复溶；
[0033]
(214)涡旋混匀30s后，冰水浴中40khz超声5min；
[0034]
(215)高速离心(13000rmp，4℃)5min后，移取80μ上清液至带内插管的进样小瓶中上机分析。
[0035]
(22)qc样本
[0036]
取等体积的所有样本代谢物混合制备成质控样本qc，在仪器分析过程中，每10个样本中插入一个qc样本，以考察整个分析过程的重复性。
[0037]
(23)lc-ms/ms分析
[0038]
lc-ms分析的仪器平台为thermo公司的超高效液相色谱串联傅里叶变换质谱uplc-qexactive系统。
[0039]
色谱条件：
[0040]
2μl样本经behc18色谱柱(100mm
×
2.1mmi.d.，1.7μm)分离后进入质谱检测。
[0041]
流动相a为10mm乙酸铵50％乙腈水溶液(含0.1％甲酸)，流动相b为2mm乙酸铵乙腈/异丙醇/水(10/88/2)(含0.02％甲酸)。
[0042]
分离梯度：0-4min，流动相a从线性65％降至40％，流动相b从线性35升至60％；4-12min，流动相a从线性40％降至15％，流动相b线性从60％升至85％；12-21min，流动相a从线性15％降至0％，流动相b线性从85％升至100％；21-24min，流动相a维持0％，流动相b维持100％；24.0-24.1min，流动相a线性从0％升至65％，流动相b线性从100％降至35％；24.1-28min，流动相a线性线性维持65％，流动相b线性线性维持35％。流速为0.40ml/min，柱温为40℃。
[0043]
质谱条件：
[0044]
样品质谱信号采集采用正负离子扫描模式，质量扫描范围m/z：200-2000。离子喷雾电压，正离子电压3000v，负离子电压3000v，鞘气60psi，辅助加热气20psi，离子源加热温度370℃，20-60v循环碰撞能。
[0045]
(24)数据预处理和搜库
[0046]
上机完成之后，lc-ms原始数据导入脂质组学处理软件lipidsearch(thermo，ca)进行基线过滤、峰识别、积分、保留时间校正、峰对齐和鉴定，最终得到一个脂质名称、保留时间、质荷比和峰强度的数据矩阵。数据矩阵用80％规则来去除缺失值，即保留至少一组样品中非零值80％以上的变量，再进行填补空缺值(原始矩阵中最小值填补空缺值)，为减小样品制备及仪器不稳定带来的误差，用总和归一化法对样本质谱峰的响应强度进行归一化，得到归一化后的数据矩阵，同时删除qc样本相对标准偏差(rsd)》30％的变量，并进行
log10对数化处理，得到最终用于后续分析的数据矩阵。
[0047]
(25)差异代谢物分析
[0048]
预处理后的数据上传美吉生物云平台上(https：//cloud.majorbio.com)进行数据分析，其中，r软件包ropls(version1.6.2)进行主成分分析(pca)和正交最小偏二乘判别分析分析(opls-da)，并使用7次循环交互验证来评估模型的稳定性，此外，进行student’st检验和差异倍数分析，显著差异代谢物的选择基于opls-da模型得到的变量权重值(vip)和student’st检验p值来确定，vip》1，p《0.05的代谢物为显著差异代谢物，总共筛选了xxx个差异物质，并通过kegg数据库(https：//www.kegg.jp/kegg/pathway.html)进行的代谢通路注释，获得差异物质参与的通路。python软件包scipy.stats进行通路富集分析，并通过fisher精确检验获得与实验处理最相关的生物学途径。
[0049]
结合脑瘫患者研究分析，进一步公开下述结果：
[0050]
(31)临床数据和患者特征
[0051]
表1总结了研究对象的人口统计学信息，cp组胎龄低于对照组。
[0052]
在我们的队列中，出生后低血压、感染、机械通气和使用皮质类固醇与早产儿的cp发病有关，产妇先兆子痫、新生儿窒息和胎儿生长受限也是早产儿发生cp的危险因素，出生后大脑磁共振成像(mri)显示cp与脑白质异常有显著相关性，根据脑瘫儿童粗大运动功能分级(gmfcs)对受试者进行严重程度分级，gmfcs
ⅳ‑ⅴ
级的cp患儿为重症cp(gmfcs_s)，gmfcs
ⅰ‑ⅲ
级的cp患儿为非重症cp(gmfcs_m)，19人(63.3％)为gmfcs_m，11人(36.7％)为gmfcs_s。
[0053]
(32)代谢物和脂质的鉴定
[0054]
代谢物有10462个高置信峰值，脂质有1423个，以及从这10462个代谢产物的高置信峰中，识别出866个注释代谢产物，并从1423个脂类峰中鉴定出1406个注释脂类；代谢物和脂类hmdb的复合分类结果分别如图1a和1b所示；这些代谢物参与kegg通路，涉及甘油磷脂代谢、胆汁分泌、abc转运体、蛋白质消化吸收、肿瘤中的中枢碳代谢等(图1c)；注释脂类参与的kegg通路，涉及甘油磷脂代谢、肿瘤中的胆碱代谢、鞘磷脂信号通路、逆行内源性大麻素信号系统、脂肪消化吸收等(图1d)。
[0055]
(33)代谢组学和脂质组学联合发现脑瘫中的异常代谢途径
[0056]
采用有监督的正交偏最小二乘判别分析(opls-da)模式识别方法来识别cp与对照组之间代谢差异的综合视图(图2a-d)；统计分析发现98个显著上调的血清代谢物和166个显著下调的血清代谢物与cp相关(图2e)，kegg通路分析发现有51种差异代谢物(表2)在多种功能途径中富集，涉及大脑发育和功能的多个方面；富集分析(图2f)突出了cp中占重要地位的20条代谢通路，包括甘油磷脂代谢、逆行内源性大麻素信号、胆碱代谢和神经营养素信号通路等；参与这些途径的15种代谢物是甘油二酯(dg)、脂肪酰、磷脂酰丝氨酸(ps)、甘油磷脂酸(pa)、磷脂酰甘油磷酸(pgp)、磷脂酰乙醇胺(pe)、磷脂酰胆碱(pc)和血清素；这15种差异代谢物质的相关性如图2g所示；富集于不同代谢途径的代谢物质都有很强的相关性。
[0057]
表2脑瘫组与对照组差异表达的代谢产物
[0058]
[0059]
[0060]
[0061]
[0062][0063]
另外，脂质物质中219种显著上调的和144种下调的脂质和cp也密切相关(图3a)；其中有18种差异脂质(表3)富集到在多种功能途径中；前20条显著富集的功能通路包括甘油磷脂代谢、逆行内源性大麻素信号、甘油酯代谢、胆碱代谢和神经营养素信号通路等(图3c)；富集于不同代谢途径的差异脂质有很强的相关性(图3b)；与cp相关的几条重要代谢途径之间的关系如图3d所示。
[0064]
表3脑瘫组与对照组差异表达的脂质
[0065]
[0066]
[0067][0068]
(34)早产相关cp患儿血清潜在标志物的roc曲线分析
[0069]
采用lasso回归从69种富集于功能通路的差异代谢物和脂质中筛选变量(图4a)；从lasso回归中筛选出的17种变量(表4)，利用支持向量机(svm)构建roc曲线，如图4b所示(auc＝0.95)；根据差异物质所在功能通路以及物质在cp组及对照组之间的差异显著性，我们选择pa(18:3/22:6)、溶血磷脂酰胆碱(lpc(24:1))、lpc(15:0)、dg(15:0/18:3/0:0)和pe(18:0/16:0)行roc分析；评估这5种差异物质诊断早产儿脑瘫发病的临床潜力；如图4c所示，以上5种差异物质组成的血清生物标志物对于诊断早产相关cp准确性较高(auc＝0.912)；5种潜在标记物相对浓度如图4f所示。
[0070]
表4用lasso回归法筛选出17种代谢物和脂类
[0071]
[0072][0073]
(35)重症cp患儿血清潜在标志物的筛选
[0074]
根据脑瘫儿童粗大运动功能分级(gmfcs)，gmfcs
ⅳ‑ⅴ
级的cp患儿为重症cp(gmfcs_s)，gmfcs
ⅰ‑ⅲ
级的cp患儿为非重症cp(gmfcs_m)，veen图(图4d)显示21种差异代谢物和24种差异脂质与疾病严重程度相关，而仅有pa(18:3/22:6)、lpc(22:6)、lpc(20:2)和甘油三酯(tg(18:0/18:0/18:0))富集kegg功能通路上，而且上述4种差异物质与重症cp都存在相关性(表5)；roc分析提示4种差异物质组成的血清生物标志物对于区分重症cp的准确性较高(auc＝0.9)(图4e)，4种差异物质相对浓度如图4g所示。
[0075]
表5多元线性回归分析
[0076]

技术特征：
1.用于脑瘫的生物学标志组合物，其特征在于，包括甘油磷脂酸、溶血磷脂酰胆碱、甘油二酯和磷脂酰乙醇胺。2.根据权利要求1所述的生物学标志组合物用于脑瘫患者的诊断。

技术总结
本发明公开了一种脑瘫的生物学标志物及其用途，包括甘油磷脂酸、溶血磷脂酰胆碱、甘油二酯和磷脂酰乙醇胺。本发明通过非靶向代谢组学和脂质组学进行分析，在CP中成功地鉴定了几种异常的小分子和代谢途径，这些分子将为进一步的病理学研究和生物标志物的开发提供有价值的信息。值的信息。值的信息。


技术研发人员：姚瑞芹 李昕昱 罗强 李静 冯赵威
受保护的技术使用者：徐州医科大学
技术研发日：2023.02.16
技术公布日：2023/7/11