一种mRNA-LNP中提取游离mRNA的方法及其包封率的测定方法与流程

一种mrna-lnp中提取游离mrna的方法及其包封率的测定方法
技术领域
1.本发明属于核酸纯化和提取领域，更具体涉及从mrna-lnp中提取游离mrna的方法及其包封率的测定方法。


背景技术：

2.核酸药物可以通过调控靶蛋白表达应用于蛋白质相关疾病的治疗。从上世纪60年代初发现mrna开始，经过几十年的发展后，mrna治疗策略终于显示出临床效益，已有多款核酸药物在全球获批上市。然而，核酸药物递送载体的开发，始终是业界公认的核心壁垒和技术难点之一。
3.通过脂质纳米颗粒对核酸进行包裹并递送至目标区域是目前常用的核酸给药手段。正常情况下，mrna-lnp体系中大部分mrna被包封在脂质体内部，小部分以游离状态存在。mrna-lnp的包封率是指包封于脂质纳米颗粒内部的mrna占全部mrna的比例，是评价脂质纳米颗粒性质的重要指标。包封率的测定方法一般是先通过一定的方法(如柱层析法、透析法、超速离心法等)把未包封的游离药物与脂质纳米粒分离，并分别进行测定后计算得出。
4.在现有技术中，核酸脂质纳米颗粒(lipid nanoparticles，lnp)的包封率通常通过ribogreen法进行测定，ribogreen是一种用于定量检测溶液中rna含量的超敏感荧光核酸染料，当ribogreen荧光染料处于溶液状态时，几乎没有荧光活性，与rna结合时，其荧光活性将增加1000倍，因此可通过荧光光谱测定核酸的含量。在ribogreen法中，在不对包封后的核酸和游离的核酸进行分离的条件下，直接对总的样本进行测定，由于被包裹在脂质颗粒中的mrna无法被测出，因此可以直接测定得到游离的核酸量；随后通过表面活性剂对脂质纳米颗粒进行破乳处理，裂解脂质纳米颗粒释放出包封的核酸，再次测定得到总的核酸量，通过上述二者计算得到核酸的包封率。
5.然而，当rna片段大小在500bp—9kb范围时，ribogreen测试荧光强度和片段大小无关，这导致ribogreen还会结合样品中的杂质，如其它rna和dna，在一些应用场景中会导致结果出现偏差。另外，随着核酸药物设计的多样化发展，出现了需要同时递送两种以上mrna的lnp，ribogreen法不能同时对多种mrna的包封率进行检测，也对其使用造成了限制。
6.目前存在多种对生物样品中mrna进行分离提取的技术手段，但在含lnp的体系中，由于mrna-lnp结构的不稳定性，在受到外部因素(如提取过程中的机械力、电磁力等)影响时，包裹于lnp中的mrna易于发生泄露。这使得很多分离方法难以适用于分离lnp体系中的游离mrna。


技术实现要素：

7.针对现有技术的缺陷或需求，本发明人研究发现使用羧酸磁珠可以成功地从含lnp体系中提取游离的mrna，该过程不会对mrna-lnp结构产生破坏，且易于操作。同时，对mrna的高效液相色谱法的参数进行了大量的研究，得到较优的测定参数和条件。进一步将
羧酸磁珠从含mrna-lnp体系中提取游离的mrna的方法与高效液相色谱法结合后，不仅能更准确地测定mrna-lnp的包封率，还可同时测定多mrna-lnp的包封率，由此完成本发明。
8.本发明提供一种mrna-lnp中提取游离mrna的方法，其包括采用羧酸磁珠从含mrna-lnp体系中提取游离的mrna的步骤。优选地，将mrna-lnp体系与羧基磁珠于800-1200rpm振摇下作用20-60分钟。更优选地，将mrna-lnp体系与羧基磁珠于1000rpm振摇下作用30分钟。
9.在一个具体实施方式中，测定前羧基磁珠的处理：充分混匀磁珠，置于磁力架上至溶液完全透明，移去上清液；更具体地，采用涡旋并置于滚轴混匀仪上室温滚动混匀，吸取磁珠浓度5-15mg/ml混匀状态下的磁珠溶液至无酶离心管中；离心管置于磁力架上至溶液完全透明，移去上清液。
10.在另一个具体实施方式中，游离mrna的提取：在移去了上清液的磁珠中，加入mrna-lnp溶液，充分混匀；加入rna binding buffer，轻柔吸打混匀；置于加热振荡器上，室温旋转孵育；置于磁力架上至溶液清澈透明，移去上清液；加入depc水配制的乙醇溶液，涡旋混匀磁珠；置于磁力架上至溶液清澈透明，移去上清液后，进行干燥；移去磁力架，加入depc水，涡旋混匀磁珠并置于振荡器上室温孵育；涡旋并置于磁力架上直至溶液清澈透明；收集含游离mrna的上清液。
11.更优选地，置于振荡器上室温孵育是指置于振荡器上室温800-1200rpm孵育3-10min。
12.所述方法还包括进一步测定最后得到上清液中的mrna浓度的步骤；优选地，采用hplc的方法进行测定。
13.进一步优选地，采用dnapac
tm
rp色谱柱，流动相a为六氟异丙醇、三乙胺的水溶液；流动相b为六氟异丙醇、三乙胺的甲醇溶液；更具体地，流动相a配制：取六氟异丙醇21.06ml，三乙胺1.04ml，加水477.9ml，混匀；流动相b配制：取六氟异丙醇21.06ml，三乙胺1.04ml，加甲醇477.9ml，混匀。
14.其中测定中，液相的流速为0.4ml/min，检测波长为260nm，柱温为75℃，样品室温度为8℃，洗针溶剂为50％甲醇。洗脱程序如下：
15.时间-min流动相a-％流动相b-％0802018020666341966342159529595308020388020
16.本发明提供一种测定mrna-lnp的包封率的方法，其通过所述的方法提取制备的mrna-lnp中的游离mrna，并测定其含量，结合mrna-lnp中总mrna的含量来计算得到mrna-lnp的包封率。
17.优选地，包封率计算方法如下：
18.游离mrna浓度：
[0019][0020]
总mrna浓度：
[0021][0022]
包封率：ee％＝(c
t-cf)/c
t
；
[0023]
其中：
[0024]ct
为样品溶液中总mrna的浓度，μg/ml；
[0025]cf
为样品溶液中游离mrna的浓度，μg/ml；
[0026]at
为样品溶液中总mrna色谱峰的峰面积；
[0027]af
为样品溶液中游离mrna色谱峰的峰面积；
[0028]astd
为对照溶液中mrna色谱峰的峰面积；
[0029]cstd
为对照溶液中mrna的浓度，μg/ml；
[0030]
w为样品稀释倍数。
[0031]
基于本发明的方法能够很好地适用于分离lnp体系中的游离mrna，并结合优先的高效液相色谱法，可以准确测定mrna-lnp的包封率，对mrna-lnp的制备方法具有指导作用和制备效果的验证，具有实际意义。
附图说明
[0032]
图1、lnp直接加结合溶液后的cad检测图谱和lnp加结合溶液并经磁珠处理后的cad图谱。
[0033]
图2、不同长度mrna混合样品色谱图。
[0034]
图3、专属性。
[0035]
图4、总mrna检测的线性关系。
[0036]
图5、宽浓度范围内mrna峰面积和浓度的线性关系。
具体实施方式
[0037]
下面通过具体实施方式对本发明进行阐述，以期更好的理解本发明，但不构成对本发明的限制。
[0038]
实施例中采用的包封率计算方法如下：
[0039]
总mrna浓度：
[0040][0041]
游离mrna浓度：
[0042][0043]
包封率：ee％＝(c
t-cf)/c
t
。
[0044]
其中：
[0045]ct
为样品溶液中总mrna的浓度，μg/ml；
[0046]cf
为样品溶液中游离mrna的浓度，μg/ml；
[0047]at
为样品溶液中总mrna色谱峰的峰面积；
[0048]af
为样品溶液中游离mrna色谱峰的峰面积；
[0049]astd
为对照溶液中mrna色谱峰的峰面积；
[0050]cstd
为对照溶液中mrna的浓度，μg/ml；
[0051]
w为样品稀释倍数。
[0052]
实施例中采用的总mrna检测样品及对照品溶液的制备：
[0053]
对照品溶液：移取40μl mrna储备液(约200μg/ml)，加入160μl depc水，混匀稀释成约40μg/ml的mrna溶液，作为系统适用性溶液、总mrna和游离mrna含量计算的对照品(std)；
[0054]
供试品溶液：取mrna-lnp样品25μl至无酶离心管中，加入25μldepc水和50μl 2.5％的triton x-100，混匀后进液相测试。
[0055]
其中本实施例中的mrna-lnp样品按如下方法制备：
[0056]
用于脂质纳米颗粒组装的材料有：(1)可电离的脂质化合物：如dlin-mc3-dma(mc3)或alc-0315；(2)结构性脂质：如胆固醇cholesterol；(3)磷脂：如dspc为1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(distearoylphosphatidylcholine)；(4)聚乙二醇化脂质化合物：如dmg-peg2000为二肉豆蔻酰甘油-聚乙二醇2000或alc-0159；(5)核酸片段有效成分：如luciferase mrna等。脂质纳米颗粒组装材料名称及其结构式详见表1。
[0057]
表1脂质纳米颗粒组装材料名称及其结构式
[0058][0059][0060]
脂质纳米颗粒的制备方法：(1)将可电离阳离子脂质alc-0315、中性脂质dspc、胆固醇和聚乙二醇化脂质alc0159按46.3:9.4:42.7:1.6的摩尔百分比溶解于乙醇中；(2)将luc-cap0 n1-ψmrna溶解于柠檬酸缓冲液中；(3)采用微流控设备将配制的脂相和溶解有mrna成分的水相按1:3(v/v)进行混合(12ml/min)；(4)采用超滤离心管浓缩换液，并采用10mm tris透析介质置换lnp外部介质体系(3次)，得到lnp中间体，根据mrna含量采用透析介质蔗糖溶液将lnp定容至0.1mg/ml；(5)所得纳米颗粒经0.22μm针式过滤器进行除菌过滤后于密封玻璃瓶中低温保存。
[0061]
实施例一、游离mrna的分离
[0062]
一、实验流程
[0063]
使用羧基磁珠进行游离mrna的吸附，从而分离游离和包封的mrna。羧基磁珠采购自thermoscientific(dynabeads
tm
myone
tm
羧酸磁珠，货号:65011)，实验流程如下：
[0064]
a)充分混匀磁珠：涡旋20s并置于滚轴混匀仪上室温滚动混匀20min；
[0065]
b)吸取30μl(300μg，磁珠浓度10mg/ml)混匀状态下的磁珠溶液至无酶离心管中；
[0066]
c)离心管置于磁力架上至溶液完全透明(约30s-60s)，移去上清液；
[0067]
d)管中加入100μl mrna-lnp溶液，充分混匀；
[0068]
e)加入200μl 1.5*rna binding buffer，用移液器轻柔吸打混匀；
[0069]
f)置于加热振荡器上，室温1000rpm孵育10min；
[0070]
g)置于磁力架上至溶液清澈透明，移去上清液；
[0071]
h)加入500μldepc水配制的70％乙醇溶液，涡旋混匀磁珠；
[0072]
i)置于磁力架上至溶液清澈透明，移去上清液，尽可能完全移去溶液；
[0073]
j)将离心管置于磁力架上室温干燥；
[0074]
k)移去磁力架，加入100μldepc水，涡旋20s混匀磁珠并置于振荡器上室温1000rpm孵育5min；
[0075]
l)涡旋10s并置于磁力架上直至溶液清澈透明；
[0076]
m)收集上清液进液相测试，所测结果即为游离mrna的含量。
[0077]
二、吸附时间的确定
[0078]
为获得最佳分离效果，对样品与羧基磁珠作用的时间进行了考察，对比了mrna和磁珠于1000rpm振摇下作用10分钟、30分钟和60分钟的回收率，结果如下：
[0079]
表2吸附时间的确定
[0080]
振摇时间10min30min60minmrna回收率(20μg/ml)87％95％96％
[0081]
结果表明，为短时间内充分吸附游离的mrna，样品与磁珠加结合溶液后可1000rpm振摇30分钟。
[0082]
三、lnp吸附的确定
[0083]
使用空白lnp代替mrna进行磁珠吸附实验，考察lnp是否会被磁珠吸附。对比lnp直接加结合溶液后的cad检测图谱和lnp加结合溶液并经磁珠处理后的cad图谱，二者几乎重合(脂质峰面积回收率95％)，说明羧基磁珠对lnp基本无吸附作用(图1)。
[0084]
实施例二、mrna的检测条件的优化
[0085]
首先采用以下方法参数进行检测。详见表3。
[0086]
表3lnp中mrna含量测定方法初步参数条件
[0087][0088][0089]
采用表3中方法参数进样，考察方法的系统适用性结果见表4。
[0090]
表4系统适应性
[0091][0092]
结果表明，重复进样时mrna峰面积差异较大，从第1针开始至第4针呈逐渐增加的趋势，序列结束进行回针时mrna峰面积与初始进样时相差较大，系统不稳定。
[0093]
一、方法优化(一)
[0094]
鉴于重复进样时样品峰面积逐渐增加，怀疑色谱柱对mrna有较为明显的吸附，因此更换色谱柱进行实验，对比使用不同色谱柱的系统适用性结果，从而筛选出合适的色谱柱。实验选取了核酸分析常用的另外4款色谱柱：acquity
tm
premieroligounclotidebehc18色谱柱(2.1
×
50mm，1.7μm)、thermo，dnapac
tm
rp色谱柱(2.1
×
50mm，4μm)、ads，rnasep
tm
prepcolumn(7.8
×
50mm)和agilent advancebiooligonucleotides色谱柱(2.1
×
100mm),其中advancebiooligonucleotides色谱柱mrna未洗脱出峰，其他色谱柱系统适用性考察结果如下表5-1、5-2和5-3所示。
[0095]
表5-1系统适应性-acquity
tm
premieroligounclotidebehc18色谱柱
[0096][0097]
表5-2系统适应性-thermo，dnapac
tm
rp色谱柱
[0098]
[0099]
表5-3系统适应性-ads，rnasep
tm
prepcolumn
[0100][0101]
结果表明，在该流动相体系下，这几种色谱柱均对mrna有明显的吸附作用，导致重复进样时，第一针峰面积较低，后续因色谱柱吸附逐渐饱和，mrna峰面积逐渐增加。
[0102]
二、方法优化(二)
[0103]
为继续解决色谱柱对mrna的吸附问题，对流动相进行了调整。将三乙胺/乙腈流动相体系更换为六氟异丙醇/三乙胺/甲醇流动相体系(流动相a：200mmhfip，8.15mmtea水溶液；流动相b：甲醇)，使用thermo，dnapac
tm
rp色谱柱重复进样mrna溶液，结果发现连续进样5针mrna峰面积的rsd在2％以内，说明采用六氟异丙醇/三乙胺/甲醇流动相可大大降低mrna在色谱柱上的吸附。方法优化后具体色谱参数见表6。
[0104]
表6方法优化(二)色谱参数
[0105][0106]
三、方法优化(三)
[0107]
为使该方法能用于不同长度mrna的分离(选取了egfp mrna和luciferase mrna两种mrna，944nt和1985nt)并进一步降低mrna在色谱柱上的残留，进一步将流动相优化为400mmhfip体系(流动相a：400mmhfip，15mmtea水溶液；流动相b：400mmhfip，15mmtea甲醇溶液)，并对液相梯度进一步进行了优化。不同长度mrna的色谱图见图2。结果显示，两种不同mrna在此条件下可以实现较好地分离。优化后的色谱参数见表7。
[0108]
表7方法优化(三)色谱参数
[0109]
[0110][0111]
六、方法验证
[0112]
采用方法优化(三)后的色谱参数进行预验证。
[0113]
1、系统适应性
[0114]
取对照mrna溶液连续进样5针，结果见表8。
[0115]
表8系统适应性结果
[0116]
[0117][0118]
结果表明，对照溶液系统适应性良好，连续5针进样rsd及回针rsd均小于5.0％。
[0119]
2、专属性
[0120]
取空白溶剂、空白lnp溶液、对照mrna溶液进样，在mrna主峰保留时间窗内无干扰。结果见图3。本方法专属性良好，符合要求。
[0121]
3、线性
[0122]
配制不同浓度的mrna线性溶液进样测试，mrna浓度范围在50-150％之间。实验结果如下表9及附图4。
[0123]
表9线性实验结果
[0124][0125]
结果表明，当mrna浓度在14.2-42.6μg/ml(相当于50％-150％)之间时，mrna峰面积与浓度呈良好的线性关系，线性相关系数r大于0.99；各线性浓度响应因子的rsd也小于5.0％。
[0126]
4、准确度
[0127]
在空白lnp溶液中加标mrna溶液，然后加曲拉通破乳，进样测试样品的回收率，以考察方法的准确性。实验结果见表10。
[0128]
表10准确度
[0129][0130]
[0131]
结果表明，各浓度水平回收率在95-105％之间，准确度较好。
[0132]
5、重复性
[0133]
配制6份供试品溶液进样测试，实验结果见表11。
[0134]
表11重复性
[0135][0136]
结果表明，6份供试品溶液中mrna含量的rsd小于5.0％，方法重复性良好。
[0137]
七、方法确立
[0138]
通过上述方法初步确立，优化，预验证，lnp中mrna含量测定分析方法可以确立，如表12。
[0139]
表12确立的方法参数
[0140]
[0141][0142]
实施例三、游离mrna检测的线性和实际样品中游离mrna的回收率
[0143]
1、游离mrna检测的线性
[0144]
正常样品中游离mrna的浓度通常是较低的，而当样品包封率较差的时候mrna浓度又较高，因此采用实施例二中确定的最佳条件，考察了更宽浓度范围内mrna峰面积和浓度的线性关系，结果如下表13和图5所示。
[0145]
表13游离mrna检测的线性
[0146]
mrna浓度μg/ml峰面积响应因子f0.568012.85422.632.27257.91425.494.544121.72226.7922.72659.34829.0245.441380.69130.3890.882745.17730.21227.27059.59931.07
[0147]
2、实际样品中游离mrna的回收率
[0148]
在mrna-lnp样品中加入不同浓度的特定量的游离mrna，混合均匀制备出不同加标水平的mrna加标回收样品。取未加标样品和各加标样品，采用实施例一中确定的最佳条件使用磁珠法吸附并洗脱样品中游离的mrna。采用实施例二中确定最佳条件，采用hplc分析分别对对照品溶液、未加标样品回收溶液和不同mrna浓度的回收样品溶液测定并计算样品中游离mrna的加标回收率。结果如表14。
[0149]
表14实际样品中游离mrna的回收率
[0150]
[0151][0152]
各加标溶液中游离mrna的回收率均在80％-120％之间，rsd不超过10％。上述结果符合各加标溶液中游离mrna的回收率应在80％-120％之间的接受标准。

技术特征：
1.一种mrna-lnp中提取游离mrna的方法，其特征在于，包括采用羧酸磁珠从含mrna-lnp体系中提取游离mrna的步骤。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，将mrna-lnp体系与羧基磁珠于800-1200rpm振摇下作用20-60分钟。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，将mrna-lnp体系与羧基磁珠于1000rpm振摇下作用30分钟。4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，测定前羧基磁珠的处理：充分混匀磁珠，置于磁力架上至溶液完全透明，移去上清液；更具体地，采用涡旋并置于滚轴混匀仪上室温滚动混匀，吸取磁珠浓度5-15mg/ml混匀状态下的磁珠溶液至无酶离心管中；离心管置于磁力架上至溶液完全透明，移去上清液。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，游离mrna的提取步骤：在移去了上清液的磁珠中，加入mrna-lnp溶液，充分混匀；加入rna结合缓冲液，轻柔吸打混匀；置于加热振荡器上，室温旋转孵育；置于磁力架上至溶液清澈透明，移去上清液；加入depc水配制的乙醇溶液，涡旋混匀磁珠；置于磁力架上至溶液清澈透明，移去上清液后，进行干燥；移去磁力架，加入depc水，涡旋混匀磁珠并置于振荡器上室温孵育；涡旋并置于磁力架上直至溶液清澈透明；收集含游离mrna的上清液；更优选地，置于振荡器上室温孵育是指置于振荡器上室温800-1200rpm孵育3-10min。6.如权利要求1至5任一项所述的方法，其特征在于，还包括进一步测定最后得到上清液中的mrna浓度的步骤；优选地，采用hplc的方法进行测定。7.如权利要求6所述方法，其特征在于，采用dnapac
tm
rp色谱柱，流动相a为六氟异丙醇、三乙胺的水溶液；流动相b为六氟异丙醇、三乙胺的甲醇溶液；更具体地，流动相a配制：取六氟异丙醇21.06ml，三乙胺1.04ml，加水477.9ml，混匀；流动相b配制：取六氟异丙醇21.06ml，三乙胺1.04ml，加甲醇477.9ml，混匀。8.如权利要求6所述方法，其特征在于，流速为0.4ml/min，检测波长为260nm，柱温为75℃，样品室温度为8℃，洗针溶剂为50％甲醇。9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，洗脱程序如下：
10.一种测定mrna-lnp的包封率的方法，其特征在于，通过如权利要求1至9任一项所述的方法提取制备的mrna-lnp中的游离mrna，并测定其含量，结合mrna-lnp中总mrna的含量来计算得到mrna-lnp的包封率；具体地，包封率计算方法如下：游离mrna浓度：总mrna浓度：包封率：ee％＝(v
t-c
f
)/c
t
；其中：c
t
为样品溶液中总mrna的浓度，μg/ml；c
f
为样品溶液中游离mrna的浓度，μg/ml；a
t
为样品溶液中总mrna色谱峰的峰面积；a
f
为样品溶液中游离mrna色谱峰的峰面积；a
std
为对照溶液中mrna色谱峰的峰面积；c
std
为对照溶液中mrna的浓度，μg/ml；w为样品稀释倍数；优选地，检测样品中总mrna时，样品处理如下：取mrna-lnp样品25μl至无酶离心管中，加入25μl depc水和50μl 2.5％的triton x-100，混匀后进液相测试。

技术总结
本发明属于核酸纯化和提取领域，更具体涉及从mRNA-LNP中提取mRNA的方法及其包封率的测定方法。本发明发现使用羧酸磁珠可以成功地从含LNP体系中提取游离的mRNA，该过程不会对mRNA-LNP结构产生破坏，且易于操作。进一步，将其与高效液相色谱法结合后，不仅能更准确地测定mRNA-LNP的包封率，还可同时测定多mRNA-LNP的包封率。的包封率。


技术研发人员：白效静 李深正 王永毅 范康梅 曾旭
受保护的技术使用者：杭州剂泰医药科技有限责任公司
技术研发日：2023.05.17
技术公布日：2023/7/7