一种安全有效的同种异体免疫细胞组合物及其制备方法和其用途与流程

1.本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种安全有效的同种异体免疫细胞组合物及其制备方法和其用途。


背景技术：

2.恶性肿瘤成为威胁人类生命健康的主要疾病之一，其发病率呈现逐年增高趋势。手术、放疗和化疗成为肿瘤治疗的三大常规手段，但均存在特异性不足的缺陷，导致在清除肿瘤细胞的同时，造成正常组织和器官不同程度的损伤。手术切除在一定程度上能解除癌症患者遭受癌症带来的痛苦，但对于位于体内深部的癌症和已扩散的肿瘤无能为力。放疗和化疗临床使用多年，但存在选择性低、副作用大、大剂量致死、呕吐、恶心等潜在风险和毒副作用。20世纪80年代，rosenberg sa等观察到患非免疫系统肿瘤的动物给予重组il-2治疗后，动物的淋巴细胞可以导致肿瘤的消退和转移。免疫细胞治疗逐步成为第四种肿瘤综合治疗模式。
3.car-t细胞疗法包括自体car-t和同种异体car-t。自体car-t细胞的制备需从患者自身血液中分离和培养免疫细胞，再将其用于患者自身的肿瘤免疫治疗。因癌症患者尤其是肿瘤晚期患者、化疗治疗患者的细胞(如pbmc)活性极低、细胞活化困难、扩增慢等问题，因其免疫治疗效果有效而限制其临床应用。同种异体car-t细胞疗法采用健康人t细胞或干细胞来源的t细胞培养制备免疫细胞，再将其用于肿瘤免疫治疗。同种异体car-t细胞疗法解决了自体car-t疗法存在的肿瘤患者自体pmbc细胞活力差、细胞活化困难、扩增慢(扩增倍数低)等问题，但仍存在异体细胞被宿主免疫细胞识别并吞噬、培养周期长(20-60天)、生产成本高、免疫细胞活力低、免疫治疗效果有待提升等问题，而影响其免疫治疗靶向性和精准性。为此，亟需研究开发靶向性好、杀伤效率高、安全有效的免疫细胞，以满足临床精准治疗的迫切需求。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种安全有效的免疫细胞组合物，所述组合物由(1-10)
×
107个/ml的免疫细胞、0.5-2％的人血白蛋白和生理盐水组成，其中，所述免疫细胞由第一同种异体免疫细胞和第二同种异体免疫细胞用生理盐水制成密度为(1-10)
×
107个/ml后，按照第一同种异体免疫细胞：第二同种异体免疫细胞的体积比为1:1-2配置，所述免疫细胞活率≥95％。
5.本发明的优选技术方案中，所述组合物由(2-8)
×
107个/ml的免疫细胞、1-1.5％人血白蛋白浓度和注射用生理盐水组成，其中，免疫细胞活率≥98％。
6.本发明的优选技术方案中，所述第一同种异体免疫细胞的制备包括下述步骤：
7.(1)用肿瘤患者血浆浸润培养瓶后，再将其置于37.0℃
±
1.0℃、7.5％
±
1.0％co2条件下静置4h-5h，制得肿瘤患者血浆包被的培养瓶；
7.02-7.76。
21.本发明的优选技术方案中，所述免疫细胞的扩增倍数≥900倍，优选≥1000倍，更优选≥1100倍。
22.本发明的优选技术方案中，所述免疫细胞活率≥95％，优选≥98％。
23.本发明的优选技术方案中，有效期内，组合物中免疫细胞活率≥85％。
24.本发明的优选技术方案中，组合物置于15-25℃条件下放置≤12h，组合物中免疫细胞活率≥85％。
25.本发明的优选技术方案中，所述组合物中不含防腐剂和抗生素。
26.本发明的优选技术方案中，所述健康人为患者的五代以内直系亲属。
27.本发明的另一目的在于提供一种安全有效的免疫细胞组合物的制备方法，所述组合物由(1-10)
×
107个/ml的免疫细胞、0.5-2％的人血白蛋白和生理盐水组成，其中，所述免疫细胞由第一同种异体免疫细胞和第二同种异体免疫细胞用生理盐水制成密度为(1-10)
×
107个/ml后，按照第一同种异体免疫细胞：第二同种异体免疫细胞的体积比为1:1-2配置，所述免疫细胞活率≥95％，将所需量的第一同种异体免疫细胞和第二同种异体免疫细胞、人血白蛋白与生理盐水均匀混合，即得。
28.本发明的优选技术方案中，所述组合物由(2-8)
×
107个/ml的免疫细胞、1-1.5％人血白蛋白浓度和注射用生理盐水组成，其中，免疫细胞活率≥98％。
29.本发明的优选技术方案中，所述第一同种异体免疫细胞的制备包括下述步骤：
30.(1)用肿瘤患者血浆浸润培养瓶后，再将其置于37.0℃
±
1.0℃、7.5％
±
1.0％co2条件下静置4h-5h，制得肿瘤患者血浆包被的培养瓶；
31.(2)在肿瘤患者血浆包被的培养瓶中加入健康人pbmc和无血清培养基，将其制成密度为(1-5)
×
106个/ml的细胞培养液后，再将其置于37.0℃
±
1.0℃、7.5％
±
1.0％co2条件下培养24h-48h，其中，所述无血清培养基选自kbm 581、gt-t551h3、x-vivo15、imsf100的任一种或其组合；
32.(3)每间隔24-72h，按照培养体系中的无血清培养基与肿瘤患者血浆的体积比为100-200：1，向培养体系中间歇补充所需量的无血清培养基和肿瘤患者血浆，离心，收集cd
3+
≥40％、cd
56+
≥60％的免疫细胞，即得，其中，所述无血清培养基选自kbm 581、gt-t551h3、x-vivo15、imsf100的任一种或其组合。
33.本发明的优选技术方案中，所述第二同种异体免疫细胞的制备包括下述步骤：
34.(1)将健康人pbmc按照密度为(0.2-1.6)
×
106个/ml与淋巴细胞活化剂置于无血清培养基中，再将其置于37.0℃
±
1.0℃、7.5％
±
1.0％co2条件下培养24h-48h，其中，所述淋巴细胞活化剂选自抗人cd2抗体、抗人cd3抗体、抗人cd28抗体、植物血凝素(pha)的任一种或其组合或将其固化在载体上的含抗体载体，所述无血清培养基选自kbm 581、gt-t551h3、x-vivo15、imsf100的任一种或其组合；
35.(2)按照培养体系：健康人血浆的体积比为100-200：1，向培养体系中补充所需量的无血清培养基和健康人血浆，再将其置于37.0℃
±
1.0℃、7.5％
±
1.0％co2条件下培养24h-48h；
36.(3)每间隔24h-72h，按照培养体系：肿瘤患者血浆的体积比为100-200：1，向培养体系中间歇补充所需量的无血清培养基和肿瘤患者血浆，再将其置于37.0℃
±
1.0℃、
7.5％
±
1.0％co2条件下培养，离心，收集cd
3+
≥40％、cd
56+
≥60％的免疫细胞，制得第二同种异体免疫细胞。
37.本发明的优选技术方案中，所述无血清培养基中任选地含有10-60ng/ml的细胞因子,所述细胞因子选自il-2、il-7、il-10、il-12、il-15、il-17a、il-21、il-27的任一种或其组合。
38.本发明的优选技术方案中，所述无血清培养基中含有细胞因子15-55ng/ml，优选为20-50ng/ml。
39.本发明的优选技术方案中，所述淋巴细胞活化剂为抗人cd3抗体，优选为2.5μg/ml*(8-15)ml-5μg/ml*(8-15)ml，优选为2.5μg/ml*(10-13)ml-3.8μg/ml*(10-13)ml。
40.本发明的优选技术方案中，所述pbmc的制备包括下述步骤：在采集的人全血中加入稀释剂，搅拌，混匀，将其加至分离液中，再将其置于1000rpm-3000rpm*5min-30min条件下离心，收集分界面间细胞层后，加入洗涤液，离心洗涤，收集细胞，即得，其中，全血：稀释剂的体积比为1：(0.5-1.5)，所述稀释剂选自氯化钠注射液、hank’s缓冲液、dulbecco's磷酸盐缓冲液的任一种或其组合，所述分离液选自ficoll、lymphoprep、lymphocyte separation media、cell separation media的任一种或其组合，所述洗涤液选自0.1％人血白蛋白氯化钠注射液、dulbecco's磷酸盐缓冲液、氯化钠注射液的任一种或其组合。
41.本发明的优选技术方案中，全血：稀释剂的体积比为1：(0.8-1.2)，优选为1:1。
42.本发明的优选技术方案中，所述离心条件为(1500rpm-2500rpm)*(5min-30min)，优选为(2000rpm-2500rpm)*(10min-25min)。
43.本发明的优选技术方案中，所述免疫细胞培养体系ph 7.00-7.80,优选为ph 7.02-7.76。
44.本发明的优选技术方案中，所述免疫细胞的扩增倍数≥900倍，优选≥1000倍，更优选≥1100倍。
45.本发明的优选技术方案中，所述免疫细胞活率≥95％，优选≥98％。
46.本发明的优选技术方案中，有效期内，组合物中免疫细胞活率≥85％。
47.本发明的优选技术方案中，组合物置于15-25℃条件下放置≤12h，组合物中免疫细胞活率≥85％。
48.本发明的优选技术方案中，所述组合物中不含防腐剂和抗生素。
49.本发明的优选技术方案中，所述健康人为患者的五代以内直系亲属。
50.本发明的目的在于提供一种安全有效的同种异体免疫细胞，所述免疫细胞由第一同种异体免疫细胞和第二同种异体免疫细胞用生理盐水制成密度为(1-10)
×
107个/ml后，按照第一同种异体免疫细胞：第二同种异体免疫细胞的体积比为1:1-2配置而成，所述免疫细胞活率≥95％，其中，
51.所述第一同种异体免疫细胞的制备包括下述步骤：
52.(1)用肿瘤患者血浆浸润培养瓶后，再将其置于37.0℃
±
1.0℃、7.5％
±
1.0％co2条件下静置4h-5h，制得肿瘤患者血浆包被的培养瓶；
53.(2)在肿瘤患者血浆包被的培养瓶中加入健康人pbmc和无血清培养基，将其制成密度为(1-5)
×
106个/ml的细胞培养液后，再将其置于37.0℃
±
1.0℃、7.5％
±
1.0％co2条件下培养24h-48h，其中，所述无血清培养基选自kbm 581、gt-t551h3、x-vivo15、imsf100的
任一种或其组合；
54.(3)每间隔24-72h，按照培养体系中的无血清培养基与肿瘤患者血浆的体积比为100-200：1，向培养体系中间歇补充所需量的无血清培养基和肿瘤患者血浆，离心，收集cd
3+
≥40％、cd
56+
≥60％的免疫细胞，即得，其中，所述无血清培养基选自kbm 581、gt-t551h3、x-vivo15、imsf100的任一种或其组合；
55.或者，所述第二同种异体免疫细胞的制备包括下述步骤：
56.(1)将健康人pbmc按照密度为(0.2-1.6)
×
106个/ml与淋巴细胞活化剂置于无血清培养基中，再将其置于37.0℃
±
1.0℃、7.5％
±
1.0％co2条件下培养24h-48h，其中，所述淋巴细胞活化剂选自抗人cd2抗体、抗人cd3抗体、抗人cd28抗体、植物血凝素(pha)的任一种或其组合或将其固化在载体上的含抗体载体，所述无血清培养基选自kbm 581、gt-t551h3、x-vivo15、imsf100的任一种或其组合；
57.(2)按照培养体系：健康人血浆的体积比为100-200：1，向培养体系中补充所需量的无血清培养基和健康人血浆，再将其置于37.0℃
±
1.0℃、7.5％
±
1.0％co2条件下培养24h-48h；
58.(3)每间隔24h-72h，按照培养体系：肿瘤患者血浆的体积比为100-200：1，向培养体系中间歇补充所需量的无血清培养基和肿瘤患者血浆，再将其置于37.0℃
±
1.0℃、7.5％
±
1.0％co2条件下培养，离心，收集cd
3+
≥40％、cd
56+
≥60％的免疫细胞，即得。
59.本发明的优选技术方案中，所述无血清培养基中任选地含有10-60ng/ml的细胞因子,所述细胞因子选自il-2、il-7、il-10、il-12、il-15、il-17a、il-21、il-27的任一种或其组合。
60.本发明的优选技术方案中，所述无血清培养基中含有细胞因子15-55ng/ml，优选为20-50ng/ml。
61.本发明的优选技术方案中，所述淋巴细胞活化剂为抗人cd3抗体，优选为2.5μg/ml*(8-15)ml-5μg/ml*(8-15)ml，优选为2.5μg/ml*(10-13)ml-3.8μg/ml*(10-13)ml。
62.本发明的优选技术方案中，所述pbmc的制备包括下述步骤：在采集的人全血中加入稀释剂，搅拌，混匀，将其加至分离液中，再将其置于1000rpm-3000rpm*5min-30min条件下离心，收集分界面间细胞层后，加入洗涤液，离心洗涤，收集细胞，即得，其中，全血：稀释剂的体积比为1：(0.5-1.5)，所述稀释剂选自氯化钠注射液、hank’s缓冲液、dulbecco's磷酸盐缓冲液的任一种或其组合，所述分离液选自ficoll、lymphoprep、lymphocyte separation media、cell separation media的任一种或其组合，所述洗涤液选自0.1％人血白蛋白氯化钠注射液、dulbecco's磷酸盐缓冲液、氯化钠注射液的任一种或其组合。
63.本发明的优选技术方案中，全血：稀释剂的体积比为1：(0.8-1.2)，优选为1:1。
64.本发明的优选技术方案中，所述离心条件为(1500rpm-2500rpm)*(5min-30min)，优选为(2000rpm-2500rpm)*(10min-25min)。
65.本发明的优选技术方案中，所述免疫细胞培养体系ph 7.00-7.80,优选为ph 7.02-7.76。
66.本发明的优选技术方案中，所述免疫细胞的扩增倍数≥900倍，优选≥1000倍，更优选≥1100倍。
67.本发明的优选技术方案中，所述免疫细胞活率≥95％，优选≥98％。
68.本发明的优选技术方案中，所述健康人为患者的五代以内直系亲属。
69.本发明的目的在于提供一种安全有效的同种异体免疫细胞的制备方法，所述免疫细胞由第一同种异体免疫细胞和第二同种异体免疫细胞用生理盐水制成密度为(1-10)
×
107个/ml后，按照第一同种异体免疫细胞：第二同种异体免疫细胞的体积比为1:1-2配置而成，所述免疫细胞活率≥95％，将所需量的第一同种异体免疫细胞和第二同种异体免疫细胞、人血白蛋白与生理盐水均匀混合，即得，其中，
70.所述第一同种异体免疫细胞的制备包括下述步骤：
71.(1)用肿瘤患者血浆浸润培养瓶后，再将其置于37.0℃
±
1.0℃、7.5％
±
1.0％co2条件下静置4h-5h，制得肿瘤患者血浆包被的培养瓶；
72.(2)在肿瘤患者血浆包被的培养瓶中加入健康人pbmc和无血清培养基，将其制成密度为(1-5)
×
106个/ml的细胞培养液后，再将其置于37.0℃
±
1.0℃、7.5％
±
1.0％co2条件下培养24h-48h，其中，所述无血清培养基选自kbm 581、gt-t551h3、x-vivo15、imsf100的任一种或其组合；
73.(3)每间隔24-72h，按照培养体系中的无血清培养基与肿瘤患者血浆的体积比为100-200：1，向培养体系中间歇补充所需量的无血清培养基和肿瘤患者血浆，离心，收集cd
3+
≥40％、cd
56+
≥60％的免疫细胞，制得第一同种异体免疫细胞，其中，所述无血清培养基选自kbm 581、gt-t551h3、x-vivo15、imsf100的任一种或其组合；
74.或者，所述第二同种异体免疫细胞的制备包括下述步骤：
75.(1)将健康人pbmc按照密度为(0.2-1.6)
×
106个/ml与淋巴细胞活化剂置于无血清培养基中，再将其置于37.0℃
±
1.0℃、7.5％
±
1.0％co2条件下培养24h-48h，其中，所述淋巴细胞活化剂选自抗人cd2抗体、抗人cd3抗体、抗人cd28抗体、植物血凝素(pha)的任一种或其组合或将其固化在载体上的含抗体载体，所述无血清培养基选自kbm 581、gt-t551h3、x-vivo15、imsf100的任一种或其组合；
76.(2)按照培养体系：健康人血浆的体积比为100-200：1，向培养体系中补充所需量的无血清培养基和健康人血浆，再将其置于37.0℃
±
1.0℃、7.5％
±
1.0％co2条件下培养24h-48h；
77.(3)每间隔24h-72h，按照培养体系：肿瘤患者血浆的体积比为100-200：1，向培养体系中间歇补充所需量的无血清培养基和肿瘤患者血浆，再将其置于37.0℃
±
1.0℃、7.5％
±
1.0％co2条件下培养，离心，收集cd
3+
≥40％、cd
56+
≥60％的免疫细胞，即得。
78.本发明的优选技术方案中，所述无血清培养基中任选地含有10-60ng/ml的细胞因子,所述细胞因子选自il-2、il-7、il-10、il-12、il-15、il-17a、il-21、il-27的任一种或其组合。
79.本发明的优选技术方案中，所述无血清培养基中含有细胞因子15-55ng/ml，优选为20-50ng/ml。
80.本发明的优选技术方案中，所述淋巴细胞活化剂为抗人cd3抗体，优选为2.5μg/ml*(8-15)ml-5μg/ml*(8-15)ml，优选为2.5μg/ml*(10-13)ml-3.8μg/ml*(10-13)ml。
81.本发明的优选技术方案中，所述pbmc的制备包括下述步骤：在采集的人全血中加入稀释剂，搅拌，混匀，将其加至分离液中，再将其置于1000rpm-3000rpm*5min-30min条件下离心，收集分界面间细胞层后，加入洗涤液，离心洗涤，收集细胞，即得，其中，全血：稀释
剂的体积比为1：(0.5-1.5)，所述稀释剂选自氯化钠注射液、hank’s缓冲液、dulbecco's磷酸盐缓冲液的任一种或其组合，所述分离液选自ficoll、lymphoprep、lymphocyte separation media、cell separation media的任一种或其组合，所述洗涤液选自0.1％人血白蛋白氯化钠注射液、dulbecco's磷酸盐缓冲液、氯化钠注射液的任一种或其组合。
82.本发明的优选技术方案中，全血：稀释剂的体积比为1：(0.8-1.2)，优选为1:1。
83.本发明的优选技术方案中，所述离心条件为(1500rpm-2500rpm)*(5min-30min)，优选为(2000rpm-2500rpm)*(10min-25min)。
84.本发明的优选技术方案中，所述免疫细胞培养体系ph 7.00-7.80,优选为ph 7.02-7.76。
85.本发明的优选技术方案中，所述免疫细胞的扩增倍数≥900倍，优选≥1000倍，更优选≥1100倍。
86.本发明的优选技术方案中，所述免疫细胞活率≥95％，优选≥98％。
87.本发明的优选技术方案中，所述健康人为患者的五代以内直系亲属。
88.本发明的另一目的在于提供安全有效的同种异体免疫细胞或其组合物用于制备肿瘤免疫治疗或肿瘤根治术后的肿瘤免疫治疗的制品中的应用。
89.本发明优选的技术方案中，所述肿瘤选自肺癌、乳腺癌、白血病、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、黑色素瘤、肾癌、膀胱癌、肝癌、淋巴瘤、恶性血液病、脑肿瘤、头颈癌、胶质瘤、胃癌、鼻咽癌、喉癌、宫颈癌、子宫体瘤、骨肉瘤、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、前列腺癌、子宫癌、肛区癌、睾丸癌、输卵管癌、子宫内膜癌、阴道癌、阴户癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、慢性或急性白血病、儿童实体瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(cns)肿瘤、原发性cns淋巴瘤、肿瘤血管发生、脊柱肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、表皮状癌、鳞状细胞癌、t细胞淋巴瘤、环境诱发的癌症的任一种或其组合。
90.本发明优选的技术方案中，所述肺癌选自小细胞肺癌、非小细胞肺癌的任一种或其并发症。
91.本发明优选的技术方案中，所述白血病选自急性淋巴性白血病、急性骨髓性白血病、b细胞慢性淋巴性白血病、慢性骨髓性白血病的任一种或其并发症。
92.本发明优选的技术方案中，所述急性骨髓性白血病选自急性粒细胞性白血病、急性早幼粒细胞白血病、急性粒单核细胞白血病、急性嗜碱性粒细胞白血病、急性嗜酸性粒细胞白血病、急性巨核细胞白血病、急性红白血病、急性全骨髓增生伴骨髓纤维化的任一种或其组合。
93.本发明的另一目的在于提供一种安全有效的同种异体免疫细胞或其组合物用于肿瘤免疫治疗的方法，将所述同种异体免疫细胞制成本发明的组合物后回输患者，其中，所述组合物由(1-10)
×
107个/ml的免疫细胞、0.5-2％的人血白蛋白和生理盐水组成，所述免疫细胞由第一同种异体免疫细胞和第二同种异体免疫细胞用生理盐水制成密度为(1-10)
×
107个/ml后，按照第一同种异体免疫细胞：第二同种异体免疫细胞的体积比为1:1-2配置而成，所述免疫细胞活率≥95％。
94.本发明的优选技术方案中，患者每次回输本发明的同种异体免疫细胞组合物50-100ml。
95.本发明的优选技术方案中，患者每次回输本发明的同种异体免疫细胞为(1-10)x109个。
96.本发明的优选技术方案中，综合考虑患者的病情、用药、年龄，患者每周回输免疫细胞1-4次。
97.本发明所述的“第一同种异体免疫细胞”和“第二同种异体免疫细胞”为了区分不同方法制备的免疫细胞而做的命名，二者并没有先后之分。
98.除非另有说明，本发明涉及液体与液体之间的百分比时，所述的百分比为体积/体积百分比；本发明涉及液体与固体之间的百分比时，所述百分比为体积/重量百分比；本发明涉及固体与液体之间的百分比时，所述百分比为重量/体积百分比；其余为重量/重量百分比。
99.与现有技术相比，本发明具有下述有益技术效果：
100.1、本发明利用肿瘤患者血浆和健康人pbmc在无血清培养基中共培养，制得的同种异体免疫细胞有效解决了异体免疫风暴，有效预防肿瘤复发，延长肿瘤复发周期，延长患者生存期，且有效避免放化疗导致的恶心、呕吐、脱发、失眠、血象降低、肝肾功能损害等不良反应，显著降低肿瘤疼痛，并具有扩增倍数高、细胞活率高、稳定性好、培养周期短、安全有效、成本更优等优点，显著提高肿瘤免疫细胞的靶向性和精准性及患者的生活质量。
101.2、本发明的制备方法具有操作简便、质量可控、绿色环保、适合工业化生产等优点。
具体实施方式
102.以下结合实施例对本发明做进一步的说明，但并不因此将本发明限制在所描述的实施例范围中。
103.具体实施方式中pbmc的制备：将抽取的健康人外周血50ml放入250ml离心管，再将其置于2500rpm*5min条件下离心，收集下层细胞层，等体积加入生理盐水或pbs缓冲液，混匀，将其置于2500rpm*5min条件下离心，收集细胞层，加入5倍细胞层体积的裂解液，裂解2min后，加入等量生理盐水或pbs缓冲液稀释，再将其置于2100rpm*5min条件下离心，即得。
104.具体实施方式中健康人血浆或肿瘤患者血浆的制备：将抽取的健康人或患者外周血50ml放入250ml离心管，将其置于2000rpm*5-10min条件下离心，收集血浆。
105.实施例1本发明第一同种异体免疫细胞的制备
106.第一同种异体免疫细胞的制备包括下述步骤：
107.(1)用1ml患者血浆浸润600ml培养瓶后，再将其置于37.0℃
±
1.0℃、7.5％
±
1.0％co2条件下放置2h，制备肿瘤患者血浆包被的培养瓶；
108.(2)在肿瘤患者血浆包被的培养瓶中加入健康人pbmc和gt551培养基400ml，将其制成密度为5
×
106个/ml的细胞培养液，再将其置于37.0℃
±
1.0℃、7.5％
±
1.0％co2条件下培养48h,制得细胞培养液，其中，所述gt551培养基中含有0.25％的细胞因子，所述细胞因子由il-2 300ug、il-15 150ug和il-21 150ug制成；
109.(3)将步骤(2)制得的细胞培养液均分成两份，将其分别置于原培养瓶和新培养瓶中，每瓶补充gt551培养基400ml，并按照培养体系中的gt551培养基与肿瘤患者血浆的体积比为150：1补充肿瘤患者血浆，再将其置于37.0℃
±
1.0℃、7.5％
±
1.0％co2条件下培养
192h-240h，每间隔24h，按照培养体系中的gt551培养基与肿瘤患者血浆的体积比为150：1间歇补充所需量的肿瘤患者血浆和gt551培养基，其中，所述gt551培养基中含有0.25％的细胞因子，所述细胞因子由il-2 300ug、il-15 150ug和il-21 150ug制成；
110.(5)当监测到培养液中的免疫细胞cd
3+
≥40％、cd
56+
≥60％时，将培养液在2000rpm*5min离心，收集细胞用250ml生理盐水洗涤，即得。
111.实施例2本发明第二同种异体免疫细胞的制备
112.第二同种异体免疫细胞的制备包括下述步骤：
113.(1)将收集pbmc用gt551培养基400ml制成密度为0.8
×
106个/ml的细胞液后，将其接种到包被有抗人cd3抗体的225cm2细胞培养瓶中，加入1ml健康人血浆，再将其置于37.0℃
±
1.0℃、7.5％
±
1.0％co2条件下培养48h，制得细胞培养液，其中，所述gt551培养基中含有0.25％的细胞因子，所述细胞因子由il-2 300ug、il-15 150ug和il-21 150ug制成；
114.(2)将步骤(1)制得的细胞培养液均分为两份，将其分别置于原培养瓶和新培养瓶中，每瓶补充gt551培养基400ml和1ml健康人血浆，再将其置于37.0℃
±
1.0℃、7.5％
±
1.0％co2条件下培养192h-240h，每间隔24h，按照培养体系中的gt551培养基与肿瘤患者血浆的体积比为150：1，间歇补充所需量的肿瘤患者血浆和gt551培养基，其中，所述gt551培养基中含有0.25％的细胞因子，所述细胞因子由il-2 300ug、il-15 150ug和il-21 150ug制成；
115.(3)当监测到培养液中的免疫细胞cd
3+
≥40％、cd
56+
≥60％时，将培养液在2000rpm*5min离心，收集细胞用250ml生理盐水洗涤，即得。
116.实施例3本发明免疫细胞组合物的制备
117.将实施例1的第一同种异体免疫细胞和实施例2的第二同种异体免疫细胞分别用含有1％人血白蛋白的注射用生理盐水制成密度为5
×
107个/ml，将其按照体积比为1:1混合，即得。
118.实施例4本发明免疫细胞组合物的制备
119.10例患者用其五代以内直系亲属的pbmc(健康人)，按照实施例1-3的方法制备其免疫细胞组合物，采用细胞计数板计数，并台盼蓝染色监测细胞活率，结果见表1。
120.表1
[0121][0122]
试验例1本发明免疫细胞组合物的免疫治疗活性考察
[0123]
患者(女)乳腺癌术后复发，回输实施例3的免疫细胞组合物100ml，每周回输一次，持续6个月后，患者的肿瘤痛明显缓解，癌胚抗原下降30％、糖类抗原125下降15％、糖类抗原153下降49％，左侧乳腺切除后原区域肿瘤大小由4x2cm缩小到1.4x0.6cm，患者的生活质量明显提高，生存期明显延长。
[0124]
以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明权利要求保护的范围。

技术特征：
1.一种安全有效的免疫细胞组合物，所述组合物由(1-10)
×
107个/ml的免疫细胞、0.5-2％的人血白蛋白和生理盐水组成，其中，所述免疫细胞由第一同种异体免疫细胞和第二同种异体免疫细胞用生理盐水制成密度为(1-10)
×
107个/ml后，按照第一同种异体免疫细胞：第二同种异体免疫细胞的体积比为1:1-2配置，所述免疫细胞活率≥95％。2.如权利要求1所述的组合物，所述组合物由(2-8)
×
107个/ml的免疫细胞、1-1.5％人血白蛋白浓度和注射用生理盐水组成，其中，免疫细胞活率≥98％。3.如权利要求1-2任一项所述的组合物，所述第一同种异体免疫细胞的制备包括下述步骤：(1)用肿瘤患者血浆浸润培养瓶后，再将其置于37.0℃
±
1.0℃、7.5％
±
1.0％co2条件下静置4h-5h，制得肿瘤患者血浆包被的培养瓶；(2)在肿瘤患者血浆包被的培养瓶中加入健康人pbmc和无血清培养基，将其制成密度为(1-5)
×
106个/ml的细胞培养液后，再将其置于37.0℃
±
1.0℃、7.5％
±
1.0％co2条件下培养24h-48h，其中，所述无血清培养基选自kbm 581、gt-t551 h3、x-vivo15、imsf100的任一种或其组合；(3)每间隔24-72h，按照培养体系中的无血清培养基与肿瘤患者血浆的体积比为100-200：1，向培养体系中间歇补充所需量的无血清培养基和肿瘤患者血浆，离心，收集cd
3+
≥40％、cd
56+
≥60％的免疫细胞，即得，其中，所述无血清培养基选自kbm 581、gt-t551h3、x-vivo15、imsf100的任一种或其组合。4.如权利要求1-3任一项所述的组合物，所述第二同种异体免疫细胞的制备包括下述步骤：(1)将健康人pbmc按照密度为(0.2-1.6)
×
106个/ml与淋巴细胞活化剂置于无血清培养基中，再将其置于37.0℃
±
1.0℃、7.5％
±
1.0％co2条件下培养24h-48h，其中，所述淋巴细胞活化剂选自抗人cd2抗体、抗人cd3抗体、抗人cd28抗体、植物血凝素(pha)的任一种或其组合或将其固化在载体上的含抗体载体，所述无血清培养基选自kbm 581、gt-t551 h3、x-vivo15、imsf100的任一种或其组合；(2)按照培养体系：健康人血浆的体积比为100-200：1，向培养体系中补充所需量的无血清培养基和健康人血浆，再将其置于37.0℃
±
1.0℃、7.5％
±
1.0％co2条件下培养24h-48h；(3)每间隔24h-72h，按照培养体系：肿瘤患者血浆的体积比为100-200：1，向培养体系中间歇补充所需量的无血清培养基和肿瘤患者血浆，再将其置于37.0℃
±
1.0℃、7.5％
±
1.0％co2条件下培养，离心，收集cd
3+
≥40％、cd
56+
≥60％的免疫细胞，即得。5.一种安全有效的免疫细胞组合物的制备方法，所述组合物由(1-10)
×
107个/ml的免疫细胞、0.5-2％的人血白蛋白和生理盐水组成，其中，所述免疫细胞由第一同种异体免疫细胞和第二同种异体免疫细胞用生理盐水制成密度为(1-10)
×
107个/ml后，按照第一同种异体免疫细胞：第二同种异体免疫细胞的体积比为1:1-2配置，所述免疫细胞活率≥95％，将所需量的第一同种异体免疫细胞和第二同种异体免疫细胞、人血白蛋白与生理盐水均匀混合，即得。6.如权利要求5所述的制备方法，所述第一同种异体免疫细胞的制备包括下述步骤：
(1)用肿瘤患者血浆浸润培养瓶后，再将其置于37.0℃
±
1.0℃、7.5％
±
1.0％co2条件下静置4h-5h，制得肿瘤患者血浆包被的培养瓶；(2)在肿瘤患者血浆包被的培养瓶中加入健康人pbmc和无血清培养基，将其制成密度为(1-5)
×
106个/ml的细胞培养液后，再将其置于37.0℃
±
1.0℃、7.5％
±
1.0％co2条件下培养24h-48h，其中，所述无血清培养基选自kbm 581、gt-t551 h3、x-vivo15、imsf100的任一种或其组合；(3)每间隔24-72h，按照培养体系中的无血清培养基与肿瘤患者血浆的体积比为100-200：1，向培养体系中间歇补充所需量的无血清培养基和肿瘤患者血浆，离心，收集cd
3+
≥40％、cd
56+
≥60％的免疫细胞，即得，其中，所述无血清培养基选自kbm 581、gt-t551h3、x-vivo15、imsf100的任一种或其组合。7.如权利要求5-6任一项所述的制备方法，所述第二同种异体免疫细胞的制备包括下述步骤：(1)将健康人pbmc按照密度为(0.2-1.6)
×
106个/ml与淋巴细胞活化剂置于无血清培养基中，再将其置于37.0℃
±
1.0℃、7.5％
±
1.0％co2条件下培养24h-48h，其中，所述淋巴细胞活化剂选自抗人cd2抗体、抗人cd3抗体、抗人cd28抗体、植物血凝素(pha)的任一种或其组合或将其固化在载体上的含抗体载体，所述无血清培养基选自kbm 581、gt-t551 h3、x-vivo15、imsf100的任一种或其组合；(2)按照培养体系：健康人血浆的体积比为100-200：1，向培养体系中补充所需量的无血清培养基和健康人血浆，再将其置于37.0℃
±
1.0℃、7.5％
±
1.0％co2条件下培养24h-48h；(3)每间隔24h-72h，按照培养体系：肿瘤患者血浆的体积比为100-200：1，向培养体系中间歇补充所需量的无血清培养基和肿瘤患者血浆，再将其置于37.0℃
±
1.0℃、7.5％
±
1.0％co2条件下培养，离心，收集cd
3+
≥40％、cd
56+
≥60％的免疫细胞，制得第二同种异体免疫细胞。8.一种安全有效的同种异体免疫细胞，所述免疫细胞由第一同种异体免疫细胞和第二同种异体免疫细胞用生理盐水制成密度为(1-10)
×
107个/ml后，按照第一同种异体免疫细胞：第二同种异体免疫细胞的体积比为1:1-2配置而成，所述免疫细胞活率≥95％，其中，所述第一同种异体免疫细胞的制备包括下述步骤：(1)用肿瘤患者血浆浸润培养瓶后，再将其置于37.0℃
±
1.0℃、7.5％
±
1.0％co2条件下静置4h-5h，制得肿瘤患者血浆包被的培养瓶；(2)在肿瘤患者血浆包被的培养瓶中加入健康人pbmc和无血清培养基，将其制成密度为(1-5)
×
106个/ml的细胞培养液后，再将其置于37.0℃
±
1.0℃、7.5％
±
1.0％co2条件下培养24h-48h，其中，所述无血清培养基选自kbm 581、gt-t551 h3、x-vivo15、imsf100的任一种或其组合；(3)每间隔24-72h，按照培养体系中的无血清培养基与肿瘤患者血浆的体积比为100-200：1，向培养体系中间歇补充所需量的无血清培养基和肿瘤患者血浆，离心，收集cd
3+
≥40％、cd
56+
≥60％的免疫细胞，即得，其中，所述无血清培养基选自kbm 581、gt-t551h3、x-vivo15、imsf100的任一种或其组合；所述第二同种异体免疫细胞的制备包括下述步骤：
(1)将健康人pbmc按照密度为(0.2-1.6)
×
106个/ml与淋巴细胞活化剂置于无血清培养基中，再将其置于37.0℃
±
1.0℃、7.5％
±
1.0％co2条件下培养24h-48h，其中，所述淋巴细胞活化剂选自抗人cd2抗体、抗人cd3抗体、抗人cd28抗体、植物血凝素(pha)的任一种或其组合或将其固化在载体上的含抗体载体，所述无血清培养基选自kbm 581、gt-t551 h3、x-vivo15、imsf100的任一种或其组合；(2)按照培养体系：健康人血浆的体积比为100-200：1，向培养体系中补充所需量的无血清培养基和健康人血浆，再将其置于37.0℃
±
1.0℃、7.5％
±
1.0％co2条件下培养24h-48h；(3)每间隔24h-72h，按照培养体系：肿瘤患者血浆的体积比为100-200：1，向培养体系中间歇补充所需量的无血清培养基和肿瘤患者血浆，再将其置于37.0℃
±
1.0℃、7.5％
±
1.0％co2条件下培养，离心，收集cd
3+
≥40％、cd
56+
≥60％的免疫细胞，即得。9.一种安全有效的同种异体免疫细胞的制备方法，所述免疫细胞由第一同种异体免疫细胞和第二同种异体免疫细胞用生理盐水制成密度为(1-10)
×
107个/ml后，按照第一同种异体免疫细胞：第二同种异体免疫细胞的体积比为1:1-2配置而成，所述免疫细胞活率≥95％，将所需量的第一同种异体免疫细胞和第二同种异体免疫细胞、人血白蛋白与生理盐水均匀混合，即得，其中，所述第一同种异体免疫细胞的制备包括下述步骤：(1)用肿瘤患者血浆浸润培养瓶后，再将其置于37.0℃
±
1.0℃、7.5％
±
1.0％co2条件下静置4h-5h，制得肿瘤患者血浆包被的培养瓶；(2)在肿瘤患者血浆包被的培养瓶中加入健康人pbmc和无血清培养基，将其制成密度为(1-5)
×
106个/ml的细胞培养液后，再将其置于37.0℃
±
1.0℃、7.5％
±
1.0％co2条件下培养24h-48h，其中，所述无血清培养基选自kbm 581、gt-t551 h3、x-vivo15、imsf100的任一种或其组合；(3)每间隔24-72h，按照培养体系中的无血清培养基与肿瘤患者血浆的体积比为100-200：1，向培养体系中间歇补充所需量的无血清培养基和肿瘤患者血浆，离心，收集cd
3+
≥40％、cd
56+
≥60％的免疫细胞，制得第一同种异体免疫细胞，其中，所述无血清培养基选自kbm 581、gt-t551 h3、x-vivo15、imsf100的任一种或其组合；所述第二同种异体免疫细胞的制备包括下述步骤：(1)将健康人pbmc按照密度为(0.2-1.6)
×
106个/ml与淋巴细胞活化剂置于无血清培养基中，再将其置于37.0℃
±
1.0℃、7.5％
±
1.0％co2条件下培养24h-48h，其中，所述淋巴细胞活化剂选自抗人cd2抗体、抗人cd3抗体、抗人cd28抗体、植物血凝素(pha)的任一种或其组合或将其固化在载体上的含抗体载体，所述无血清培养基选自kbm 581、gt-t551 h3、x-vivo15、imsf100的任一种或其组合；(2)按照培养体系：健康人血浆的体积比为100-200：1，向培养体系中补充所需量的无血清培养基和健康人血浆，再将其置于37.0℃
±
1.0℃、7.5％
±
1.0％co2条件下培养24h-48h；(3)每间隔24h-72h，按照培养体系：肿瘤患者血浆的体积比为100-200：1，向培养体系中间歇补充所需量的无血清培养基和肿瘤患者血浆，再将其置于37.0℃
±
1.0℃、7.5％
±
1.0％co2条件下培养，离心，收集cd
3+
≥40％、cd
56+
≥60％的免疫细胞，即得。10.如权利要求1-4任一项所述的安全有效的免疫细胞组合物或如权利要求8所述的安全有效的同种异体免疫细胞用于制备肿瘤免疫治疗或肿瘤根治术后的肿瘤免疫治疗的制品中的应用。

技术总结
本发明涉及一种安全有效的免疫细胞组合物，所述组合物由(1-10)


技术研发人员：王宇 高文勇 陈琳 李建军 王利
受保护的技术使用者：北京达尔文细胞生物科技有限公司
技术研发日：2023.04.02
技术公布日：2023/7/7