一种丝素蛋白检测用电化学免疫传感器电极的制备方法

1.本发明涉及蛋白检测传感器领域，尤其涉及一种丝素蛋白检测用电化学免疫传感器电极的制备方法。


背景技术：

2.丝织品文物的主要成分为除去丝胶后的丝素蛋白，但因时间、外界环境多方面影响降解老化，丝素蛋白的含量较低，文物作为不可再生文化遗产，检测取用量消耗量有限，传统的傅里叶红外光法和拉曼光谱法易受杂质干扰影响判断，x射线衍射技术则需多次测量保证实验可靠性且单次用量较大，电化学免疫传感器在文物检测方向可以发挥重大作用。
3.电化学免疫传感器的常用材料主要使用贵金属纳米颗粒如金纳米颗粒(aunps)等形成金硫键而负载抗体，电极选用玻碳电极、金电极等。目前这些免疫传感器体系较为成熟但材料选用范围较小，成本较大，且体系在电化学测试表现中电流响应较小；根据研究，具备纳米材料、生物相容性较高、能够负载抗体特性的材料都有成为免疫传感器材料的潜力，我们的工作方向即打开视野，结合电化学其他方向，选用具有上述特性的材料制备一种新型体系的免疫传感器并在某些方面超越传统材料。


技术实现要素：

4.为了解决上述技术问题，本发明提供了一种丝素蛋白检测用电化学免疫传感器电极的制备方法。本发明以蚕丝蛋白作为碳源，在经过特殊的热处理工艺后获得孔隙率高、比表面积大且具有完整伪石墨层结构的含氮碳材料；本发明使六水合硝酸钴直接在碳材料的位点上合成出比表面积大、维度小的纳米四氧化三钴，其与含氮多孔伪石墨层结构碳材料复合后作为复合活性材料可在弥补四氧化三钴膨胀衰减、易脱落和碳材料电容量小的缺点。本发明将复合活性材料与泡沫镍结合作为电极运用在免疫传感器中，泡沫镍孔隙结构与内部流通性不仅利于负载更多活性材料与抗体，更利于活性物质与待测物质充分接触，使电信号更有效传至基底。本发明方法制得的电极材料具有电流密度大、高灵敏、成本低、无污染性与危险性、良好的稳定性且修饰过程简单，尤其适合用于检测丝素蛋白、丝织品文物。
5.本发明的具体技术方案为：一种丝素蛋白检测用电化学免疫传感器电极的制备方法，包括以下步骤：
6.步骤1：对天然蚕丝清洗烘干，浸泡在饱和kcl溶液中活化，取出洗净干燥后进行热处理石墨化，具体为以室温为起点，在空气中以5-8℃/min升至280-320℃，保温1.5-2.5h，通入氮气并以2-5℃/min升至850-950℃，保温1.5-2h，冷却，将所得产物粉碎，得到含氮多孔伪石墨层结构碳材料。
7.本发明步骤1的原理为：选择含丰富氮元素的蚕丝蛋白作为制备含氮多孔伪石墨层结构碳材料的碳源。本发明在研究中进一步发现，在不同高温热处理工艺下蚕丝蛋白石
墨化后会得到不同成分及不同微观结构的碳材料。为此，本发明专门设计了一套热处理石墨化工艺，可获得本发明想要的含氮多孔伪石墨层结构碳材料。
8.具体地：在通常情况下，蚕丝蛋白需要在2800℃下才会生成本发明想要的高度发达的石墨堆叠结构，但是此结构下结晶度下降且相应缺陷增大。而本发明发现，先kcl溶液对蚕丝蛋白进行预处理，在升温时会对碳进行刻蚀而变成蜂窝状结构产生介孔，增加活性位点并提高导电性，同时预处理后蚕丝蛋白会更早(900℃左右)出现类石墨结构并且结晶性更好。紧接着，本发明先在空气中升温至300℃左右，会发生轻度生物质材料的失水、石墨化与灰化，去除部分杂质的同时可获得丰富多孔结构的半石墨化材料。然后继续通入氮气升温至900℃左右，其中在350℃左右时逐渐由β折叠结构变为共轭sp2杂化碳六角结构，最终得到伪石墨晶体层结构。并且本发明发现，此阶段较慢的升温速率可使材料结晶度升高，缺陷减少。
9.综上，本发明通过对天然蚕丝进行预处理、以及分阶段控制热处理升温速率、温度和保温时间等参数可以获得孔隙率高、比表面积大且具有完整伪石墨层结构的碳材料，该材料中还具有一定的氮元素与碳原子形成c-n键能够增强材料的导电性。
10.步骤2：将十六烷基三甲基溴化铵(ctab)与六水合硝酸钴[co(no3)2·
6h2o]混合，加入无水乙醇和去离子水，搅拌至溶解。
[0011]
步骤3：将步骤2所得溶液与步骤1所得含氮多孔伪石墨层结构碳材料混合后进行水热反应，将所得产物用无水乙醇抽滤后真空干燥，得到复合活性材料。
[0012]
ctab作为表面活性剂使得六水合硝酸钴在去离子水、无水乙醇溶液中直接在碳材料的位点上合成四氧化三钴，水热反应对材料的均匀性和结晶性有很大提升，不同的水浴温度影响四氧化三钴的形貌。本发明通过控制温度制备出比表面积大、维度小的纳米四氧化三钴，并且将其与含氮多孔伪石墨层结构碳材料复合后作为复合活性材料可在一定程度上弥补了四氧化三钴在做电极材料时的膨胀衰减、易脱落和碳材料电容量小的缺点。
[0013]
步骤4：将步骤3所得复合活性材料与导电剂和粘结剂混合，加入有机溶剂进行研磨，将所得研磨产物均匀涂敷至剪碎的泡沫镍表面，真空干燥后得到复合电极。
[0014]
粘结剂用于将复合活性材料固定在泡沫镍上防止或减少脱落，导电剂可进一步增加导电性；生物质碳材料具有双电层电容特性，四氧化三钴具有赝电容特性，因此本发明复合活性材料可以取长补短。
[0015]
本发明将复合活性材料与泡沫镍结合后作为免疫传感器的电极，泡沫镍孔隙结构与内部流通性不仅利于负载更多复合活性材料与抗体，更利于活性物质与待测物质充分接触，使电信号更有效传至基底。
[0016]
步骤5：取牛血清蛋白(bsa)加至pbs缓冲液得到稀释液，再与抗体混合得到丝素蛋白单克隆抗体稀释液。
[0017]
步骤6：将丝素蛋白单克隆抗体稀释液滴在复合电极表面，孵育后得到丝素蛋白检测用电化学免疫传感器电极。
[0018]
本发明由蚕丝蛋白高温处理获得的碳材料表面具有羧基，可以与抗体中的氨基形成氢键形成强吸附作用，从而负载抗体且非化学键不影响材料的导电性能，同时也可通过活化其表面羧基与氨基结合形成化学键更牢固地负载抗体。
[0019]
作为优选，步骤1中：选用无水乙醇清洗蚕丝20-40min，活化温度为50-70℃下活化
时间为4-8h。
[0020]
作为优选，步骤2和步骤3中：十六烷基三甲基溴化铵、六水合硝酸钴、无水乙醇、去离子水和含氮多孔伪石墨层结构碳材料的用量比为0.02-0.03g:0.05-0.07g:25-35ml:4-6ml:0.1g；搅拌时间为5-15min。
[0021]
作为优选，步骤3中：水热反应温度为170-190℃，保温时间为80-100min，反应结束后自然冷却。
[0022]
作为优选，步骤3中：真空干燥温度为20-30℃。
[0023]
作为优选，步骤3中：导电剂为导电炭黑，粘结剂为聚偏氟乙烯，有机溶剂为n-甲基吡咯烷酮。
[0024]
作为优选，步骤4中：复合活性材料与导电剂、聚偏氟乙烯的质量比为8:0.8-1.2:0.8-1.2。
[0025]
作为优选，步骤4中：研磨时间不少于30min；真空干燥温度为70-90℃。
[0026]
作为优选，步骤5中：牛血清蛋白与pbs缓冲液的重量比为1；80-120；丝素蛋白单克隆抗体稀释液中的浓度为1.3-1.4mg/ml；丝素蛋白单克隆抗体稀释液中的浓度为1.3-1.4mg/ml。
[0027]
作为优选，步骤6中：孵育温度为35-40℃，时间0.5-1.5h。
[0028]
与现有技术相比，本发明具有以下技术效果：
[0029]
(1)本发明以蚕丝蛋白作为碳源，在经过特殊的热处理工艺后，可以获得孔隙率高、比表面积大且具有完整伪石墨层结构的碳材料，且该材料中还含有氮元素与碳原子形成c-n键能够增强材料的导电性。
[0030]
(2)本发明通过控制温度使六水合硝酸钴直接在碳材料的位点上合成出比表面积大、维度小的纳米四氧化三钴，并且其与含氮多孔伪石墨层结构碳材料复合后作为复合活性材料可在一定程度上弥补了四氧化三钴在做电极材料时的膨胀衰减、易脱落和碳材料电容量小的缺点。
[0031]
(3)本发明将复合活性材料与泡沫镍结合作为电极运用在免疫传感器中，泡沫镍孔隙结构与内部流通性不仅利于负载更多活性材料与抗体，更利于活性物质与待测物质充分接触，使电信号更有效传至基底。
[0032]
(4)本发明制备出的电极在循环伏安测试与差伏脉冲中同电位下电流超越其他生物传感器。
[0033]
(5)本发明所用材料生物相容性高，绿色环保且制备流程简单，无危险。
附图说明
[0034]
图1为实施例1中所得c/co3o4的sem图；
[0035]
图2为实施例1中所得c和c/co3o4的拉曼图谱；
[0036]
图3为实施例2中ni与复合电极在50mv/s扫速下的循环伏安曲线；
[0037]
图4为实施例2中裸泡沫镍、负载材料后、负载抗体后在电压窗口为0.1v-0.4v的差伏脉冲测试图；
[0038]
图5为对比例1中制备的产物sem图；
[0039]
图6为对比例2中300℃热处理所制备的材料的xrd图。
具体实施方式
[0040]
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
[0041]
实施例1
[0042]
步骤一：将天然蚕丝和泡沫镍用无水乙醇超声清洗30min，放入真空干燥箱中干燥，泡沫镍备用，蚕丝浸泡在饱和kcl溶液置于60℃恒温烘箱6h对前驱体进行活化，将活化后的蚕丝用去离子水多次冲洗并烘干，放入瓷舟中移入马弗炉，从室温20℃开始，每分钟上升6℃至300℃，保温2h，后通入氮气以5℃/min的速率升至900℃，保温2h，随炉冷却下来，将瓷舟中石墨化完成的物品放至研钵中进行研磨、称量并保存。
[0043]
步骤二：取6mm(0.06g)的六水合硝酸钴[co(no3)2·
6h2o]与2mm(0.0258g)的十六烷基三甲基溴化铵(ctab)混合，加入30ml无水乙醇再用移液枪加入5ml去离子水，在水浴锅上搅拌至固体完全溶解。
[0044]
步骤三：将上述步骤二中的溶液移入聚四氟乙烯内胆的水热反应釜并加入步骤一得到的碳材料0.1g，烘箱设置温度180℃，保温90min，移出反应釜后待其自然冷却再打开，将所得产物使用无水乙醇进行抽滤，再移入真空干燥箱，关闭气孔后打开泵再开启真空阀，设置温度为25℃，时间12h。最终获得复合活性材料。
[0045]
对实施例1制备的复合活性材料使用扫描电镜对进行形貌表征，如图1，证明经活化与石墨化，碳材料的活性结合位点与介孔增多，比表面积大、纳米级别的层片状四氧化三钴被成功制备且复合在碳材料的表面；拉曼对材料进行成分表征，如图2，特征吸收峰的对比证明了复合活性材料的制备成功。
[0046]
实施例2
[0047]
步骤一：裸泡沫镍为0.07g，取实施例1中的复合活性材料0.008g，取聚偏氟乙烯(pvdf)0.001g，导电炭黑0.001g加入玛瑙研钵，分批次少量加入n-甲基吡咯烷酮(nmp)溶解，持续30min使混合物变成油状，然后利用玻璃棒多次涂敷在泡沫镍直至完成。
[0048]
步骤二：将步骤一涂敷好的泡沫镍移入真空干燥箱，调节温度为80℃，时间12h，称量成品0.072g，即负载活性材料1.6mg。
[0049]
步骤三：取0.2g氯化钾，0.27g磷酸二氢钾，8g氯化钠和1.42g磷酸氢二钠混合后加入去离子水制备磷酸盐缓冲液(pbs)并调节溶液的ph7.4。
[0050]
步骤四：在漩涡混合器中按重量比1:100将牛血清蛋白与pbs缓冲液混合；再添加丝素蛋白单克隆抗体直至丝素蛋白单克隆抗体的浓度为1.36mg/ml。步骤五：取10ul的单克隆抗体稀释液滴在步骤二所得复合电极表面并在37℃烘箱中孵育1h。
[0051]
对实施例2制备完成的电极进行电化学测试。验证自组装过程。图3为电位窗口为-0.2v-0.6v，扫速50mv/s时裸泡沫镍，负载材料后的循环伏安曲线，证明了材料的成功负载并发挥作用；图4为裸泡沫镍、负载材料后、负载抗体后在电压窗口为0.1v-0.4v的差伏脉冲测试，负载材料增强了电极的导电能力，在引入抗体和bsa后由于对材料孔隙与表面的影响降低了导电能力，证明抗体成功被负载到电极上、组装的成功。
[0052]
对比例1(与实施例1的区别在于步骤二中六水合硝酸钴用量不同)
[0053]
步骤一：将天然蚕丝和泡沫镍用无水乙醇超声清洗30min，放入真空干燥箱中干燥，泡沫镍备用，蚕丝浸泡在饱和kcl溶液置于60℃恒温烘箱6h对前驱体进行活化，将活化后的蚕丝用去离子水多次冲洗并烘干，放入瓷舟中移入马弗炉，从室温20℃开始，每分钟上
升6℃至300℃，保温2h，后通入氮气以5℃/min的速率升至900℃，保温2h，随炉冷却下来，将瓷舟中石墨化完成的物品放至研钵中进行研磨、称量并保存。
[0054]
步骤二：取9mm(0.09g)的六水合硝酸钴[co(no3)2·
6h2o]与2mm(0.0258g)的十六烷基三甲基溴化铵(ctab)混合，加入30ml无水乙醇再用移液枪加入5ml去离子水，在水浴锅上搅拌至固体完全溶解。
[0055]
步骤三：将上述步骤二中的溶液移入聚四氟乙烯内胆的水热反应釜并加入步骤一得到的碳材料0.1g，烘箱设置温度180℃，保温90min，移出反应釜后待其自然冷却再打开，将所得产物使用无水乙醇进行抽滤，再移入真空干燥箱，关闭气孔后打开泵再开启真空阀，设置温度为25℃，时间12h。
[0056]
对产物进行sem表征观察形貌，如图5所示，在只改变六水合硝酸钴[co(no3)2·
6h2o]加入浓度的情况下四氧化三钴同为层片状结构，但材料的比较面积与对材料扩散的增幅相比于实施例1是处于劣势的。
[0057]
对比例2(与实施例1的区别在于石墨化工艺不同)
[0058]
步骤一：将天然蚕丝和泡沫镍用无水乙醇超声清洗30min，放入真空干燥箱中干燥，泡沫镍备用，蚕丝浸泡在饱和kcl溶液置于60℃恒温烘箱6h进行活化，将活化后的蚕丝用去离子水多次冲洗并烘干，放入瓷舟中移入马弗炉，从室温20℃开始，每分钟上升6℃至300℃，保温2h，随炉冷却下来，将瓷舟中热处理完成的物品放至研钵中进行研磨、称量并保存。
[0059]
步骤二：取6mm(0.06g)的六水合硝酸钴[co(no3)2·
6h2o]与2mm(0.0258g)的十六烷基三甲基溴化铵(ctab)混合，加入30ml无水乙醇再用移液枪加入5ml去离子水，在水浴锅上搅拌至固体完全溶解。
[0060]
步骤三：将上述步骤二中的溶液移入聚四氟乙烯内胆的水热反应釜并加入步骤一得到的碳材料0.1g，烘箱设置温度180℃，保温90min，移出反应釜后待其自然冷却再打开，将所得产物使用无水乙醇进行抽滤，再移入真空干燥箱，关闭气孔后打开泵再开启真空阀，设置温度为25℃，时间12h。
[0061]
对产物进行xrd表征观察结晶度，如图6所示，在只改变石墨化温度、保温温度为300℃的情况下，材料的结晶度并不是很好，背底很高并且有杂峰的存在，说明300℃下无法获得结晶度高的石墨化结构。
[0062]
对比例3(与实施例2的区别在于复合活性材料、粘结剂、导电剂比例不同)
[0063]
步骤一：裸泡沫镍为0.07g，取实施例1中的活性材料0.008g，取聚偏氟乙烯(pvdf)0.002g，导电炭黑0.001g加入玛瑙研钵，分批次少量加入n-甲基吡咯烷酮(nmp)溶解，持续30min使混合物变成油状，然后利用玻璃棒多次涂敷在泡沫镍直至完成。
[0064]
步骤二：将步骤一涂敷好的泡沫镍移入真空干燥箱，调节温度为80℃，时间12h，称量成品0.0714g，即负载活性材料约1.1mg。
[0065]
步骤三：取0.1g氯化钾，0.135g磷酸二氢钾，4g氯化钠和0.72g磷酸氢二钠混合后加入去离子水制备磷酸盐缓冲液(pbs)并调节溶液的ph7.4。
[0066]
步骤四：在漩涡混合器中按重量比1:100将牛血清蛋白与pbs缓冲液混合；再添加丝素蛋白单克隆抗体直至丝素蛋白单克隆抗体的浓度为1.36mg/ml。。
[0067]
步骤五：取10ul的单克隆抗体稀释液滴在步骤二所得电极表面并在37℃烘箱中孵
育1h。
[0068]
结果发现，粘结剂较多时会影响材料的导电性与扩散速率。
[0069]
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
[0070]
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。

技术特征：
1.一种丝素蛋白检测用电化学免疫传感器电极的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤1：对天然蚕丝清洗烘干，浸泡在饱和kcl溶液中活化，取出洗净干燥后进行热处理石墨化，具体为以室温为起点，在空气中以5-8℃/min升至280-320℃，保温1.5-2.5h，通入氮气并以2-5℃/min升至850-950℃，保温1.5-2h，冷却，将所得产物粉碎，得到含氮多孔伪石墨层结构碳材料；步骤2：将十六烷基三甲基溴化铵与六水合硝酸钴混合，加入无水乙醇和去离子水，搅拌至溶解；步骤3：将步骤2所得溶液与步骤1所得含氮多孔伪石墨层结构碳材料混合后进行水热反应，将所得产物用无水乙醇抽滤后真空干燥，得到复合活性材料；步骤4：将步骤3所得复合活性材料与导电剂和粘结剂混合，加入有机溶剂进行研磨，将所得研磨产物均匀涂敷至剪碎的泡沫镍表面，真空干燥后得到复合电极；步骤5：取牛血清蛋白按1：100的比例加至pbs缓冲液得到稀释液，再与抗体混合得到丝素蛋白单克隆抗体稀释液；步骤6：将丝素蛋白单克隆抗体稀释液滴在复合电极表面，孵育后得到丝素蛋白检测用电化学免疫传感器电极。2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤1中：选用无水乙醇清洗蚕丝20-40min，活化温度为50-70℃下活化时间为4-8h。3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤2和步骤3中：十六烷基三甲基溴化铵、六水合硝酸钴、无水乙醇、去离子水和含氮多孔伪石墨层结构碳材料的用量比为0.02-0.03g:0.05-0.07g:25-35ml:4-6ml:0.1g；搅拌时间为5-15min。4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤3中：水热反应温度为170-190℃，保温时间为80-100min，反应结束后自然冷却。5.如权利要求1或4所述的制备方法，其特征在于：步骤3中：真空干燥温度为20-30℃。6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤3中：导电剂为导电炭黑，粘结剂为聚偏氟乙烯，有机溶剂为n-甲基吡咯烷酮。7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于：步骤4中：复合活性材料与导电剂、聚偏氟乙烯的质量比为8:0.8-1.2:0.8-1.2。8.如权利要求1或6或7所述的制备方法，其特征在于：步骤4中：研磨时间不少于30min；真空干燥温度为70-90℃。9.如权利要求1或6或7所述的制备方法，其特征在于：步骤5中：牛血清蛋白与pbs缓冲液的重量比为1；80-120；丝素蛋白单克隆抗体稀释液中的浓度为1.3-1.4mg/ml。10.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤6中：孵育温度为35-40℃，时间0.5-1.5h。

技术总结
本发明涉及蛋白检测传感器领域，本发明公开了一种丝素蛋白检测用电化学免疫传感器电极的制备方法。本发明对蚕丝蛋白经热处理后获得石墨层结构含氮碳材料；使六水合硝酸钴直接在碳材料位点上合成出纳米四氧化三钴；将复合活性材料与泡沫镍结合作为电极运用在免疫传感器中，泡沫镍孔隙结构与内部流通性不仅利于负载更多活性材料与抗体，更利于活性物质与待测物质充分接触，使电信号更有效传至基底。本发明方法制得的电极材料具有电流密度大、高灵敏、成本低、无污染性与危险性、良好的稳定性且修饰过程简单，尤其适合用于检测丝素蛋白、丝织品文物。织品文物。


技术研发人员：吕连鹏 王秉 李佳乐
受保护的技术使用者：浙江理工大学
技术研发日：2023.03.28
技术公布日：2023/7/7